PCR使用PCR使用phusion Hot Start DNA聚合酶（NEB，M0535S）产生了包含单个HigeOC1 CTCF结合位点51（TCAGAGTGGCGGCGGCGGGGCGCCCTTGCCCAGA）的DNA片段51（TCAGAGTGGCGGCGCGGGGGGGCGCCCTTGCCCAGA）使用Gibson Assembly52前进或反向补体方向。然后使用限制酶SPEI（新英格兰Biolabs，R3133S）线性化构建体，并如前所述44。

　　我们准备了两个31.8 kb长度的构建体，其中包含一个CTCF位点，从一端不对称地放置了〜9.7 kb，这可以根据CTCF的结合位置来区分DNA构建体的方向。一种构造的定向，使得CTCF的N末端指向DNA的较长端（质粒121；用于N末端接触），并且另一个构造的基序方向反转（质粒128；用于C末端接触）。使用质粒64、66、67、69、118和71生成质粒121（有关中间矢量和使用的完整列表，请参见补充表1）。使用质粒64、66、124、69、118和71生成质粒128（补充表1）。使用BSAI-HFV2作为2型限制酶（NEB，E1602），使用金门克隆构建质粒121和128。使用Gibson组装和传统（基于限制酶的）克隆技术（补充表1）（NEB，E2621 Gibson Mix; NEB，NEB，M0515 Q5 Q5 Polymerase），使用Gibson组装和传统（基于限制酶的）克隆技术（E2621 Q5 Q5 Polymerase）生成了中间载体（64、66、67、124、69、118和71）。

　　含生物素的手柄是通过PCR反应与引物JT337（Biotin-Gaccgagagataggggggggggtgtg，iDT）和JT338（Biotin-cagggggggggggaaCaggagaggagagc，idt）在质粒上质粒18 pbluescript sk+（Stratagene），使用Gotaq 2（Promeaq 2（promega promegagagaga，M75）上的质粒。这导致了1,238 bp PCR片段，使用Promega Wizard SV凝胶和PCR清理系统（Promega，A9282）清理。使用QIAFILTER质粒MIDI试剂盒纯化新鲜质粒121和128（Qiagen，12243）。纯化后，用XHOI和NOTI-HF切割质粒，并用Xhoi或Noti-HF切割生物素手柄。将消化产物与线性化质粒上的生物素手柄过多的约10×摩尔混合在一起。使用T4 DNA连接酶（NEB，M0202L）在16°C过夜进行连接，并在65°C的第二天早晨进行热灭活20分钟。使用äkta纯系统清理了生成的31.8 kb DNA构建体，其中一个自制凝胶滤光柱，其中包含TE+150 mm NaCl2中的大约46 mL Sephacryl S-1000 S-1000 SF凝胶过滤培养基（Cytiva）。样品以0.2 mL min -1的速度运行，并收集0.5 mL的馏分。

　　如前所述48，合成了1.5 kb长度的磁性旋转实验的DNA构建体。

　　先前描述了带有N末端标志和光晕标签的人NIPBL，以及一个C端10×他的标签作为串联构建体，并在PLIB中在PLIB中具有未标记的人Mau2。先前描述了6×His-Halo-Ecorie11111和6×His-Tet-Halo的6×HIS-TETR-HALO先前描述了44。通过使用Gibson组装组合人类CTCF ORF和Halo-Tag ORF，将10×His-CTCF-HALO-FLAG插入PLIB中。在用于光晕ORF扩增的反向引物中，引入了C末端标志标记序列作为5'悬垂。为了产生10×His-CTCF-HALO-AVI-FLAG，将10×His-CTCF-HALO-FLAG矢量主链放大了晕tag序列的末端，使用Gibson组件引入了AVI-TAG。

　　dsDNA fragments (100 bp) containing WT or scrambled versions of the HighOc1 CTCF-binding site51 (WT, TCAGAGTGGCGGCCAGCAGGGGGCGCCCTTGCCAGA) were prepared by overlap-extension PCR: two ssDNA oligos with partially overlapping sequences were used in a PCR reaction catalysed by Phusion Hot Start DNA Polymerase（NEB，M0535S）并使用Purelink PCR纯化试剂盒（Invitrogen，K3110002）进行纯化。随后将总共1 pmol的DsDNA探针与0.5 µL [γ-32p] ATP（3,000 CI MMOL-1，10 MCI ML-1； HARTMANN ANALINATIT，SCP-301）和T4多核苷酸激酶（NEB，M0201S）在20 µL反应中的377°C中孵育。随后通过将反应在65°C孵育10分钟，将T4多核苷酸激酶进行热灭活。

　　根据制造商的方案，使用M.SSSSI CpG甲基转移酶（NEB，M0226S）在体外甲基化了上述51中描述的HighoC1 CTCF结合位点的100 bp dsDNA片段。为了提高甲基化效率，使用Pureelink PCR纯化试剂盒（Invitrogen，K3110002）进行了四轮甲基化，然后进行DNA纯化。通过将300 ng纯化的甲基化DNA与1 µL甲基化敏感限制酶EAE（NEB，R0508S）在20μL反应中孵育300 ng纯化的甲基化DNA进行评估。使用Biorad Chemidoc成像系统检测到在0.8％琼脂糖凝胶上通过电泳在0.8％琼脂糖凝胶上解析反应产物。在图1B中用作未标记的甲基化竞争者的最终dsDNA片段以约80％的效率甲基化。

　　如先前所述，Hela Kyoto细胞（RRID：CVCL_1922）是Narumiya的礼物3。通过STR指纹识别HeLa Kyoto细胞，并对支原体污染进行了阴性测试。CTCF-HALO-FLAG HELA KYOTO细胞系是通过使用CRISPR CAS9（D10A）配对Nickase53的同源指导修复生成的。一个包括CTCF同源臂的供体质粒（在编码序列停止位点的任一侧为719 bp和459 bp）和卤-Flag被克隆到质粒PJET1.2中。使用在线工具（https://crispr.mit.edu; grna1：caccgcgcagcagcatgatggaccggtga; grna2：cacccgggatcatctcgggcggcggcggcggtg）使用CAS9指南RNA序列鉴定。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，11668019），用供体Cas9镍酶质粒转染HeLa Kyoto细胞。然后，7天后，将细胞用Halotag TMR配体（Promega，g8251）标记，并通过流式细胞仪进行排序（补充图2）。通过PCR扩增基因组DNA，通过显微镜进行免疫印迹和检查，选择了克隆细胞系，选择了纯合晕片插入纯合晕圈插入。

　　如先前所述，生成了SF9昆虫细胞（Thermo Fisher Scientific）中蛋白质表达的杆状病毒。54。感染后，将表达培养物在27°C下孵育48-60小时。将细胞离心，在PBS中洗涤，冷冻在液氮中，并储存在-80°C下。

　　Baculovirus-infected cell pellets from cultures supplemented with 0.1 mM ZnCl2 were lysed by Dounce homogenization and resuspended in CTCF lysis buffer (35 mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7.4, 350 mM NaCl, 0.1 mM ZnCl2, 5% glycerol, 0.05% Tween-20 and 5 mM imidazole) supplemented with1 mM PMSF，无EDTA完整片剂（每50毫升1）（Roche，11873580001），1 mM DTT和0.001 U µL-1苯并酶。通过在4°C下以18,000克离心1小时来清除裂解液。The soluble fraction was incubated with NiNTA agarose (Qiagen, 30230) for 1 h at 4 °C and washed with CTCF buffer (35 mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 mM ZnCl2, 5% glycerol) supplemented with 1 mM DTT and 35 mM imidazole.对于最后的洗涤步骤，从洗涤缓冲液中省略了DTT。用补充300 mM咪唑的CTCF缓冲液洗脱蛋白质。随后使用Sartorius vivaspin 50 kDa Mwco浓缩剂（Sartorius，VS2031）将洗脱株浓缩大约两倍，并与抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich，A2220）在4°C下孵育90分钟。将树脂用CTCF缓冲液洗涤，并在室温下与Halotag TMR配体（Promega，G8252）或Halotag Alexa660配体（Promega，G8472）一起孵育15分钟。用CTCF缓冲液进行了大量洗涤后，将标记的蛋白质洗脱在补充了0.5 mg ML -1 3×FLAG肽的CTCF缓冲液中。使用Sartorius vivaspin 50 kDa Mwco浓缩剂，闪光灯燃料并储存在-80°C下，用1 mM DTT补充了1 mM DTT，浓缩了两到四倍。

　　如SCC1 – HALO – FLAG9所述纯化HELA CTCF – HALA -FLAG蛋白，除了20 mM Tris pH 7.5以外，在所有CTCF纯化缓冲液中均使用20 mM Tris pH 7.5，而不是25 mM NAH2PO4/NA2PO4/NA2HPO4 pH 7.5，除了0.1 mm ZnCl2和0.1 mm Zncl2均包含在所有纯化bufferefiperers Buffer bufferef infutival flafification Buffer中。HELA CTCF用JF646-HALOTAG配体标记。如前所述制备JF646-HALOTAG配体9。

　　如先前所述，纯化了重组粘着素，HELA SCC1 -HALO -FLAG粘着素和重组NIPBL -MAU2。如先前所述44，纯化了Ecori（E111Q） - HALO和TERT -HALO。

　　For the competition EMSA assay, 60 fmol of recombinant CTCF was mixed with 1 µg poly(dI-dC) (Thermo Fisher Scientific, 20148E) in a 20 µl reaction containing 35 mM Tris pH 7.9, 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM ZnCl2, 5% glycerol, 1 mM DTT and50 ng µl -1 BSA在室温下持续20分钟。随后，在100倍未定位的竞争者（DI-DI-DC; WT; wt; wt;炒或甲基化的CTCF Oligo）的情况下添加了21 fmol的[γ-32P] ATP标签（Hartmann Analytic，SCP-501）DsDNA探针，并在室温下均以10分钟的培养反应。将结合反应加载到prerun上（1小时，100 V，10 MA，冰冷的水浴，0.5×TBE运行缓冲液）4％非换性丙烯酰胺凝胶，并在与PRERUN相同的条件下将样品分离1小时。将凝胶暴露于一夜之间的储存磷光屏幕上，并使用台风扫描仪（GE Healthcare）进行分析。显示的图像代表了两个独立实验。

　　如前所述，将流动细胞与Avidin DN（载体实验室，A3100）和DNA孵育，除了使用含有单个Highoc1 CTCF结合位点的PPLAT代替λ-DNA。用400 µL WB缓冲液（20 mM Tris pH 7.5、50 mM KCl，5 mM EDTA）洗涤，并补充有0.1 mg ML -1 BSA和10 nm Sytox green（Thermo Fisher Scientific，S7020）或Sytox Orange（Thermo Fisher Scientific，S11368），在50 µ分钟-1。总共100 µl重组CTCF – HALO（在图1所示的实验中标记了TMR，并在扩展数据中图1A – C，F，G，J和2;或在扩展数据中用Alexa 660标记的Alexa 660在图1d，e中显示的Alexa 660。100 mM KCl，5 mM MGCL2，5％甘油，0.005％Tween-20，0.1 mg ml-1 BSA，1 mM TCEP，1 mM TCEP）在30 µl min-1下，随后在没有缓冲流量的情况下孵育4分钟。然后用CL150缓冲液（补充50 mM KCl的CL100缓冲液）以50 µl min-1的速率洗涤流动细胞，以去除非特异性结合的CTCF分子。

　　为了确定图像采集后DNA分子的取向，将TMR标记为ECORI（E111Q） - HALO或TERT -HALO分别以2 nm或5 nm的终浓度流入流动细胞中，在ECORI缓冲液中（20 mm Tris pH 7.5，150 mm kcl，0.1 mm kcl，0.1 mg mg mg mg mg ml syms inm ph）30 µl min -1，孵育4分钟，并用200 µL ECORI缓冲液洗涤。

　　在室温下进行了所有重组CTCF单分子成像表征和粘蛋白扩散测定实验。除非另有说明，否则使用Zeiss Tirf 3 Axio观察者设置和488 nm，561 nm和639 nm Lasers44以4 s的间隔获取延时显微镜图像。原始酸/原始培训酶-3,4-二加氧酶/trolox氧气清道夫系统（终浓度10 nm prodocatechute-3,4-二氧酶，2.5 mM protocatechuic and protocatechuic and trocatecation酸和2 mm trolox）;已添加到数据采集期间使用的所有缓冲区。

　　为了成像CTCF与DNA关联的动力学（图1C，D和扩展数据图1A），将0.5 nm TMR标记的CTCF-HALO引入30 µl min-1的CL100缓冲液中的流动细胞中。对于图1D和扩展数据所示的实验图1A，以3.12 s的间隔获取图像。为了测量DNA上的CTCF停留时间（图1C和扩展数据图1F，G）图像以10.15 s的间隔获取。

　　在斐济分析了重组CTCF在DNA上的位置。ECORI或TERT介导的端标被用来明确分配束缚在表面的DNA链的方向。测量了标记DNA端的荧光强度信号和蛋白质荧光信号之间的距离，并计算出测得的距离与DNA分子的总长度之间的比率为沿BP中DNA的位置。使用自定义的Fiji Macro Kymoanalysis_2.1.ijm进行CTCF位置的单分子跟踪。

　　使用自定义的Fiji Macro Kymoanalysis_2.1.ijm进行CTCF位置的单分子跟踪。沿DNA分子的空间位置与单个分子的时间的空间位置通过将微米中的位置乘以每毫米的平均碱基对数来转换为碱基对，也就是说，其中的因子（26,123 bp）/r，其中r表示含有DNA分子的端到26,123,123 bp。计算单个轨迹的MSD，并将形式的MSD（τ）=Dτ+O的线性回归应用于前十个时间点（对应于31.2 s的最大时间滞后）。在这里，d表示扩散系数，τ是时间滞后，O是校正有限定位不确定性的偏移。对于回归，不考虑较大的时间滞后，以通过达到DNA末端来排除MSD曲线的人工平坦。

　　为了量化与CTCF DNA结合位点结合的重组Alexa 660（A660）的CTCF分子的数量，在DNA上鉴定了A660信号，在激光 - 折式校正的图像中，从局部背景中减去了十个框架，并在扩展数据中绘制了十个框架。

　　To control for fluorophore bleaching in the CTCF in vitro residence-time experiments, the dwell time of ‘on-DNA’ CTCF–HaloTMR molecules (n = 140) and ‘on-glass’ CTCF–HaloTMR–Avi–biotin molecules (n = 142) (the latter coupled to the biotin-PEGylated glass surface through Avidin DN) was determined通过成像这些分子在同一微流流细胞中的群体。然后，我们将荧光寿命分布的回归对玻璃体种群的指数功能进行了回归，以计算光漂白的半衰期，该半衰期被确定为T1/2_ON玻璃= 77.3分钟。最好通过两指数衰减拟合的“ DNA”数据集，其固定百分比的事件（140个中的97个，69％）显示出快速解开，这归因于非特异性DNA结合事件，该事件基于其沿DNA分子的位置。这导致了T1/2_fast_on-DNA的停留时间= 1.2分钟，T1/2_SLOW_ON-DNA = 29.2分钟，对应于非特异性和CTCF特定于位点特异性的DNA结合事件。

　　单个指数或两指数或三个指数拟合中，其中一个组件固定在T1/2_ON玻璃中都不适合描述观察到的数据。基于此和发现，T1/2_SLOW_ON-DNA 〜2.7倍〜2.7×远离T1/2_on-glass（分别为29.2分钟和77.3分钟），我们得出的结论是，CTCF ON-DNA的外部DNA的速率显着更快，因此比浮游率和conter tereor conter non conter time conter time conter time conter time conter time conter dy de werter with wreaster dy werter with dy de with dy with with dy with with dy with with with dy with dy d.

　　流动细胞44与1 mg ml -1 avidin DN（载体实验室）孵育15分钟，并用DNA缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，0.25 mg Ml -1 bsa）进行广泛洗涤。在含有20 nm Sytox Orange（Thermo Fisher Scientific，s11368）中，在DNA缓冲液中以50 µL min -1的含量在50 µL min -1的DNA缓冲液中以50 µL min -1的最终浓度在50 µl min -1的最终浓度下将150 µL的31.8 kb DNA和生物素化末端和生物素化末端引入流动细胞中。用400 µl洗涤缓冲液2（50 mm Tris pH 7.5、50 mM NaCl，2.5 mM MgCl2，0.25 mg Ml-1 BSA，0.05％Tween-20，20 nm Sytox Orange）在100 µl min-1，随后是100 µl的成像pH 2.50 mm ph，50 mm ph，50 nmmmMMMMMMMM，0.25 mg mL-1 BSA，0.05％Tween-20，0.2 mg ml-1葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，G2133），35 mg Ml-1催化酶（Sigma-Aldrich，sigma-Aldrich，c-40，c-40），9 mg ml-1 b--- g------- g----葡萄糖，2 mMMMMMMMMMMMANT，CAYMAN ATEP，CAYMAN ATEP，CAYMAN ATP ATP（Jena Biosciences，Nu-1010-Sol））在100 µl min-1时补充了20 nm Sytox橙色。如先前所述，制备了葡萄糖氧化酶（20 mg ML -1），过氧化氢酶（3.5 mg mL -1）和葡萄糖（450 mg ml -1）的储备溶液。然后将JF646标记的HELA CTCF以0.5 nm的最终浓度在100 µL成像缓冲液中以30 µL min-1的含量为20 nm Sytox Orange引入流量室中。通过补充100 µL min-1的100 µL成像缓冲液洗涤3次，用100 µL成像缓冲液洗涤3次，以100 µL Sytox Orange洗涤3次去除非特异性结合的CTCF。

　　在37°C下进行所有HELA CTCF单分子表征和环排序实验。使用配备561 nm和639 nm激光器，两个PCO Edge 4.2 SCMOS摄像机和A×63/1.46 Na Alpha Plan-Plan Plan-Plan-Plan-Plan-Plan-Plan-Apochromat油目标的Zeiss Elyra 7获得延时显微镜图像。在HILO模式下以0.4 s的间隔依次获取每个通道的曝光时间为100 ms的图像。

　　为了量化与CTCF DNA结合位点结合的HELA JF646标记的CTCF分子的数量，在激光型校正图像中鉴定了DNA上的JF646信号，从局部背景中减去，并在所有框架上进行了平均，并在一片闪烁事件中进行了平均，并在一个广泛的事件中绘制，并在扩展数据中绘制。每个分子的漂白步骤的数量是手动确定的，并在扩展数据图3E上指示。在单个步骤中漂白的CTCF DNA结合位点结合的分子的荧光强度为2.2±0.6（平均值±S.D.）。

　　如“ DNA环大小的确定和单分子的位置”部分中所述分析了HELA CTCF在DNA上的位置（补充说明）。

　　基本上如前所述进行粘蛋白扩散测定44。如上所述的“重组CTCF单分子成像表征”中所述，将CTCF引入2 nm最终浓度的流动细胞中，并孵育4分钟。然后用CL150*缓冲液（35 mM Tris pH 7.5、75 mm NaCl，75 mM KCl，1 mM MGCL2、10％甘油，0.003％Tween-20和0.1 mg ML-1 BSA）洗涤流动细胞。Cohesin and NIPBL–MAU2 were introduced into flow cells at 0.8–2 nM and 2 nM, respectively, in 100 µl of CL100* buffer (35 mM Tris, pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10% glycerol, 0.003% Tween-20 and 0.1 mg ml−1 BSA) at 30 µl min−1.将流细胞再孵育4分钟，无需缓冲流，然后用CL250*缓冲液洗涤（35 mm Tris pH 7.5，125 mm NaCl，125 mM KCl，1 mM MGCL2，10％甘油，0.003％Tween-20-20-20-20和0.1 mg Ml-1 bsa）。然后在没有缓冲液流动的情况下以每个框架间隔4 s进行160 s进行粘蛋白和CTCF成像。对于3-5个视野，重复了图像采集。通过在上面的“重组CTCF单分子成像表征”部分中所述，通过在Sytox Green和Ecori（E111Q）–HALO或TERT-HALO中流动来确定DNA取向。生物素偶联的量子点QD705（Invitrogen，Q101163MP）或CTCF – Halo – Avi-Biotin用作基准标记。

　　使用自定义写入的Fiji Macro Movemt_Analsis_Macro_kymo_kymo_10c_3ch.ijm，将CTCF –粘连通道与Tetr/ecori（E111Q）–DNA通道对齐。手动检查每个含有扩散粘着素的DNA分子，以存在位于CTCF结合位点的区域的单个CTCF信号。分析中排除了包含多个或非特异性结合CTCF分子的DNA分子。确定了在选定的DNA分子上的扩散粘着素焦点的数量，并将含有四个以上移动粘着素灶的DNA分子排除在分析之外。然后分析DNA上的粘着蛋白行为，并分类如下。（1）粘蛋白扩散被阻塞：（i）粘蛋白沿DNA自由扩散并到达CTCF障碍，反弹，但在成像时没有越过障碍；（ii）粘蛋白沿DNA自由扩散，到达CTCF并固定；（iii）两个或多个被CTCF阻断的粘着素分子。（2）粘着蛋白向一个方向传递CTCF：粘蛋白在成像过程中通过CTCF，并扩散回CTCF，但不会回到另一侧。（3）粘蛋白多次通过CTCF。

　　分析也排除了具有以下事件的DNA：（1）与CTCF共扩散或共定位。（2）粘蛋白未能遇到CTCF。（3）被高荧光强度CTCF信号（大概是多聚体）阻塞的粘着蛋白。（4）图像采集期间的粘蛋白或CTCF漂白。

　　基本上如前所述进行了垂直流动环 - 结构测定基本上进行的9,55。将流动细胞与1 mg ml -1抗原蛋白DN（载体实验室）孵育15分钟，并用DNA缓冲液（20 mM Tris pH 7.5，150 mm NaCl，0.25 mg ml -1 bsa（Thermo Fisher Scientific，AM2616））进行广泛洗涤。在含有20 nm Sytox Orange（Thermo Fisher Scientific，s11368）中，将含有单个CTCF位点的40 µL和含有生物素化末端的31.8 kb DNA在DNA缓冲液中以15 µl min -1的含量在15 µl min -1的最终浓度下以15 µl min -1的含量在15 µl min -1的最终浓度中引入流动细胞中。用20 µL洗涤缓冲液1（50 mM Tris pH 7.5，200 mM NaCl，1 mM MGCL2，5％甘油，1 mM DTT，0.25 mg Ml -1 BSA，20 nm Sytox Orange）在5 µl min -1时洗涤流动细胞。然后将流动切换到垂直模式，并在100 µl min -1处引入另外350 µL的洗涤缓冲液1。总共将400 µL洗涤缓冲液2（50 mM Tris pH 7.5，50 mM NaCl，2.5 mM MGCL2，0.25 mg Ml-1 BSA，0.05％Tween-20，20 nm Sytox Orange引入，然后在100 µl min-1中引入100 µl min-1，然后是100 µl Min-1，随后是100 µL的MMM MM Triis ph 7.5 MM，50 mm triS ph。MgCl2, 0.25 mg ml−1 BSA, 0.05% Tween-20, 0.2 mg ml−1 glucose oxidase (Sigma-Aldrich, G2133), 35 mg ml−1 catalase (Sigma-Aldrich, C-40), 9 mg ml−1 b--glucose, 2 mM trolox (Cayman Chemical, 10011659)) and5 mM ATP（Jena Biosciences，NU-1010-SOL），在100 µl min-1时补充了20 nm Sytox Orange。然后将JF646标记的CTCF以0.5 nm的最终浓度在100 µL成像缓冲液中以30 µl min-1的含量为20 nm Sytox Orange引入流量室中。通过补充100 µL min-1的100 µL成像缓冲液洗涤3次，用100 µL成像缓冲液洗涤3次，以100 µL Sytox Orange洗涤3次去除非特异性结合的CTCF。然后在250 µL成像缓冲液中分别将HELA粘着蛋白和重组NIPBL – MAU2分别引入0.5 nm和3.54 nm的流动室中，并在30 µl min -1下补充了220 nm Sytox Orange。

　　为了在没有缓冲液流动的情况下进行循环排骨测定，将流动细胞与Avidin DN孵育，并如上所述用DNA缓冲液洗涤。在15–25 µl min -1中引入DNA以改变DNA张力。然后将流动池洗涤并像上述一样孵育，而不切换到垂直模式。

　　选择CRRNA序列在DNA长度的三分之一约三分之一，在两端，使用两个序列进行有效结合DCAS9-GRNA复合物，每DNA。如果位于相同的末端，则将CRRNA序列隔开至少2 kb，以使每个DNA端的两个DCAS9 – GRNA复合物的偶尔结合歧视（除了漂白曲线）。使用CRISPOR（http://crispor.tefor.net/crispor.py; pam以粗体表示）选择结合序列：seq7932，actggactgcgcgaccggggcaggggg;SEQ11802，CGCGGTGGGCAGACGTGGCGG;SEQ18967，CTGGTTATGCAGGTCGTAGGTGGG;和SEQ21005，GGCATACAATATTCCATGAAGG。

　　通过退火将通用的67-mer Alt-R CRISPR – CAS9 ATTO to550标记的tracrrna和CRRNA（IDT）的混合物与在95°C下的结合位点匹配2.5分钟，并在5°C的5°C下缓慢冷却2.5分钟。要将grna与DCAS9相对，将200 nm DCAS9（NEB，NEBM0652T）与2 µM GRNA混合在Nebuffer3.1的冰上，在37°C下孵育10分钟，然后再次放在冰上。

　　为了结合DCAS9 – GRNA复合物与DNA，使用与CTCF实验相似的端到端长度和力状态的DNA构建体以相似的端到端长度和力状态来促进测量。DNA结合到聚乙二醇化的玻璃表面，并用100 µL成像缓冲液洗涤未结合的DNA。然后，将1 nm DCAS9 – GRNA冲入流动池中并孵育5分钟。通过补充1 mg ML-1肝素的100 µL成像缓冲液冲洗，除去非特异性结合的DCAS9-GRNA。用100 µL成像缓冲液洗涤肝素。这通常每DNA留下一到两个DCAS9 -GRNA复合物。然后按照上述30 pm的粘蛋白和75 pm nipbl – MaU2进行环路排序实验。通过用25 nm Sytox绿色染色并用488 nm激光染色来可视化DNA。GRNA-ATTO550在使用×60的油性浸泡，1.49 Na CFI Apo Tirf（Nikon）物镜的情况下，通过561 nm激光光激发了561 nm激光。使用连续成像和每个框架的暴露时间收集发射量BSI SCMOS摄像机上的发射。

　　基本上按照先前描述的48进行了较小的修改，对磁性旋转器仪器和实验进行了基本进行。该仪器由一对垂直排列（相距1毫米）的永久性新近铁磁铁（Webcraft）组成，这些磁铁被用于生成磁场56。将磁铁对放置在电动阶段（翻译：Physik仪器，M-126.pd2；旋转：Physik Instrumente，C-150.PD），并允许红色LED（λ= 630 nm）的光通过磁铁对缝隙以照亮样品。通过×50的油性物镜（CFI计划50xH，Achromat; Na = 0.9，Nikon）收集传输，并使用50 Hz的四兆像素CMOS摄像机（Falcon，4M60; Teledyne Dalsa）记录了珠衍射模式。使用基于LabView 2011（国家仪器）控制软件进行了描述和发布的所有三个维度，在所有三个维度上的磁珠运动的实时跟踪均进行了57,58。表面粘附的1.5 µM聚苯乙烯参考珠（Polysciences）用作纠正测量过程中发生的仪器漂移的参考。总共可以在一个视野中同时跟踪100-200个珠子，对于1.5 kb-l-kb-long dsdna tethers48，空间分辨率约为2 nm。

　　如前所述制备流动池和DNA绑扎。48。简而言之，将参考珠在PBS缓冲液（pH 7.4； Sigma-Aldrich）中稀释1：1,500，然后粘附在流动池的盖玻璃表面上（〜5分钟）。通过用PBS洗涤去除非粘附珠后，将绵羊地氧化氨酸抗体抗体（Roche）浓度为0.1 mg ml-1在流动池中孵育1 h，在用PBS洗涤500 µl后，用PBS洗涤500 µl，并用10 mg ml-1 BSA（New End nembland bso buffer）孵育2 h，buffer buffers ph 7. 4. 4.4.44。用500 µL PBS缓冲液洗涤后，将1.5 kb线性DSDNA构建体的1 pm在PBS缓冲液中在流动池中孵育20分钟。再次用500 µL PBS缓冲液洗涤后，添加了直径为1 µm的链霉亲和蛋白涂层的超帕磁珠（Dynabeads Myone，Lifetechnologies； Lifetechnologies； 1：400稀释1：400），从而增加了珠子在表面旋转的DSDNA构建体上的附着在5分钟左右的5分钟后将珠子固定在表面螺旋体上。随后用PBS将未结合的珠子洗净。

　　在粘蛋白回路 - 排干实验之前，通过施加零和高力（8 pn）的组合来评估束缚dsDNA构建体的质量，并在高力下的每个方向上旋转30个旋转。仅使用具有单一结合的dsDNA和正确的DNA端到端长度的系数用于随后的单分子实验。After washing the flow cell with cohesin reaction buffer (40 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.25 mg ml−1 BSA, 0.05% Tween-20), 0.1 nM cohesin and 0.25 nM NIPBL–MAU2 were introduced in cohesin buffer supplemented with 2 mM ATP to stretched dsDNA tethers在高力（8 pn）。对于力量互动实验（扩展数据图7），在单个实验中将力降低至1、0.8、0.6、0.4、0.3、0.2和0.1 pn，并维持10分钟。在室温下进行所有磁性旋转实验。

　　The Z-bead position over time was extracted using custom-written scripts in IGOR Pro (v.6.37, Wavemetrics), as previously described48,59 and a custom-written automated step detection algorithm (MATLAB, MathWorks) was applied to the individual traces as described previously48,60 to extract individual loop-extrusion step sizes.在相同条件下从不同轨迹和实验中测量的步骤大小进行合并并转换为碱基对48，以构建力依赖力的粘着蛋白阶跃大小的分布（扩展数据图7C，d）。

　　模拟了10 kb的DNA，假定CTCF从一端定位为7 kb。沿DNA长度均匀地采样了粘着蛋白结合位点。对于每个力值，从经验获得的分布中取样台阶尺寸，如通过磁性旋转实验测量的分布。对于每个力值和粘蛋白在CTCF的50 bp之内的每个力值和事件，将模拟重复500次，将其计算为相遇，这构成了粘蛋白和CTCF之间相互作用距离的保守阈值。

　　使用GraphPad Prism（V.9.4.1）或Python（v.3.7.7）使用Scipy（V.1.5.2）61，Numpy（V.1.21.6），Trackpy（V.0.4.2）62和StatsModels（V.0.12.2）进行统计分析。没有使用统计方法来确定样本量。实验不是随机的，研究人员没有对分配视而不见。使用Adobe Illustrator 27.2组装数字。所有实验至少进行了两次，结果一致。图1A，B和扩展数据图所示的实验。1H，I和3A，F进行了两次，结果一致。图2所示的实验的重复数量。1G，H，2E，G和3C – E和扩展数据图。相应的图例中列出了5b，g，h，7c，9a，b，g – l和10。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。