人Rad52 cDNA被优化用于在大肠杆菌中的表达并克隆到PET100中（Geneart，Thermo Fisher Scientific）。进行逆PCR（引物：RAD52_TAG_REMOVE_F和RAD52_TAG_REMOVE_R）以删除6×His，T7和Xpress标签。将质粒转化为BL21恒星（DE3）（Thero Fisher Scientific）细胞，并使用补充有0.8％葡萄糖和100μgml -1 -1氨苄西林的Luria Broth（LB）将单个菌落接种到过夜培养中。将等分试样稀释到含有葡萄糖和氨苄青霉素的2 L lb中，在600 nm（OD600）的光密度为0.1，并在37°C和180 rpm的轨道振荡器中孵育。当培养物达到0.8的OD600时，添加了IPTG（0.5 mm; Thermo Fisher Scientific）以诱导RAD52表达，并继续孵育3小时。通过以3,300克离心15分钟来收集培养物，并将细胞沉淀重悬于1卷PBS中，然后再次离心。然后将颗粒重悬于裂解缓冲液（25 mM Mes pH 6.5、0.5 m NaCl，10％甘油和1 mM EDTA）中，并补充了Halt蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）和0.25 mM TCEP，并在4°C下用乳液c5（Avestin）裂解。通过在60,000g和4°C离心10分钟来阐明裂解液。收集上清液并用相同的裂解缓冲液滴入无NaCl的液压液，以达到300 mM NaCl。然后，通过在60,000g和4°C下离心20分钟，然后将裂解液再次澄清，并加载到连接到4°C的äkta纯系统的HITRAP SP柱（Cytiva）上。用3柱体积（CV）洗涤，其中包含25 mM MES pH 6.5、0.3 m NaCl，1 mM EDTA，10％甘油和0.25 mM TCEP，并用含有0.3-1 M NaCl的同一缓冲液的线性梯度的10 CV洗脱。将峰分数用含有100 mM HEPES pH 7.0、0.25 mM TCEP和停止蛋白酶抑制剂的缓冲液稀释3× （0.1-1 m NaCl）的HEPES缓冲液，含有0.5 mM EDTA和0.25 mM TCEP。将HITRAP Q流通量分数收集为粗纯化的RAD52。

　　为了分离两个RAD52构象，将RAD52加载到资源S列（Cytiva）上。使用含有25 mM HEPES pH 7.0、0.25 mM TCEP和各种NaCl的缓冲液进行色谱。资源S柱（1）用150 mm NaCl缓冲液洗涤；（2）用5 cV的线性梯度洗脱为0.2-0.278 m NaCl缓冲液（直到电导率等于24.4 ms cm -1）；（3）用0.278 m NaCl缓冲液洗涤5 cV；（4）用10 cV的0.278–0.6 m NaCl缓冲液洗脱。分别收集了两种RAD52形式的峰分数。使用含有25 mM HEPES pH 8.0，200 mM KOAC，10％甘油和0.25 mM TCEP的缓冲液，将RAD52-OR和RAD52-CR加载到超糖6增加10/300 GL柱（Cytiva）上。收集峰值级分，等分，在液氮中进行快速冻干，并存储在-80°C下。使用纳米体（Thermo Fisher Scientific）系统在280 nm的波长下测量RAD52浓度，并将其计算为11-亚基环（RAD52-CR和RAD52 NTD）或10-subunit环（RAD52-OR），除非使用Protomer浓度用于圆形二色症（CD）分析。

　　对于RAD52 NTD，使用逆PCR（引物：RAD52_NTD_F和RAD52_NTD_R）去除C末端（氨基酸210-418）。使用与全长蛋白相同的方法纯化RAD52 NTD，除了将0.2-0.6 m NaCl的线性梯度用于资源S列。

　　For RAD52(∆RID), RAD52(RQK/AAA) and RAD52(∆C), inverse PCR was used to remove the RPA-interacting domain (primers: RAD52_RID_F and RAD52_RID_R), extreme C terminus (primer: RAD52_NTD_F and RAD52_C_18D_R) and introduce the R260A,Q261A和K262A突变（引物：RAD52_RQKAAA_F和RAD52_RQKAAA_R）。使用与全长蛋白相同的方法纯化所有突变体。

　　将人Rad52 cDNA优化用于在SF9昆虫细胞中的表达，并用N末端标记标签（Geneart，Thermo Fisher Scientific）克隆到PfastBac1 baculovirus表达载体中。将质粒转化为DH10BAC（Thermo Fisher Scientific），并用purelink Hipure质粒微型套件（Thermo Fisher Scientific）分离Bacmids。总体而言，根据Invitrogen BAC-BAC-BAC杆状病毒表达系统用户手册进行一些修改，进行了杆状病毒的产生和处理。简而言之，将重组BACMID转染到具有Fugene HD的SF9细胞中，转染后66-72小时收集P1病毒。通过使用高纯病毒核酸试剂盒（Roche）分离病毒DNA和使用Platinum QPCR Supermix UDG（Thermo Fisher Scientific）和杆状杆菌试剂盒（牛津表达技术）来确定杆状病毒滴滴。P2杆状病毒通过在感染（MOI）为0.01和200万细胞的SF9细胞通过感染SF9细胞进行扩增，并在感染后66-72小时收集。

　　P2杆状病毒（MOI = 1）用于重组FLAG -RAD52表达。SF9细胞在SF-900 III SFM（Gibco，Thermo Fisher Scientific）中生长在27°C的轨道振荡器，以140 rpm的速度生长。SF9细胞感染66-72小时。通过在500克离心5分钟通过离心收集细胞，并用PBS洗涤一次。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（25 mM Mes pH 6.5、600 mM NaCl，10％甘油和1毫米EDTA）中，并补充了Halt Protease抑制剂（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）和0.25 mm TCEP，并在25幅度中使用150 s间隔（以1 s间隔）（以1秒为单位）（乘以1 s的水），超声器。通过在4°C下以60,000克离心30分钟来阐明裂解物。

　　在裂解物中加入预取平衡的抗FLAG M2琼脂糖珠（Merck），并将混合物在4°C的旋转器上孵育1.5 h。通过在4°C下以500克离心5分钟将珠子放在500克，并转移到重力流色谱柱中。用裂解缓冲液对色谱柱进行广泛的洗涤，然后用含有25 mM HEPES pH 7.0、450 mM NaCl，10％甘油，1 mM EDTA，0.25 mM TCEP和0.25 mM TCEP和HALT蛋白酶抑制剂的缓冲液进行清洗。最后一次洗涤是在300毫米NaCl下使用相同的缓冲液进行的。然后将FLAG -RAD52用含有450 mM NaCl和0.5 mg ML -1标志肽的缓冲液洗脱。通过在4°C下将珠子与同样体积的洗脱缓冲液一起孵育两次。将洗脱液组合在一起，并使用相同的洗脱缓冲液在100 mM NaCl的情况下稀释4×，而无需FLAG肽，以将NaCl浓度降低至150 mm。如上所述进行了资源色谱法。

　　人RPA1，RPA2和10×HIS-RPA3合成并克隆到PfastBac1杆状病毒表达载体（Geneart，Thermo Fisher Scientific）中。然后使用Gibson Assembly（NEB）将RPA1（2份），RPA2和10×HIS-RPA3以及其多面腺蛋白启动子一起组装成PBIG1A（BigBac Multigene baculovirus表达载体）49。如上所述，产生了芽孢杆菌和杆状病毒。P2杆状病毒（MOI = 1）用于重组RPA表达。SF9细胞在27°C的SF-900 III SFM（Gibco，Thermo Fisher Scientific）中生长在140 rpm的轨道振荡器中，并感染66-72 h。通过在500克离心5分钟通过离心收集细胞，并用PBS洗涤一次。将细胞沉淀物重悬于含有25 mM HEPES pH 8.0、0.5 m NaCl，10％甘油，0.01％Tween-20、20 mm咪唑，停止蛋白酶抑制剂和0.25 mM TCEP的缓冲液中，并在250 s iNterions的冰/水中进行超声（以1 s间隔）（以1 s的速度）（以1 s的速度）进行超声（量）。通过在4°C下以60,000克离心30分钟来阐明裂解物。

　　将预取平衡的Ni-NTA珠（Qiagen）添加到裂解物中，并将混合物在4°C的旋转器上孵育1小时。通过在4°C下以500克离心5分钟将珠子放在颗粒上，并转移到色谱柱中。用裂解缓冲液（不包括Tween-20）将色谱柱清洗，同时将NaCl浓度从0.5降低至0.2M。重组RPA用含有25 mM Tris-HCl PH 8.0，0.2 m NaCl的缓冲液洗脱，0.2 M NaCl，10％甘油，10％甘油，250 mm Imidazole，Halt Protease Incyetor and byt protease Incytor and 0.25 mmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM。用相同的洗脱缓冲液（无NaCl和咪唑）将RPA洗脱液稀释2倍，以将NaCl浓度降低至100 mm。然后将稀释的洗脱器加载到资源Q柱（Cytiva）上，并用含有0.1-0.4 m NaCl，25 mM HEPES pH 8.0、10％甘油和0.25 mm TCEP的线性梯度洗脱。使用含有25 mM HEPES pH 8.0，200 mm KOAC，0.5 mM EDTA，10％甘油和0.25 mm TCEP的缓冲液，将含有RPA的峰值加载到超螺位200增加10/300 GL柱（Cytiva）。收集该蛋白质，等分，在液氮中进行快速冻干，并储存在-80°C下。

　　对于RPA1（∆FAB）和RPA2（∆WHD），使用RPA1（氨基酸2–440）（引物：DBDC_F和DBDC_R）以及RPA2（rpa_r）的DBD-F，DBD-A和DBD-B删除DBD-F，DBD-A和DBD-B，以及RPA2（Amino Acide drip）（Amino Cids 207-27-27-27-27-270）（RPA__R）。rpa2_whd_r）。使用与全长蛋白相同的方法纯化两个缺失突变体。

　　所有DNA寡核苷酸均纯化HPLC（默克和综合DNA技术）。寡素的名称和序列如下如下，其中FAM为6-羧基氟菌素：RAD52_TAG_REMOVE_F（5'-AGCGGCGGCGAGCGAGAAGAAGAAGCAATTTAGG-3'），RAD52_TAG_REMEMOVE_REMOVE_REMOVE_R（5'-catatgtatatctcttctttaaaaagttaaaaaaaaaaaaTattTctaggggg-3'），rad52_ntd_f（5'-taaaaaaaagggcgcgctcaacgatcagatcagatccggcggtg-3'）RAD52_RID_F (5′-CCTCCGGCACCGCCTGTTAC-3′), RAD52_RID_R (5′-ATCCTGATCTGCCGGAATAACTGCATG-3′), RAD52_RQKAAA_F (5′-CGCACAGCTGCAACAGCAGTTTCGTGAACGTATGG-3′),RAD52_RQKAAA_R（5'-GCAGCCAGTTTACGCTGCTGTGGTGTGTTCGCTTCGCTTCACTGCGCG-3'），RAD52_C_18D_R（5'-ATTACCCGGGTGGTGCTGCTGCTGCTGCGCTATAGGG-3'）（5'-aactggaaaAccttgTatgTaTgtCaaAtccGagaAcctggg-3'），dbdc_r（5'-catggatccgcgcgcgcgcgcgcgccgatggtgg-3'），rpa2_whd_f（5'-gcggcgcgcgcgcgcgctttcgcttcgaatcgaagcctg-3'（5'-agtgaggccatttgctgctgcatgegcatgtattct-3'），ssa1（5'-tatcgaatccgtctcgtctcgtctagtcagcccgcccagccagcgaAttctAcagagtttggctcctcctccctcaacctgctgcctgcagggtt-3'），ssa2（5'-aAcctgcaggtTgaggccaCaaAcctgcctggtaaAttcgcgcgcgcgcgcgtgtgtgactagcggataggattcgata-3'），fam-ssa4（40nt）（5'-fam-fam-tatcgaAtcgaAtccgtccgtccgtccgtccgctgcccgcccgacgaccgaattctactactactactactctacccagt-3''），SSSSA55（5'-ActggtagaattCggcgcgttGactagagagAcggAtcgata-3'），SSA6（5'-tgaccatctcttaagccgcgtcgtcgcgcgcgcgctgcctaagctat-3'），ssa7，ssa7，ssa7，5'-cggcgcgcgcgcgcgcgtgttgactagagaggatgagtcgggatcgatcgatcgatcgata-gapatcgata-33'（5'-CGTGAAGTCGCCGCCGCCGCCAGCAATCTTTTTTTTGAGTCTCATTTGCATTTGCATCTCGGCAATCTCTTTCTTTCTTGTGTGTGTGCAGTTGCATTTTTTTTTTTTTTTGATTCTCTCACTACAAAATCCGGCGG-3'）和GAP 1-3（5'-gattgctggcattcagtcggcgacttcacg-3'）。购买了CY3和CY5标记和生物素化的寡核苷酸（Merck）。为了产生FAM-SSA1/SSA2 dsDNA，将Equirol浓度的FAM-SSA1和SSA2混合在10 mm Tris-HCl pH 7.5，NaCl和1 mm EDTA中，加热至90°C，逐渐冷却至室温。使用GAP 1-1，GAP 1-2和GAP 1-3进行了解放，将间隙DNA退火。使用分光光度计使用260 nm处的吸光度值测量浓度。所有DNA都存储在-20°C下。

　　在含有25 mM HEPES pH 8.0、0.2 m KOAC，10％甘油，0.25 mM TCEP，1 mm mg（OAC）2和0.01％BRIJ-35的缓冲液中，在25°C的25°C下进行DNA结合反应（20μL）。将蛋白质连续稀释，并与384孔微板岩（corning）中的FAM标记DNA的10 nm（最终浓度）混合。使用Clariostar微板读取器（BMG LabTech）测量板。平均毛坯校正的各向异性测量值并针对蛋白质浓度绘制。RAD52结合使用GraphPad Prism 9中的以下二次方程式构建曲线，以确定KD值：

　　其中y是荧光各向异性，Amin和amax是最小和最大荧光各向异性值，L是配体浓度（等于0.01 µM），X是蛋白质浓度，KD是解离常数。对于每个结合条件，进行了至少三份独立的技术重复三份。

　　反应（15μl）含有5'-32p标记的SSA1（68个核苷酸），其互补链SSA2（68个核苷酸）在25 mm HEPES pH 8.0，0.2 m koAC中30 30，1 mm koAC，1 mg（OAC）2，0.01％Brij-35，0.01％Brij-35，0.25 mm tcep和5％Glycerol。建立了两个独立的7.5 µL反应混合物。一个在缓冲液中包含5'-32p标记的SSA1（0.33 nm），第二个包含SSA2（0.33 nm）。如所示，将RPA（0.33 nm）添加到两者中。将RAD52（0.33 nm或图中指示）添加到SSA2中，并在25°C下孵育10分钟。然后将两个试管在25°C下混合并在25°C下孵育10分钟，然后通过使用3 µL蛋白酶K（20 mg ml-1蛋白酶K在10 mM Tris-HCl pH 7.5和1 mM CaCl2中）停止，然后在30°C下孵育30分钟。对样品补充了Ficoll加载缓冲液，并以Page用TBE作为运行缓冲区进行分析。将凝胶干燥并暴露于使用台风FLA 9500生物分子成像仪（GE）获得的磷光板和图像，并使用ImageJ50,51进行了定量。

　　对于使用40-核苷酸ssDNA（5'-32p标记的SSA4与免费SSA5）的反应，如上所述，将反应设置为如上所述，只是将ssDNA的浓度降低至0.13 nm，以防止使用SSDNA的自封ssDNA，并使用了RPA的0.13 nm。RAD52的浓度在图中指示。

　　为了确定Rad52或介导的退火是否需要DNA末端，在0.33 nm圆形φx174病毒体ssDNA和0.33 nm 32p标记的间隙双链DNA之间的相互作用（60-核苷酸长的ssDNA）已分析了30个核苷酸长的ssDNA，每个ssDNA已分析了30 mers的ssDNA）。对于这些实验，RPA（0.33 nm或19.9 nm）分别用间隙和圆形SSDNA（提供相似的覆盖率）对其进行了预混合。然后将RAD52添加到间隙ssDNA中，并使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶通过电泳测量退火。

　　为了分析使用尺寸排斥色谱法分析ssDNA退火，在加入相同体积的CY3 – SSA1（4 µM）之前，将RAD52-OR（4 µM）预加载在SSA2-CY5（4 µM，12.5 µL）上。在冰上30分钟后，将反应加载到SuperDex 200增加3.2/300柱上，连接到äkta纯微型系统。在4°C下用含有25 mM HEPES pH 8.0，200 mm KOAC，0.25 mM TCEP和1 mm mg（OAC）2的缓冲液进行色谱。

　　40-核苷酸（SSA4）ssDNA在5'或3'端（分别为Bio-SSDNA或SSDNA – BIO）在5'或3'端进行生物素化。68-核苷酸（SSA1）ssDNA在3'端（表示为SSA1 – BIO），将互补ssDNA的28个核苷酸在5'端退火到5'端，以保护5'SSDNA端（表示为DS-SSDNA – Bio）。实验是在25°C下使用含有25 mM HEPES pH 8.0，200 mm KOAC，0.01％TWEEN-20-20，1 mm mg（OAC）2和0.25 mm TCEP的25°C的八位骨R8系统（Sartorius）进行的。将生物素化的DNA底物（5 nm）固定在八位内链霉素生物传感器上，直到达到0.05阈值，然后将传感器移至包含一系列Rad52浓度的井（20、10、5、5、5、5、2.5、1.25、1.25、0.625、0.625和0.312 nm）。使用Octet Bli Discovery软件记录Rad52与DNA的关联60分钟，并分离5分钟。通过在平衡与蛋白质浓度（Octet分析工作室软件； sartorius）的绘制关联幅度绘制关联幅度获得平衡分解常数（KD），并在GraphPad Prism 9中绘制。下面的1：1结合方程用于确定KD值：使用以下QUADRATIC方程来确定GraphPad Prism 9来确定KD值：确定KD值：确定KD kd kd：kd kd：kd kd：

　　其中y是缔合振幅，bmax是饱和时的最大振幅，x是蛋白质浓度，kd是解离常数。对于每个结合条件，进行了三份独立的三份。

　　远紫外的CD测量值是在JASCO J-815光谱极仪上，该光谱极仪，该光谱极符合由CDF-426S毛发单元调节的细胞持有人温度。在20°C下以3.3 µm（RAD52-OR）和3.2 µM（RAD52-CR）的蛋白质浓度在10 mM磷酸钾缓冲液pH 8.0、100 mM NAF和0.25 mM TCEP中记录光谱。使用熔融二氧化硅比色杯，其路径长度为1毫米（Hellma）。光谱以0.2 nm的分辨率记录，并通过减去适当的缓冲光谱校正基线。CD强度表示为计算为：：

　　其中s是毫米中的信号，cm是摩尔浓度，l是路径长度（以cm为单位）。估计二级结构含量如所述52。

　　将蛋白用0.1％（v/v）甲酸稀释至1 µm，并使用Ackiity I类LC（Waters）系统注入C4 BEH 1.7 µM，1.0×100 mm，UPLC柱。使用50 µL min -1的流速，用0.1％（v/v）甲酸的乙腈梯度（2％（v/v）至80％（v/v））洗脱蛋白质。分析柱出口通过电喷雾电离源直接连接，并具有飞行时间（TOF）质谱仪（BioAccord，Waters）。在300–8,000的M/z范围内获取数据，在正离子模式下，圆锥电压为40V。扫描被手动汇总并使用Maxent1（Masslynx，Waters）进行反价盘。所使用的参数如下；输入m/z范围（DA）：600–2,000；输出质量范围（DA）：30000–60000;TOF分辨率：10000.00;并迭代到融合。

　　将RAD52（纯化至HITRAP Q步骤）透析为25 mM HEPES pH 7.0、6 m GUHCL，0.5 mM EDTA和2 mMβ-马c-Mercapto乙醇在4°C下过夜。使用Superose 6增加10/300 GL色谱柱分析了变性蛋白，该蛋白使用6 M GUHCL缓冲液运行。蛋白质在天然缓冲液（25 mM HEPES pH 7.0，200 mm NaCl，0.5 mM EDTA和2毫米墨塔乙醇）中重新释放24 h。然后使用天然缓冲区在同一列上运行恢复的RAD52。为了分析开放环和封闭环的百分比，将恢复的RAD52样品加载到资源列中。

　　将样品（4 µL，25 ng µl-1）施加1分钟，以发光排放（25 mA，30 s）400英寸碳涂层的铜网格（C400CU100，EM分辨率）。将网格顺序染色在四个单独的30 µL液滴中，为2％（v/v）乙酸铀酰，为10、15、20和25 s。使用Whatmann纸将过量的乙酸铀酸乙酸酯抹掉，并在成像前将其干燥并储存。

　　在Tecnai Lab6 G2Spir节TEM上成像，配备了2K Gatan Ultrascan 1000相机。使用数字仪表仪以名义放大倍数为×30,000（每个像素3.5Å）或×42,000（每个像素2.4Å）手动获取显微照片，而置二焦值范围为-0.7至-1.5 µm。

　　使用E2Proc2d.py（EMAN2）53将DM3文件转换为MRC格式。将显微照片导入Relion 3.1或4.154,55，使用CTFFIND456计算CTF参数，并使用Cryolo57或Topaz58挑选粒子。提取粒子并迭代2D分类（忽略CTF到第一个峰=是，限制分辨率e-step =20Å，附加参数= - 仅flip-phasses）。

　　重组RAD52和RPA被纯化为资源S或资源Q步骤，并在Superose 6增加10/300 GL或SuperDex 200增加10/300 GL柱，然后再制作冷冻 - EM网格。对于RAD52-CR，该蛋白在含有25 mM HEPES pH 7.0、150 mM NaCl和0.25 mM TCEP的缓冲液中，稀释至0.3 mg ml-1，并补充了0.00005％的Tween-20。将样品（4μl）应用于新鲜发光的封荷（45 mA，60 s; Quorum emitech k100x）量化R2/1 300网状铜网格，并使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）玻璃体玻璃体，并冷却至4°C，湿度为4°C，湿度为4°C。将网格双面印迹为0.5 s，并在液体乙烷中陷入困境。对于RAD52-OR，如上所述制备网格，除了使用Quantifoil R2/2 200网格铜网格，浓度为0.25 mg ml-1，Tween-20浓度为0.001％，印迹时间为1.5 s。对于RAD52-OR – SSDNA，将蛋白质（0.25 mm）稀释至0.5 µm，在25 mm HEPES pH 8.0，150 mm NaCl，2 mm mg（OAC）2中，并补充了0.05％八酰基-β-葡萄糖苷（OG）。加入SSA4（1 µM），并在25°C下孵育10分钟。通过布拉德福德测定法（Bio-Rad）确定浓度，并用相同的缓冲液稀释至0.15 mg ml-1。除了使用量子R1.2/1.3 300网格铜网格，并且印刷时间为2.5 s，播放网格。对于RPA – SSDNA，将蛋白质（0.25 mm）稀释至25 mm HEPES pH 8.0，150 mm NaCl，2 mm mg（OAC）2，稀释至3 µm，并补充0.1 mM Chapso。加入SSA7（6 µm），并在25°C下孵育10分钟。使用Bradford分析（Bio-Rad）确定浓度，并用相同的缓冲液稀释至0.15 mg ML-1。如上所述，制备了Ultraufoil R2/2 200网格金网格（Quantifoil），并且印刷时间为2.5 s。如下“ RAD52-SSDNA-RPA复合物的重建”部分所示，将RAD52-OR – SSDNA-RPA三元复合物组装在一起。使用Bradford分析（Bio-Rad）确定浓度 并用补充了0.00075％Tween-20和0.075 mM Chapso的缓冲液稀释至0.1 mg ML-1。如上所述，制备了Quantifoil R2/2 200网格铜网格，除了印迹时间为3 s。

　　在弗朗西斯·克里克（Francis Crick）结构生物学STP上，收集了配备有猎鹰III直接电子检测器（Thermo Fisher Scientific）的Titan Krios Cryo-TEM上的RAD52-CR和RAD52-OR数据集。RAD52-OR – SSDNA数据集是在伦敦低温EM（LONCEM）的Titan Krios G3i（FEI，Thermo Fisher Scientific）上收集的，该泰坦Krios G3i（FEI，Thermo Fisher Scientific）配备了Gatan K3 Direct Electron检测器。RPA – SSDNA和RAD52-OR-SSDNA – RPA数据集收集在配备Francis Crick Institute结构生物学STP的Titan Krios Cryo-Tem（Thermo Fisher Scientific）上。

　　单粒子分析是在Relion（v.4.0）54和Cryosparc59中进行的。使用Relion自身的MotionCor260实现和随后的对比度传输（CTF）参数对视频进行漂移和剂量加权校正，并使用CTFFIND456测量。使用Cryolo57或Topaz58自动挑选颗粒。图像处理的详细信息在扩展数据图2中说明了。3、4、5、8和9。简而言之，进行了几轮2D分类，以去除无法对齐以产生定义的2D平均值的粒子。进行了几轮3D分类，以分离无法对齐以产生高分辨率3D量的不同构象或颗粒。进行了3D自动refine，贝叶斯抛光（至少两轮）和CTF改进（至少一轮）进行迭代进行，以实现高分辨率3D重建61,62。将抛光的颗粒进口到冷冻Parc59，并使用不均匀的修补剂进行精炼63。进行3D变异性64或3D分类以检测冷冻EM密度内的异质性。如果局部分辨率差异很高，则通过在依赖，CryoSparc或DeepeMhancer65中进行后处理，从而锐化了冷冻EM图。总体分辨率在FSC = 0.143时报道（参考文献66）。

　　所有模型构建均在Chimerax71中使用Phenix67,68，Coot69和Isolde70进行。对于RAD52-CR，将RAD52 NTD（PDB：1H2I）的晶体结构放入Chimerax71中的锐化RAD52-CR Cryo-Em图中，并最初使用NAMDINATOR72进行了完善。从RAD52-CR中除去一个RAD52亚基，并用于在rad52-or的NAMDINATOR中进行初始细化。ssDNA是用rad52-or – ssDNA作为起始模型手动在coot中手动构建的。RPA1，RPA2和RPA3 AlphaFold2模型用于码头和重建phenix73,74，并从真菌RPA结构（PDB：4GOP）中对准SSDNA模型39。RAD52-OR – SSDNA模型用作RAD52-OR-SSDNA – RPA的初始模型。

　　SEC – Malls用于确定RAD52的摩尔质量组成。将纯化的RAD52-OR（2.0、1.0或0.5 mg mL-1）加载到超级糖6增加到10/300 GL柱上，该柱连接到Jasco色谱系统。在25°C下用含有25 mM HEPES pH 7.0、150 mM NaCl，0.25 mM TCEP和3 mM NAN3的缓冲液进行色谱法进行色谱，流速为1.0 mL min -1。使用25 mM Bis-Tris丙烷pH 8.5，200 mM NaCl，5 mM MGCL2，5mm MGCL2，0.25 mM TCEP和3 mM NAN3作为跑步缓冲液，以类似的方式分析了Rad52-Or – SSDNA（2 mg mL-1）。使用Dawn-Heleos激光光度计和OPTILAB-REX差异折射仪（DN/DC = 0.186）记录柱状脱岩的散射光强度和蛋白质浓度。使用来自Astra软件v.7.3.2（Wyatt Technology）中两个检测器的合并数据确定色谱峰中包含的重量平均分子质量。

　　U2OS细胞（由弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）确定的未验证和无微量质量）在37°C和5％CO2的加湿孵化器中补充了10％FBS（GIBCO）的DMEM（GIBCO）中生长。从四个融合的500 cm2平方盘中收集细胞，并用PBS洗涤一次。将沉淀添加到5倍的CSK缓冲液中（10 mM管道pH 6.8，100 mm NaCl，3 mm MgCl2，300 mM蔗糖，1 mm EGTA，0.5％Triton X-100和0.25 mm TCEP，用冰酶和冰期的冰期和磷酸盐酶含量为10分，在4°C下5分钟。将上清液收集为第一个CSK提取物。将3×颗粒体积的CSK缓冲液（含有0.1％Triton X-100）添加到颗粒中，在冰上孵育10分钟，并在4°C下以3,000g离心5分钟。将上清液收集为第二个CSK提取物。苯并消化缓冲液（20 mM HEPES pH 8.0、2 mM MGCL2、0.5％Triton X-100、0.25 mM TCEP和500单位苯并酶/100 µL的苯甲酶/100 µL缓冲液）补充了Halt蛋白酶和磷酸蛋白酶抑制剂的含量，并添加到冰上蛋白酶抑制剂中，并添加了10分钟。然后在冰上孵育10分钟，在4°C的4°C下将2×样品体积的高盐缓冲液（20毫米HEPES pH 8.0、600 mM NaCl和0.25 mM TCEP）补充，并在冰上孵育10分钟，并在4°C的4°C中孵育10分钟。将上清液作为核/染色质提取物收集。

　　Glycerol gradients (5 ml, 10–30%) in 25 mM HEPES pH 8.0, 150 mM NaCl, 10–30% glycerol and 0.25 mM TCEP were cast in thin-wall polypropylene tubes (Beckman Coulter) using a Gradient Master (Biocomp) and kept in the cold room overnight to equilibrate to 4 °C.U2OS核/染色质提取物（200 µL），200 ng重组RAD52-OR或凝胶滤光度校准标记（Cytiva）轻轻加载到三个梯度的顶部，然后使用SW 55 Ti Rotor（bekman fortor）将其在4°C和55,000 rpm（368,000g）的情况下进行中心。通过手动从梯度的顶部移动来收集分数。还将U2OS核/染色质提取物（500 µL），500 ng重组RAD52-OR或凝胶滤光度校准标记（Cytiva）加载到预取平衡的Superose 6增加10/300 GL柱（Cytiva）上。用含有25 mM HEPES pH 8.0、150 mM NaCl，10％甘油和0.25 mM TCEP的缓冲液进行色谱。通过SDS -PAGE收集并分析馏分，然后使用针对RAD52的抗体进行蛋白质印迹（Rabbit Monoclonal，1：500，Abcam，AB124971）。使用Alexa Fluor Plus 800抗兔二级抗体（1：2,000，Invitrogen，A32735），并使用带有ImagesTudio软件（LICOR）的Odyssey DLX仪器对膜进行成像。

　　如上所述进行了资源色谱法，除了使用0.2-0.6 M NaCl的线性梯度。UV280吸光度值被进口到GraphPad Prism 9中，并使用两个高斯方程的弯曲拟合，以否定开放式和闭环峰：

　　将RAD52 – SSDNA – RPA三元络合物（400μL）在含有25 mM HEPES pH 8.0，200 mm KOAC，2 mm mg（OAC）2，0.01％Tween-20-20和0.25 mm TCEP的缓冲液中重构。将生物素标记的SSA4（0.1μM），具有光合连接器（集成的DNA技术），然后将重组RPA（0.15μm）混合并在冰上孵育10分钟。然后加入rad52-or（0.15μm），并继续孵育10分钟。然后加入预洗的链霉亲和蛋白丝糖磁珠（10μL，胞质），并在4°C的头对旋转器上孵育30分钟。将珠子用反应缓冲液洗涤一次，然后用反应缓冲液Tween-20洗涤。将珠子重悬于20μl反应缓冲液中，并用365 nm UVA在冰/水浆液上辐射，以裂解可裂开的接头。

　　将RAD52-OR（纯化为资源s步骤）和RPA（纯化为资源Q步骤）被加载到Superose 6增加10/300 GL（Cytiva）和SuperDex 200增加10/300 GL（Cytiva）列，并用包含25 mm Hepes pH 8.0，150 mm nacl，2mmmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM（o）2和0.2和0.2和0。冷冻EM的重构混合物补充了0.00075％的Tween-20和0.075 mM Chapso，而XL-MS样品则补充了0.05％OG。RAD52-OR – SSDNA – RPA三元复合物的重建涉及两个步骤：（1）RPA（1 µM终浓度）添加到SSA1（0.5 µM终浓度）中，并在25°C下孵育10分钟；（2）加入RAD52-OR（0.5 µM终浓度），并在25°C下孵育30分钟。将样品在4°C下以21,000克离心1分钟，然后进行冷冻EM电网制备和XL-MS。

　　将人RAD52蛋白序列（Uniprot：p43351）上传到ODINPRED75 WEBSERVER（https://stprotein.chem.au.dk/odinpred）。在GraphPad Prism 9中绘制了每个残基的预测障碍概率。

　　使用默认设置将来自不同生物体的RAD52蛋白序列与Clustal Omega对齐76。对齐格式使用ESPRIPT3.077。

　　RAD52-OR and RAD52-OR–ssDNA–RPA ternary complexes (0.5 µM, reconstituted as above) were supplemented with a 1:100 molar ratio of disuccinimidyl dibutyric urea (DSBU: 50 µM) for 1 h at room temperature, before the mixture was quenched by the addition of NH4HCO3 to a final concentration of 20 mM (15 min at room温度）。用10 mM二硫苏醇醇还原交联蛋白，并用50 mM碘乙酰氨酰胺烷基化。然后，用胰蛋白酶以1：100的酶与基底比例消化它们，在室温下1小时，并在胰蛋白酶以1:20的比例加入胰蛋白酶后在37°C下进一步消化过夜。然后，通过高pH逆相色谱法分割肽的消化，将微型自旋Targa C18柱（NEST组）分成四个分数（10 mM NH4HCO3/10％（V/V）乙腈pH 8.0; 10 mm NH4H4H4HCO3/20％（V/V/V/V/V/V/V/V/V/V）乙酸8.0; 10 mm ph 8.0; 10 mM H.0；（v/v）乙腈pH 8.0;在通过LC – MS/MS分析之前，将馏分（150 µL）蒸发至干燥。

　　将冻干的肽重悬于1％（v/v）甲酸和2％（v/v）乙腈中，并使用剂量的NEO UPLC（Thermo Fisher Scientific，Dionex）通过纳米级毛细管LC-MS/MS进行分析，以提供大约300 nl Min-Min-1-1。A PepMap Neo C18 5 μm, 300 μm × 5 mm nanoViper (Thermo Fisher Scientific, Dionex) trapped the peptides before separation on a 25 cm EASY‐Spray column (25 cm × 75 µm inner diameter, PepMap C18, 2 µm particles, 100 Å pore size, Thermo Fisher Scientific).用乙腈梯度洗脱肽。分析柱出口通过纳米流电喷雾电离源直接连接，并带有四极杆轨道质谱仪（Orbitrap Exploris 480，Thermo Fisher Scientific）。使用前十种方法以数据依赖性模式获取MS数据，其中排除了1+和2+的前体电荷状态的离子。在Orbitrap中记录了高分辨率全扫描（R = 60,000，M/Z 380–1,800），然后在十个最激烈的MS峰中记录了更高能源的碰撞分离（HCD）（HCD）（阶梯碰撞能量30和32％的归一化碰撞能量）。片段离子光谱以30,000的分辨率获取，并应用了20 s的动态排除窗口。

　　为了进行数据分析，使用Proteome Discoverer v.2.3（Thermo Fisher Scientific）将Xcalibur RAW文件转换为MGF格式，并直接用作Merox78的输入文件。对包含复合物中蛋白质序列的临时蛋白数据库和一组由软件生成的随机诱饵序列进行了搜索。设置了以下参数以进行搜索：最大漏洞数量：3;目标残基K，S，Y和T；最小肽长度5氨基酸；可变修饰：半胱氨酸的氨基甲基化（质量移位57.02146 DA），蛋氨酸氧化（质量移位15.99491 DA）；DSBU修改的片段：85.05276 DA和111.03203 DA（精度：5 ppm ms和10 ppm MS/MS）；误解率截止值：5％。最后，手动检查和验证了每个碎片光谱。

　　为了与肽阵列实验进行比较，计数每个氨基酸残基检测到的交联数，并在具有1个氨基酸移位的单个20个氨基酸肽中求和，类似于肽阵列。使用GraphPad Prism 9绘制了覆盖结果。

　　具有1-氨基酸偏移的肽（20个氨基酸）涵盖了RAD52，RPA1，RPA2和RPA3的完整序列，在Francis Crick Institute的Chemical Biology STP中合成了3 mM斑点的纤维素膜上。将膜用50％乙醇和10％乙酸洗涤30分钟，并用1×TBST（50 mM TRIS-HCL pH 7.5、150 mM NaCl和0.1％Tween-20）平衡，并补充了0.25 mm TCEP。在TBST中用5％的非脂肪牛奶（0.1％Tween-20）封闭膜，在室温下补充了0.25 mM TCEP 1小时。为了允许蛋白质肽相互作用，将膜与TBST中的1％非脂肪牛奶中的RAD52-OR或RPA（1 µg ML-1）一起孵育，并在4°C下孵育为0.25 mM TCEP过夜。将膜用1×TBST（0.1％TWEEN-20）洗涤，并在轨道振动柜上补充0.25 mm TCEP，在室温下3次洗涤5分钟。然后将膜在原代抗体（抗HIS 1：1,000，Takara，631212）中孵育在1％的非脂肪牛奶中，在TBST（0.1％Tween-20）中补充了0.25 mm TCEP，在室温下，持续2 h。将膜像以前一样清洗了三次，并在Alexa-Fluor-Plus偶联的二抗中孵育（山羊抗小鼠1：2,000，Thermo Fisher Scientific，A32730；山羊抗兔子； 1：2,000，1：2,000，Thermo Fisher Scientific，A32735-20（0.1％）在1％的牛奶中（0.1％）0.25 mm TCEP在室温下持续1小时。将膜洗涤3次，在Li-Cor Odyssey DLX系统上成像，并使用Image Studio Lite（Li-Cor）进行定量。

　　在热变性后，使用Prometheus NT-48（Nanotemper）仪器来监测色氨酸荧光的变化。在25 mM HEPES pH 8.0，200 mm KOAC，0.5 mM EDTA，10％甘油和0.25 mM TCEP中将蛋白稀释至10 µm。将样品加载到高敏性玻璃毛细管中，并在285 nm激发后在330和350 nm处监测色氨酸荧光。测量是从25至95°C进行的，温度梯度为1°C min -1。在温度下绘制了荧光强度（350/330 nm）的比率，并使用该曲线的第一个导数来计算热熔化（TM）值。

　　使用GraphPad Prism 9进行了统计分析。使用两尾未配对的t检验比较正态分布的数据，而使用两尾Mann-Whitney U-Test进行比较非正态分布的数据。当p <0.05时，差异被认为具有统计学意义。报告的n值是指荧光各向异性，生物使化干涉法分析和SSA分析的独立实验。U2OS核提取物重组RAD52-OR的甘油梯度沉积分析和尺寸 - 排斥色谱分别独立重复七次，结果相似。RAD52 – SSDNA – RPA下拉实验是独立重复的五次，结果相似。RAD52纯化重复超过50倍，结果相似。重复RPA净化十倍，结果相似。重复两次RAD52和RPA突变体的纯化，结果相似。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。