除非另有说明，否则使用原代抗体以稀释为1：1,000进行蛋白质印迹分析。抗STAT1（D1K9Y，14994），抗STAT2（D9J7L，72604），Anti-Stat3（Rabbit，79d7，4904; Mouse，124H6，9139），抗STAT4，抗STAT4（C46B10，2653），抗STAT5（C46B10，2653），Anti-Stat5（D22O6Y，94205）5397），抗JAK1（6G4，3344），抗JAK2（D2E12，3230），抗JAK3（D7B12，8863），anti-Tyk2（E9H4T，35615），抗tyk2（e9h4t，35615），抗p65（d14e12，8242，8242），anti-cd80（e6e12，8242）（e64280（e6）抗CD86（E5W6H，19589），抗IL-6Rα（E7H4J，39837），抗GP130（3732）（3732），抗PSTAT1（58D6，9167），抗PSTAT3（抗PSTAT3），抗PSTAT3（D3A7，9145），Anti-PSTAT6（D43A7，9145）（D437，9145）（D437E7）（D8S9Y，56554），抗PJAK1（D7N4Z，74129），抗PJAK2（C80C3，3776），抗PJAK3（D44EE3，5031），抗PPP65（抗PPP65）（抗PPP65）（93H1，3033）和抗β-肌动蛋白（4966）（49667）。抗JAK2（C-10，SC-390539），抗GMRβ（F-12，SC-393281）和抗β-actin（C4，SC-477778）来自Santa Cruz Biotechnology。抗PTYK2（PA5-37762）来自Invitrogen。HRP马抗小鼠IgG抗体（PI-2000，1：5,000）和HRP山羊抗兔IgG（PI-1000，1：5,000）来自矢量实验室。

　　对于体内实验，抗小鼠CD8（克隆YTS 169.4，BE0117），抗小鼠PD-L1（克隆10F.9G2，BE0101）和抗IGG2B（克隆LTF-2，BE0090）来自Bioxcell。SD-36和SD-2301在我们的实验室设计和合成。FLLL32（JAK2抑制剂X，5301530001）和STAT5抑制剂（573108）购自Sigma-Aldrich。表达SHRNA靶向STAT3（TRCN0000071453，TRCN0000301946）的质粒，STAT1（TRCN0000054924），JAK2（TRCN0000023649，TRCN0000023651，TRCN0000023651，TRCN0000023652）和GMRRE来自Sigma-Aldrich。

　　Jawsii，293T，B16F10，CT26，EMT6，LLC和4T1细胞购自美国型培养物收藏（ATCC）。MC38小鼠结肠癌细胞系是从德克萨斯大学西南医学中心（Y.-X. FU）获得的。先前报道了卵巢癌细胞系荧光素酶-ID8细胞24。所有细胞系均已通过肌瘤支原体检测试剂盒测试了支原体污染，并确认对支原体为阴性。

　　用包装质粒和非靶向慢病毒载体或慢跑病毒载体编码SHRNA靶向STAT3，STAT1，JAK2或GMRβ，将293T细胞转染。转染后48小时收集含病毒的上清液。使用慢跑病毒转染JAWSII细胞。然后通过免疫印迹分析细胞裂解物。

　　从小鼠的股骨和胫骨中收集骨髓。使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。用GM-CSF（20 ng ml-1）和IMDM中（ISCOVE修改后的Dulbecco培养基； Gibco，12440-053）补充了10％FBS，1％penstropticcin，用GM-CSF（20 ng mL-1）和FLT3配体（100 ng ml-1）生成骨髓衍生的DC（BMDC）（100 ng ml-1）。β-马er乙醇7-10天。使用FACSARIA流式细胞仪分类器（BD Biosciences）将BMDC作为CDC1（CD1C+XCR1+）排序，或使用Biotin抗小鼠XCR1抗体（Biolegend，148212）和抗生物素Microbeads（Miltenyiiiiibiotec，For Miltenyi Biotec，13000-090-45）进行纯化或纯化实验。通过mycoalert支原体检测试剂盒测试了原代细胞培养物不含支原体。

　　从STAT3+/+和STAT3 - / - CDC1s收集培养基，并以8,000克离心5分钟。GM-CSF（MGM00）和IL-6（DY406）在使用ELISA试剂盒的培养上清液中检测到。

　　用抗CD8（YTS 169.4，bioxcell）抗体耗尽CD8+ T细胞。在接种肿瘤开始时，对腹膜内注射抗CD8（每只小鼠100μg）抗体，并每三天连续给药。

　　DCS和LLC肿瘤细胞用1μMSD-36处理12小时。然后，将DCS和LLC（每个106）在4°C下以1,500 rpm离心5分钟，并用冰冷的PBS洗涤3次。将颗粒重悬于100μL的50％（v/v）水/甲醇溶液中，并经过3个冻结周期。在最后的解冻周期之后，将这些样品以14,000 rpm，4°C离心20分钟，并收集上清液。所有样品均已提交给密歇根大学的药代动力学核心（密歇根大学）进行分析。

　　将细胞在免疫沉淀裂解缓冲液中裂解（50 mM Tris-HCl pH 7.4、120 mM NaCl，1 mM EDTA和0.5％NP-40），并补充了停止的蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific）。细胞反复通过超声处理的21号针针。然后将1,000 µg的总细胞裂解物与适当的抗体（2 µg）孵育，在4°C下旋转过夜，然后与蛋白A/G sepharose珠（Santa Cruz Cruz Biotechnology）孵育3小时。用洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、100 mM NaCl，1 mM EDTA和0.2％NP-40）洗涤免疫复合物3次；然后，通过添加样品缓冲液（Bio-Rad）将免疫沉淀的蛋白变性并煮沸10分钟，通过SDS-PAGE解决，并用指定的抗体进行免疫印迹。

　　将细胞裂解在补充停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific）的RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中。通过BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）确定细胞裂解物的蛋白质浓度。通过SDS -PAGE分离等效量的总细胞蛋白，转移到聚偏二氟化物膜上，并用指定的抗体进行免疫印迹。

　　对于磷酸化抗体阵列cdc1，用LPS（20 ng ml-1）处理3小时，并裂解以提取蛋白质。根据制造商的说明，使用蛋白质组探测器磷酸激酶阵列试剂盒（R＆D Systems，Number ARY003C）分析裂解物。通过Image Lab 6.1（Bio-Rad）和ImageJ 1.51N（NIH）处理蛋白质印迹数据并分析。

　　为了进行组织学分析，收集组织样品，固定在10％福尔马林（Sigma）中，并处理福尔马林固定的石蜡包裹的组织分析。四微米石蜡切片进行了热诱导的表位检索。使用自动免疫稳定器（BioCare Intellipath，BioCare Medical）使用抗小鼠CD31抗体（细胞信号技术，D8V9E，77699，1：100）进行染色。将切片用血久毒素（生物保健医学）对染色，并用Aperio AT2扫描仪（Leica Biosystems Imaging）扫描载玻片。用Qupath V0.5.1进行定量。

　　通过柱纯化（Rneasy Micro Kit，Qiagen）通过DNase处理从细胞中分离总RNA。使用带有随机六聚体引物的恢复第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。使用Fast Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 3实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上使用Fast Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在cDNA上进行定量PCR。使用特定引物对基因表达进行定量（扩展数据表3）。使用ACTB作为内源对照，用ΔΔCT方法计算信使RNA表达的倍数变化。结果表示为倍数变化，将其归一化为对照。

　　在方案1中概述了SD-2301的合成（补充图1）。它从已知的化合物1开始，该化合物通过两步过程将其转换为化合物2。首先，将化合物1与七-6-羟基酸反应形成酰胺，然后在水性培养基中使用lioH皂化，以产生酸中间2，总产量为65％。使用先前报道的方法从市售胺5中以80％的收率合成叠氮化物6。与抗坏血酸钠和CUSO4之间的炔烃2和叠氮化物6之间的单击反应，导致酸中间3分，产量为78％。通过两步手术从BOC - 谷氨酰胺制备胺7。最初，在HATU（HATU（六氟磷酸苯甲酸苯甲酸苯甲酸苯二苯二甲基四甲基）的存在下，BOC-谷氨酰胺与取代的苄基胺偶联，而在DMF（N，N-二甲基甲基）中以4-二甲基甲基氨基胺为the Boccoctectect的二甲基四甲基）和DIPEA（N，N，n-二异甲基甲基胺）（n）DCM中的HCl在两个步骤中以70％的收益率提供70％的胺。在DMF中HATU和DIPEA存在下，酸3与胺7的偶联产生了受BOC保护的中间体。然后，使用二恶烷中的4（n）HCl对该中间体进行BOC占主导地位，以在两个步骤上产生胺中间体4分之4。最后，使用DMF中的HOBT和DIPEA，通过与文献中已知的中间体8的酰胺形成反应，将化合物4转化为86％的SD-2301。

　　SD-2301的纯度通过超表现液相色谱（UPLC）确认> 99％。C64H80N13O15PS2 [M+2H]+/2，UPLC -MS（ESI）M/z：计算为683.7；发现，684.09（补充图2）。质子核磁共振（1H-NMR）和碳核磁共振（13C-NMR）光谱在Bruker Advance 400 NMR光谱仪上进行，并且相对于内标（补充图3和4），据报道，据报道，据报道，据报道，化学位移的分数为“百万”（PPM）。

　　动物研究得到了密歇根大学的机构动物护理和使用委员会的批准。在12小时的黑暗中，所有小鼠均保持在没有特定的无病原体外壳（约22°C，湿度约40％）下：12小时的光周期。这项研究使用了以下小鼠（6-8周龄）（杰克逊实验室）：C57BL/6J，BALB/CJ，点点scID-SCIDIL2RγNULL（NSG），RAG1TM1MOM（RAG1 - / - - - / - ），C57BL/6-TG/6-TG（TCRATCRB）（TCRATCRB）1100mjb/j（tcratcrb）（tcratcrb）（tcratcrb）（B6.129S（C）-BATF3TM1KMM/J（BATF3 - / - ），B6.129S（CG）（CG）-STAT1TM1DLV/J（Stat1 - / - ），B6（129S4）（129S4）-XCR1TM1.1（CRE）KMM/J（CRE）KMM/J（CRE）KMM/J（CRE）B6.129S1-STAT3TM1XYFU/J（STAT3FL/FL）小鼠和CD-1小鼠是从Charles River Laboratories获得的。STAT5B - / - C57BL/6J小鼠来自美国国立卫生研究院（Warren Leonard）。将STAT3FL/FL小鼠与XCR1CRE小鼠交叉，以在DC1（Stat3 - / - 小鼠）中获得特定的STAT3缺陷。当内部生成特定的小鼠菌株时，在对照组中使用内立着同窝。

　　将MC38（2×106），CT26（105），EMT6（105），B16F10（2×105）和LLC（2×105）细胞皮下皮下注射到合元小鼠中。将表达荧光素酶的ID8细胞（2×106）注射到雌性小鼠的腹膜腔中。将表达荧光素酶的4T1细胞（105）注入雌性小鼠乳腺脂肪垫中。从第5-7天开始，每3天静脉内服用SD-36（低剂量：10 mg kg-1；高剂量：100 mg kg-1）或SD-2301（5 mg kg-1）。在4T1肿瘤转移模型中，用SD-36（20 mg kg-1）处理的第14天，随后每3天开始使用SD-36（20 mg kg-1）。在某些情况下，用SD-36（20 mg kg-1）或SD-2301（5 mg kg-1）类似地处理含腹膜肿瘤的小鼠，或用FLLL32（30 mg kg-kg-1）腹膜内注射24小时。对于ICB实验，PD-L1单克隆抗体或同种型抗体（Bioxcell，200μg）被腹膜内腹膜内延伸到含肿瘤的小鼠中，然后从第3天开始，然后每3天重复一次这种治疗方法。对于DC1输血实验，对骨髓来源的CDC1（2×106）进行分类，并在第-2天和第8天静脉注射到含有肿瘤的BATF3 - / - 小鼠中。SD-36（20 mg kg-1）静脉内每三天静脉内使用TUMOR intakor intaime。性别和来源匹配的小鼠。使用带有游标量表的卡尺测量肿瘤大小，并计算为前面的46。

　　为了评估耐受性和毒性，每3天静脉注射含有肿瘤的C57BL/6J小鼠SD-2301（5 mg kg-1），持续18天，整个体重。

　　对于药代动力学评估，将雌性CD-1小鼠以5 mg kg-1的静脉静脉剂量为单一的SD-2301，将PCP的25％作为剂量载体。然后，从5分钟到24小时收集250-300μl的血液样本。在以15,000 rpm的速度离心10分钟后，收集了至少100μl血浆。密歇根大学的药代动力学和质谱核心对所有样品进行了分析。使用具有内部控制的经过验证的LC-MS/MS方法确定等离子体中的化合物浓度。用Xbridge-C18柱（5 cm×2.1 mm，3.5μm）在Shimadzu HPLC系统上实现色谱分离。在阳性离子MRM模式下，在AB Sciex QTRAP 5500质谱仪上进行检测。移动相在水中（a）和乙腈（b）中为0.1％甲酸。B的梯度为：10％（0-0.3分钟），在0.7分钟时增加到95％，保持2.3分钟，重新平衡2分钟，返回至10％。流速为0.4 mL min -1。使用Winnonlin v.3.2（PharSight）中的非各个分节方法计算药代动力学参数。

　　本研究中使用的所有临床记录均在机构审查委员会的批准下获取并使用。接受ICB治疗的患者（同类1）是从美国密歇根州安阿伯市密歇根大学医院招募的。包括在密歇根州转化病理学中心（MCTP）连续综合临床测序程序的分析中，包括39,47,48,49，Mi-Oncoseq，并拥有经过测序的预处理肿瘤文库。从治疗的启动开始，测量了总体生存时间。根据RECIST1.1标准50和Imrecist51确定治疗反应。如前所述47,48,52，使用批准用于MCTP临床实验室改进修正案实验室的标准方案进行了综合临床测序。用AllPREP DNA/RNA/miRNA试剂盒（QIAGEN）纯化后，使用Exome捕获转录组平台在Illumina Hiseq 2000或Hiseq 2500上以配对端模式进行了总RNA。通过标准的临床RNA-SEQ管道CRISP53执行质量控制，比对和表达定量。然后将读取计数表归一化为每千座百万（FPKM），然后使用EDGER 4.2.2软件包54的片段（fpkm），然后每百万（tpm）。RNA-seq数据中的基因得分是使用基于等级的反向正常转化（INT）生成的，如前所述55。The CTL score and DC1 maturation score were generated using the following respective gene sets: (CD8A, CXCL10, CXCL9, GZMA, GZMB, PRF1, IFNG and TBX21) and (CD40, CD80, CD86, HLA-DQA1, XCR1, CLEC9A, IL12A, IL12B, HLA-DRA andIDO1）。STAT5/STAT3表达计算为所有患者的STAT5A和STAT5B（STAT5AB）与STAT3 TPM的TPM的比率（扩展数据表1）。分层以中位数STAT5AB/STAT3 TPM比和中位数DC1成熟评分进行。这是对队列2进行的 （扩展数据表2）在组合组之前，在每个数据集中。使用GM-CSF Reactome基因集（R-HSA-512988）计算STAT5途径INT评分。STAT5途径/STAT3是通过将INT分数除以每个样本中的STAT3 TPM来计算的，该值由中位数分层。

　　TNBC的单细胞RNA-seq分析（队列3）（数据集GSE169246）是在R中使用Seurat（v.4.3.0），SSGSEA和标准数据旋转和绘图包进行的。所有分析均在亚置以进行免疫疗法治疗后进行。根据原始作者的注释提取DC。分析中只有在至少3个细胞中表达200个或更多基因的细胞，并且排除了线粒体读取大于10％的细胞。通过应用GM-CSF反应组基因集（R-HSA-512988）来计算每个单元的STAT5信号得分，以从Escape（V.2.0.0）软件包中输入富集功能，该软件包实现SSGSEA。同样，使用相同方法确定STAT3信号得分。用于IL-10驱动的STAT3信号得分的基因是从鼠DCS56中先前报道的基因直系同源物获得的。该基因组包括：RAP1GAP，CAMKK1，CASR，KIF1A，HPCAL4，DRAM1，RAMP2，MT2A，MT2A，IGFBP6，GATA3，GATA3，CXCR5，GDA，GDA，FAM65C（也称为RIPOR3），RIPOR3），PLET1，SOCS3，SOCS3，MUC1，MUC1和GBP5。The DC maturation score was computed using the same method with genes canonically associated with DC maturation, including CD40, CD80, CD83, CD86, LAMP3, CCL19, IL12A, IL12B, CCL5, CCL22, CXCL9, CXCL10, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIB, FSCN1 and CCR7.高和低STAT3信号得分的二元分裂是通过视觉识别两个不同的簇来确定的。通过迭代聚类和CD14表达的组合确定了单核-DC与常规DC的区别。Wilcoxon签名的秩检验用于使用ggpubr（v.0.6.0）软件包的stat_compare_means函数比较SSGSEA分数。

　　对于体外人类ICB研究，将LIN -CD45+CD11C+MHCII+DC富集并从高级浆液卵巢癌患者的新鲜癌组织中进行分类。在抗人类PD-L1（10μgml-1）的存在下，用SD-36（1μM）预处理DC（每毫升106），用SD-36（1μM）进行预处理并与正常的外周血T细胞（每毫升2×106）共培养。T FACS分析了T细胞细胞因子谱。为了检测体外人类免疫细胞中SD-2301对STAT成员的影响，用SD-2301治疗正常的人外周血单核细胞（PBMC）14小时，然后进行免疫印迹以分析Stat蛋白水平。从商业Buffy Coats（Carter Bloodcare）收集正常的人类免疫细胞。

　　如上所述，从BMDC纯化Cdc1。通过DNase处理通过柱纯化（Qiagen，217048）分离RNA。RNA-seq由BGI基因组学进行。使用EDGER（V.4.2.2）和Limma（V.3.60.6）软件包工作流程进行大量RNA-Seq分析。进行了初步质量控制测量，包括过滤低表达的基因，以及跨样品的图书馆大小的计算和评估。然后将原始计数转换为log计数，每百万（CPM）值。

　　创建了包含单元格信息的设计矩阵（STAT3 - / - 与STAT3+/+），然后使用MakeContasts函数在Limma中确定了STAT3 - / - 和STAT3+/+之间对比的对比度。作为一个额外的归一化度量，使用VOOM函数实现了从归一化计数数据中除去异质性。为了鉴定差异表达的基因，评估了归一化计数的均值变化关系，然后将归一化数据建模为因子和协变量的线性组合。P值的截止值为P = 0.05。分别对未处理的STAT3 - / - 与STAT3+/+ CDC1和LPS处理的STAT3 - / - 与STAT3+/+ CDC1s进行差异表达分析。

　　To assess the DC maturation signature, the log fold change and P values of DC maturation genes reported in the literature including (Cd40, Cd80, Cd83, Cd86, Ido1, Irf7, Tnfsf8, H2-Aa, H2-ab1, Tlr4, Il12b, Il12rb1, Il12rb2 and Cxcl9) was observed from the differential expression analysis结果。为了评估显着上调的直流成熟途径，使用GSEGO函数对R中的STAT3 - / - 与STAT3+/+差异表达的基因进行了基因集富集分析（GSEA）。为了评估用LPS处理的DC中显着上调的DC激活途径，使用GSEGO函数在R中进行了LPS处理的STAT3 - / - 与STAT3+/+差异表达的基因进行GSEA。

　　使用GraphPad Prism 10.2.2计算并绘制了归一化计数的Z分数。从差异表达分析结果中选择了直流成熟基因，并使用GraphPad Prism 10.2.2绘制了对数折叠的变化和P值。使用GSEAPLOT函数在R中生成GSEA图。GSEA DOT图是通过使用clusterProfiler 4.9.2软件包的DotPlot函数从GSEA结果绘制关键途径生成的。火山图是通过首先执行经LPS处理的STAT3 - / - 与STAT3+/+ CDC1的差异表达分析生成的，并绘制了来自Hallmark Pathway Molecular Molecular Signature signature sign5途径的log折叠变化和基因的p值。

　　Chromatin immunoprecipitation was performed using the SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology, 9003s). Sheared chromatin was then immunoprecipitated with STAT5 (Cell Signaling Technology, 94205s) and IgG (Cell Signaling Technology, 2729) antibodies. SYBR green master mix (Applied Biosystems) was used to measure amplification of DNA using QuantStudio 3 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems). The promoters of gene were quantified using the specific primers (Extended Data Table 3). After normalization to the Input DNA, the amount of output DNA of each target protein was calculated by subtracting that of the IgG control.

　　Single-cell suspensions were prepared from fresh mouse tumour tissues or spleen, and lymphocytes were enriched by density gradient centrifugation. To assess intracellular cytokine production, cells were cultured for 4 h in the presence of phorbol myristate acetate (5 ng ml−1; Sigma-Aldrich), ionomycin (500 ng ml−1; Sigma-Aldrich) and brefeldin A (1: 1000, BD Biosciences). Cells were fixed and permeabilized with the Transcription factor staining buffer set (Invitrogen, 00-5523-00). Cellular phenotypes were assessed multi-parameter flow cytometry panels. Data were acquired on a BD LSRFortessa. Antibodies against the following mouse antigens were used: CD45 (30-F11, HI30), CD90 (53-2.1, 30-H12), CD3 (17A2), CD45R/B220 (RA3-6B2), CD4 (RM4-5, GK1.5), CD8 (53−6.7), IFNγ (XMG1.2), granzyme B (GB11), IL-2 (JES6-5H4), Ki-67 (B56), I-A/I-E (M5/114.15.2), CD80 (16-10A1), CD86 (GL1), H-2Kb (AF6-88.5.5.3), H-2 (M1/42), XCR1 (ZET), TNF (MP6-XT22), CD11c (HL3), phospho-Tyr694-STAT5 (SRBCZX), phospho-Tyr705-STAT3 (13A3-1). Additionally, antibodies against the following human antigens were used: CD8 (RPA-T8), IFNγ (B27) and TNF (MAb11). The strategies for DC gating and in vitro cultures and tissues are shown in Extended Data Figs. 2c and 3e, respectively. The strategy for T cell gating is presented in Extended Data Fig. 3k.

　　根据先前发表的研究确定样本量，以确保适当的统计能力。在至少两个独立的重复中进行体外实验。对于体内研究，每个组由至少五只小鼠组成，这被认为足以检测有意义的生物学差异，具有良好的可重复性，并且在实验开始时，小鼠被随机分为治疗组。没有以盲目的方式进行实验，因为需要对治疗组进行研究以进行研究。t检验用于评估两个独立的实验组之间的差异，并使用单向方差分析（ANOVA）比较三个或更多组。将双向方差分析用于比较肿瘤生长曲线。数据表示为平均值±S.E.M.，统计显着性定义为所有测试的p <0.05。所有与这些实验相关的统计分析均使用GraphPad Prism软件v.10.2.2进行。

　　进行了Kaplan-Meier分析以估计总体生存率，使用对数秩检验评估组之间的差异。COX比例危害模型用于多元生存分析。Pearson的相关系数应用于评估变量之间的线性相关性，并进行了Wilcoxon rank-sum测试以评估组差异。所有P值均为双面，并且未进行多次比较。使用R包进行统计分析。

　　所有人类研究均在密歇根大学医学院的机构审查委员会的监督下进行。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。