本文中使用的所有化学物质（溶剂，脂质，培养基，蛋白质等）均从Sigma-Aldrich购买而没有进一步纯化，除非另有说明。

　　在硅晶片（10×15 mm2）上制备SCL。通过浸入去离子水，氨和过氧化氢（体积分数5/1/1）的溶液中清洁底物，在70°C下15分钟，在Milli-Q水中反复冲洗，然后在氮气中干燥。清洁的底物立即通过自旋涂层用于制备SCL。将化合物以2 wt％的浓度溶解在氯仿中（除非另有说明），并以3,000 rpm s – 1进行自旋涂层（LabSpin6，SüssIcrotec），为30 s。

　　按照所述进行SCL制备清洁硅晶片。首先将干净的底物涂有3 nm铬粘附层，然后通过在5×10–5 Mbar（Univex 300，Leybold）进行的化学蒸气沉积层涂上50 nm的金层。通过浸入去离子水，氨和过氧化氢（体积分数5/1/1）的溶液中，在70°C的溶液中清洁金底物，在70°C下重复冲洗在Milli-Q水中，然后在氮气中干燥。为了最大程度地减少缺陷，清洁后立即将金底物用于SAM形成。将硫醇化合物溶于乙醇（分析性纯，P.A。）至1 mm的浓度。使用前，将硫醇溶液超声处理5-10分钟。用超声浴中在乙醇（P.A.）中额外清洁涂有金色的底物30分钟。随后，将样品浸入硫醇溶液中并孵育24小时，以确保完全组装。包含溶液和样品的容器充满干氮并密封以最大程度地减少氧气暴露。孵育后，将样品表面与乙醇（P.A.）冲洗15-20 s，在氮气下干燥，并直接用于进一步的实验。

　　对于反应方案，请参见补充图1。将3-乙酰氧基-5-胆汁酸（A）等效的一种等效化溶解在氩气气氛下的无水二甲基亚氧化二甲基亚氧化物（DMSO）中。将溶液搅拌在冰上，并缓慢地将溶解在无水DMSO中的六甲二咪唑（B）等效添加到溶液中。将反应混合物储存在4°C过夜以进行激活。2.5等式的解决方案。在搅拌的，冰冷的咪唑中间体（C）中滴入cystamine（d），并在室温下左夜间反应过夜。纯化（E）纯化，冷冻干燥，溶于乙醇并在加入1 M NaOH之前稀释在水中以获得酯裂解。纯化和冻干后，产物（F）再次溶于乙醇并将其稀释在水中。通过在中性pH的水溶液中添加盐酸磷酸的六倍过量（2-羧乙基）磷酸磷脂，从而裂解二硫键。切割产物（G）纯化并冻干（纯度约80％）。为了进行反应/纯度控制和纯化，使用了与添加剂或三氟乙酸的水中逆相高性液相色谱（RP – HPLC）。分析HPLC仪器（1260 Infinity II，Agilent）配备了二极管阵列检测器（210和278 nm）和电子喷雾电离飞行 - 飞行时间（ESI – TOF）检测器。制备的HPLC仪器（1200系列，安捷伦）使用二极管阵列检测器和手动收集模式的分数收集器。

　　使用SIEVERS 5310C实验室TOC分析仪（GE分析仪器）根据制造商的规格分析了解决方案的总有机碳（TOC）含量。补充图4提供了有关样品制备的信息。

　　表皮链球菌（菌株PCI 1200，ATCC）和大肠杆菌（W3110菌株）在37°C和200 rpm的溶酶体肉汤（LB）中的单个菌落中生长过夜。隔夜培养物以4,000克离心5分钟。除去上清液，然后将其余的颗粒重悬于LB中。这一洗涤步骤重复了三遍。将细胞密度调节至新鲜LB中的光密度（OD600）为0.2，并将样品底物在细菌溶液中在37°C（无摇动）中孵育1小时。孵育后，用4％多聚甲醛在PBS中固定粘附细菌10分钟，用新鲜的PBS和Milli-Q水洗涤，并在氮气下干燥。将样品用15 nm的金层（SCD 050，Balzers）溅射，并通过高空吸收电压在5 kV的加速度电压下通过扫描电子显微镜（SEM； XL30 ESEM-FEG，Philips/FEI）成像。对于每个样品，在随机位置上获取至少六个图像，并使用fiji27中的计数工具对细胞进行计数。SEM图像的比例尺用于校准像素宽度。斐济“细胞计数器”插件用于计算计算出区域中的单元数量（约103 µm2）。对相对比较的硅参考的中位数进行了计算的数字，或者以每平方毫米的细胞为基础，以实现绝对值。

　　使用配备有蠕动泵系统（IPC，ISMATEC）的QCM-D模型E4（Biolin Scientific）进行石英晶体微量平衡（QCM）测量。将偶发的石英晶体（QSX301，量子设计）具有5 MHz的共振频率进行QCM测量。如上所述，在QCM晶体上制备SCL和SAM。所有测量值均以100 µL min -1的流速进行。蛋白质溶液（溶菌酶，牛血清白蛋白和纤维蛋白原（100 µg蛋白ML – 1 PB））或PBS中PBS中的10 vol％胎牛血清（Merck）在分层样品上被吸附1小时，并随后在PBS上接受脱附30分钟。在第三，第五，第七，第九，第九，第11和13个泛音（分别为15、25、35、45、55、55、55和65 MHz）中，实时记录了被吸附蛋白诱导的频率和耗散偏移。使用Q-Sense DFIND软件（Biolin Scientific）的Sauerbrey方程28计算吸附蛋白的质量。

　　使用OCA 30光接触角度测量和配备有TPC 160温度控制室（DataPhysics Instruments）的Contour Analysis系统进行接触角度测量。分配脱气去离子水的液滴，并以0.3-2.0 µL S – 1的不同速度重新分配，以监测前进和退缩的接触角及其时间依赖性行为。

　　使用配备50 W QTH灯的M-2000椭圆计（J. A. Woollam）进行椭圆测量，以从371到1,000 nm的波长工作，发射率为75°。硅晶片的氧化物层厚度是通过层组件前通过椭圆测定法确定的。组装层的厚度是通过包括三个层的光学模型计算的：Si，Sio2和Cauchy层。

　　对于原位ATR – FTIR，将500 µL的2％胆固醇 - 氯仿溶液旋转在锗ATR晶体上。如先前所述，通过原位ATR -FTIR对沉积的胆固醇SCL进行表征。29。使用单光束样品参考技术进行原位ATR – FTIR光谱，以在干燥和水性环境中获得补偿的ATR – FTIR光谱30,31。根据先前描述的方法32进行了二分性测量。红外光通过电网偏振器（Specac）偏振。ATR – FTIR附件在配备了全球源和汞 - 钙甲酯检测器的IFS 55 Equinox光谱仪（BRUKER光学元件）上进行操作。从干胆固醇SCLS记录了P和S极光谱。可以在脂质双层的ATR – FTIR二分法测量线中验证胆固醇C-O-H头组的N（C-O）谱带的高二分法比。二分法之比r = ap/a，具有在p极化中测得的吸收率AP，并按照S极化测量，其红外带具有垂直于表面平面的过渡偶极矩（M）的红外带（M）在r> 4的情况下显示出较高的r>4。在aTr的界面中，在extem sprient the the extem sprient（sie）中（si）的界面（sie）中，短暂地显示了r> 4。三个电场成分，即EX，EY和EZ，它们与相邻的有机层相互作用。平行极化红外光（EP）形式EX和EZ，而垂直极化的光（ES）形成EY。当有机层中的官能团的M与EZ平行（偏离平面）时，将获得r或ap的高值，而当m平行于EY（在平面）中，这是由于矢量E和M的标量产物所致的。

　　使用配备30 kV BI液体金属离子枪（Iontof）的TOF – SIMS 5-100仪器进行飞行时间二级离子质谱法（TOF – SIMS）。数据以BI3 ++模式获取，并根据参考峰列表（Surfacelab7，iontof）进行校准。分析面积为300×300 µm2，在128×128像素上进行了扫描。该技术的采样深度低于几纳米，也就是说，仅样品的最上层分子层有助于分析。选择了胆固醇（质量与电荷比，M/Z = 369.3）和棕榈酸硬质（M/Z = 257.2）的特征信号进行SCL的半定量表征。

　　我们使用先前描述的FRAP方案来使用FRAP工具（SP5，Leica）33,34分析使用荧光共聚焦激光扫描显微镜分析扩散系数和移动分数。对于FRAP测量，通过在纯胆固醇溶液（2 wt％）中添加1/100或1/20 NBD胆固醇（Thermofisher），制备荧光胆固醇SCL，并进行自旋涂层以清洁。1.5玻璃盖板（康宁）。随后将胆固醇SCL浸入去离子水或PBS中，并使用以下方案将直径为10±1 µm的光漂白斑点进行：在漂白之前进行10±1 µm的定义斑点，然后进行漂白之前，然后是高功率激光束，然后进行4 s，然后进行4 s，以实现4 s，以实现4 s。在256×256像素的图像采集速度下，以40×/ 1.4的数值孔浸入物镜记录恢复，总计300 s（SP5，Leica）。使用MATLAB（MATHWORKS）程序FRAP_ANALSY 35分析了所得的延时35。

　　所有AFM测量均使用NanoWizard IV AFM（JPK仪器）进行。测量之前，对所使用的悬臂进行了校准。在室温（25°C）的PBS中进行测量，除非另有说明。

　　使用QP-BIOAC悬臂（纳米传感器）使用AFM仪器的定量成像模式记录了分层表面的表面地形。采用的采集参数如下：300 nm坡道，10 ms像素时间和100 pn的力触发器。记录了分辨率为256×256像素的30×30 µm2的图像。AFM制造商（JPK Instruments）提供的数据处理软件用于从地形图像中提取表面粗糙度（RA）。

　　对于胶体探针测量，如前所述36所述，将单个硅珠（Kisker Biotech，Ø10µM）连接到无尖的悬臂（PNP-TR-TL-AU，NanoWorld，nanoworld，nanoworld，象征力常数0.08 n M – 1））。在异丙醇中清洗胶体探针修饰的AFM悬臂，并在120°C的加热10分钟中除去吸附的水。胶体探针通过在六甲硅烷基蒸气中孵育12 h，然后在120°C下加热1小时。使用的力光谱参数如下：3 NN设定值，5 µM S – 1接近/缩回速度和5 µM拉距离。使用AFM制造商提供的处理软件的数据从缩回力距离曲线中提取相互作用力。

　　胶体探针修饰的AFM悬臂（请参阅“胶体探针力光谱”部分通过应用多巴胺涂层，并通过胞质绿色荧光蛋白（菌株MG1655 EGFP）进行单个大肠杆菌细胞，使细胞粘合剂粘附，如前所述，如前所述37。使用PetridishHeater（JPK仪器）在37°C进行测量。相同的力光谱参数和数据处理程序用于胶体探针光谱测量。只有在测量之前和之后（即，在测量过程中接触条件/几何图）之前和之后，只有细菌细胞在AFM悬臂上的位置和方向进行的数据集。

　　使用QP-BIOAC悬臂（CB-2，纳米传感器）使用AFM仪器的定量成像模式进行测量。如上所述，通过在六甲基二氮烷蒸气中孵育或通过血浆清洁（Harrick等离子体）亲水10分钟来疏水。所使用的采集参数如下：100 nm坡道，20 ms像素时间和500 pn的力触发器。在样品表面的不同位置记录了分辨率为50×50像素的5×5 µm2的图像。使用AFM制造商提供的数据处理软件从缩回力 - 距离曲线中提取相互作用力。

　　用疏水（请参阅上一节）QP-BIOAC悬臂（CB-2，纳米传感器）进行时间依赖性力光谱测量。使用的力光谱参数如下：1 NN设定值，1 µM S – 1接近/缩回速度和200 nm拉距离。在样品表面的单个位置进行的16个连续测量之间保持了20 s的等待时间，以最大程度地减少测量对胆固醇分子动力学的影响。在样品的不同位置重复测量。使用AFM制造商提供的数据处理软件从缩回力 - 距离曲线中提取相互作用力。

　　具有四个分子层的胆固醇或柱头固醇SCL（即两个双层（扩展数据图6A））进行了建模。在两个双层的界面上，胆固醇或柱头固醇的亲水性羟基相互面对；在界面，羟基面对水层。在所有模拟中，双层 - 水界面正常沿Z轴。为了对SCL底部的固体底物进行建模，将分子运动在XY平面中被限制为最低的脂质分子。模拟框尺寸为7.1554×7.1554×50 nm3。疏水壁沿Z轴沿Z = 0和Z = 50 nm的直接12-6 LJ电位建模，Z = 50 nm。多层上方和下方的真空层可防止水 - 壁和脂质 - 壁短距离无键相互作用。

　　用CHARMM36力场38,39对胆固醇和柱头固醇分子进行建模。使用了魅力40,41,42中的TIP3P水模型，并将KCl盐包括在模拟中。首先，在Charmm-GUI上构建了双层胆固醇或柱头的双层，疏水性尾巴面彼此相反43,44。从Charmm-GUI获得了用于胆固醇和柱头的CHARMM36力场参数，TIP3P水参数和离子参数。胆固醇或柱头固醇双层中的每一层均包含128个分子。使用视觉分子动力学可视化程序Me45沿Z轴沿Z轴沿Z轴进行翻译，构建了四层的多层构造，其中包含512个含有512个脂质分子的多层（扩展数据图6A）。在多层的顶部添加了水和离子。胆固醇多层系统含有12,284个水分子，具有72 K+和Cl-离子，柱头固醇多层系统含有12,363个水分子，具有74 K+和Cl -ION。该系统的能量最小化，并使用Gromacs 2019.4进行了胆固醇和含柱头固醇的系统的平衡模拟（有关详细信息，请参见补充注释4）46,47。

　　与平衡系统相比，在界面（顶层）上具有反向分子取向的系统（顶层），10％（13个分子），30％（39个分子）和50％（39个分子）和50％（64个分子）（64个分子）的方向相比。炼金术工具48用于去除可能出现在恢复分子方向时可能出现的坐标之间的任何重叠。然后如上所述进行最小化和短平衡运行（有关详细信息，请参见补充注4）。