这项研究中使用的细胞系是从ATCC（HEK293T和VERO E6），Thermo Fisher Scientific（Expi-Cho-S细胞，293-F细胞和Expi293F细胞），Takara（Lenti-X 293T细胞）或内部生成的（VERO E6-TMPRSS2）40获得。在Dulbecco修改后的Eagle培养基（DMEM）中，在37°C培养Vero-TMPRSS251细胞，并补充了10％胎牛血清（FBS），10 mM HEPES pH 7.3和100 U mL-1 PERICICILIN-链霉素的100 mL-1 u ml-1，并补充了5 µg ml-grasticiin。所使用的细胞系未经过身份验证。通常对细胞系进行支原体污染测试。

　　病毒序列和相应的元数据是从Gisaid Epicov项目（https://www.gisaid.org/）获得的。对提交至2021年12月20日提交的GISAID的序列进行了分析。从具有外源的基因组序列中获得了峰值蛋白序列52 2 2.4.0 – Haf93ef1_3（https：//quay.io/repository/repository/repository/biocontainers/biocontainers/biocontainers/exonerate？–Minintron 999999 - 百分比20，并使用登录YP_009724390.1作为参考。使用MAFFT53 7.475 – H516909A_0（https://quay.io/repositority/repositority/biocontainers/mmafft = tags）使用MAFFT53 7.475 – H516909A_0进行多个序列比对。–Mapout参数用于检索插入。丢弃了超过10％模棱两可的氨基酸或小于80％的规范蛋白长度的尖峰序列。使用r 4.0.2（https://cran.r-project.org/）使用GGPLOT2 3.3.2和SF 0.9-7软件包生成图。为了确定每个突变的患病率，在提名人和分母中都考虑了缺失（或模棱两可的氨基酸）。

　　Sotrovimab和Vir-7832（VIR-783254衍生自Sotrovimab，FC进一步设计用于携带Gaalie）。单克隆抗体COV2-2130（蛋白质数据库（PDB）ID 7L7E），COV2-2196（PDB ID 7L7E，7L7D），REGN10933，REGN10933（PDB ID 6XDG）（PDB ID 6XDG），REGN10987（PDB ID 6XDG）（PDB ID 6XDG）（PDB）（PDB）（PDB）（PDB）（PDB）（PDB）（PDB）（PDB）（PDB）（PDB），WO2021207597，seq。使用外叶置胺转染细胞。转染后1天，用外虫饲料和Expifectamine CHO促进剂补充了转染的细胞。转染后八天收集细胞培养上清液，并通过0.2-µm滤光片过滤。重组抗体使用5 ml HITRAP MABSERECT PRISMA色谱柱在äktaXpress FPLC设备上纯化，然后使用HIPREP 26/10脱水柱进行缓冲液交换到组氨酸缓冲液（20 mM组氨酸，8％蔗糖，pH 6）。Atum通过ATUM通过Atum生产了LY-COV555，LY-COV016和CT-P59的抗体VH和VL序列，分别从PDB IDS 7kmg，7c01和7cm4获得了重组IgG1。如上所述，在VIR中发现了其余的单克隆抗体，并已在外cho-S细胞中作为重组IgG1产生。通过液相色谱 - 质谱法（LC -MS）分析证实了产生的单克隆抗体的身份。

　　在室温下过夜的非换性反应后，通过PNGase F去除了单克隆抗体的FC N连接聚糖。将去糖基化蛋白（4 µg）注入LC -MS系统以获取完整的MS信号。Thermo MS（Q Expranive Plus Orbitrap）用于在M/Z窗口的变性条件下从1,000至6,000中获取完整的蛋白质质量。Biopharma Finder 3.2软件用于将原始M/Z数据反应为蛋白质平均质量。使用GPMAW 10.10软件计算每种单克隆抗体的理论质量。翻译后修饰，例如N末端硫酸谷氨酸环化，C末端赖氨酸裂解和16-18二硫键的形成。

　　根据当地机构审查委员会批准的研究方案（Canton Ticino伦理委员会，瑞士，Comitato Etico Etico Etico Etico Etecon Etico entaro 1），从SARS-COV-2康复和接种疫苗的个体获得了样品。所有捐助者均提供了书面知情同意书，用于使用血液和血细胞（例如外周血单核细胞，血清或血浆）进行研究。从华盛顿大学人类学科机构审查委员会批准的HAARVI研究中获得了从AD26.COV2.s，mRNA-1273或BNT162B2接种疫苗的疗养个体和个体的血浆样本。从米兰的Ospedale Maggio Policlinico获得了已接种AZD1222的个人的样本，并获得了当地审查委员会研究Polimmune的批准。从阿根廷布宜诺斯艾利斯的DeClínicas'JosédeSanMartín医院的医院，来自曾向Sputnik V接种疫苗的个人的样本。在UWARN（联合世界防病毒研究网络）的机构审查委员会的研究下，来自Aga Khan大学接种了苏纳植物的个人的样本。

　　编码Omicron SARS-COV-2峰值变体的质粒是通过野生型质粒PCDNA3.1（+） - Spike-D1955的重叠PCR诱变产生的。复制有缺陷的VSV伪病毒表达与祖先Wuhan-Hu-1病毒相对应的SARS-COV-2尖峰蛋白和Omicron VOC的相对应如前所述46，并进行了一些修改。根据制造商的说明，将Lenti-X 293T细胞（Takara）以每盘10×106细胞的密度在15 cm2菜肴中播种，然后第二天用25 µg的峰值表达质粒（Mirus，6600）根据制造商的说明转染。转染后一天，用VSV-LUC（VSV-G）感染细胞，多种感染（MOI）为3，持续1小时，用含有Ca2+和Mg2+的PBS冲洗3次，然后在37°C下在完整培养基中再孵育24小时。通过离心，等分并冷冻在-80°C下阐明细胞上清液。

　　Omicron SARS-COV-2 SPIKE VSV与SARS-COV-2 G614 SPIKE（YP 009724390.1）VSV和Beta Spike VSV的比较，如前所述9,56。简而言之，DMEM中补充了10％FBS的HEK293T细胞，使用质脂剂使用脂肪胺2000（生命技术），将1％青霉素 - 链霉素播种在10 cm菜肴中，用质粒编码相应的尖峰糖蛋白（生命技术）。转染后一天，将细胞用VSV感染（G*ΔGLuciferase）57和2小时后用DMEM洗涤5次，然后再添加培养基添加培养基，并添加添加了抗VSV-G抗体（I1-菌群杂交瘤上网剂，CRL-2700，ATCC）。接种后18-24小时收集病毒假型，通过在2,500G下离心5分钟，通过0.45-μm截止膜过滤5分钟，用30 kDa的切断膜浓缩10次，并在-80°C下储存。

　　Vero E6细胞在补充10％FBS的DMEM中生长，并以每个孔的20,000个细胞的密度为20,000个井底96个井板（Perkinelmer，6005688）。第二天，将单克隆抗体或血浆在预热的完整培养基中连续稀释，与假病毒混合，并在37°C的圆底聚丙烯板中在37°C下孵育1小时。吸出细胞中的培养基，并将50 µL病毒 - 单克抗体 - 血浆复合物添加到细胞中，然后将其在37°C下孵育1小时。然后将另外100 µL预热的完整培养基添加在配合物的顶部，然后再孵育16-24小时。在每个板上的重复孔中测试了条件，每盘井中有八个井中包含未经处理的感染细胞（定义了中和的0％，“最大RLU”值）和被感染的细胞在S309和S2X259存在下，在20 µg ml -1的存在下每个（定义了中和的100％中和“最小RLU”值，“定义了100％）。然后，将含有病毒 - 单克抗体 - 抗血压的培养基从细胞和100 µL的稳态Plus（Perkinelmer，6066759）的1：2稀释的PBS中吸入，将Ca2+和Mg2+添加到细胞中。将板在室温下孵育15分钟，然后在Synergy-H1（Biotek）上进行分析。未处理感染井的平均相对光单位（RLU）通过最小RLU（min rluave）的平均值减去，并用于根据以下公式的单个RLU值的中和度归一百分：棱镜（v.9.1.0）。IC50（单克隆抗体）和ID50（等离子体）值是根据对数（抑制剂）与响应的插值值计算的，使用可变斜率（四个参数）非线性回归≤100的非线性回归，并在每个中性实验上进行了较低的限制。 生物学重复 - 每个生物复制都包含技术重复。跨生物重复的IC50值表示为算术平均值±S.D。通过将变体的IC50/ID50除以每个生物学重复的父母IC50/ID50，然后以算术平均值±S.D进行可视化，从而计算出跨越尖峰变体的中和效力的损失或增益。

　　将VEOE6-TMPRSS2细胞在DMEM中培养，其中10％FBS（Hyclone），1％青霉素 - 链霉素和8 µg ML-1尿霉素（以确保在37°C孵化器中保留5％CO2的TMPRSS2）。使用0.05％胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶，并于第二天将其铺板为90％汇合。在一个空的半区域96孔板中，在DMEM中进行1：3的血清系列稀释，然后在室温下添加稀释的假病毒并在37°C中添加血清 - 病毒混合物之前在室温下孵育30-60分钟。两个小时后，含有20％FBS和2％青霉素 - 链霉素的DMEM溶液（Thermo Fisher Scientific，未稀释时，每毫升青霉素10,000单位，每毫升青霉素10,000单位，10,000 µg ml -1的链霉菌蛋白链霉素）。17–20小时后，将每孔的单GLO-EX底物（Promega）添加到细胞中40μl，并在黑暗中孵育5-10分钟，然后在Biotek Plate读取器上阅读。至少使用不同的假病毒批次进行了测量，并显示了一个代表性的实验。绘制RLU并在Prism（GraphPad）中进行标准化。对数（抑制剂）与归一化响应的非线性回归用于确定曲线拟合中的IC50值。使用D'Agostino-pearson检验对正态性进行了测试，在没有正态分布的情况下，Kruskal – Wallis检验用于比较两组以确定差异是否达到统计学意义。通过比较单个IC50，然后平均单个折叠更改以进行报告确定折叠变化。

　　先前描述了具有D614G取代的WA1/2020菌株58。B.1.1.529分离株（HCOV-19/USA/WI-WSLH-221686/2021）从鼻拭子中获得，并在Vero-TMPRSS2细胞上转移，如所述59。B.1.1.529分离株进行了测序（GISAID：EPI_ISL_7263803），以确认取代的稳定性。所有病毒实验均在经认可的生物安全3级（BSL-3）设施中进行。

　　将Sotrovimab的连续稀释液与102个SARS-COV-2（WA1/2020 D614G或B.1.1.529）的102个焦点形成单位在37°C下孵育1小时。将抗体 - 病毒复合物添加到96孔板中的Vero-TMPRSS2细胞单层中，并在37°C下孵育1小时。随后，在MEM中用1％（w/v）甲基纤维素覆盖细胞。在30小时后（Vero-TMPRSS2细胞上的WA1/2020 D614G）或70小时后（Vero-TMPRSS2细胞上的B.1.1.529）收集板，并在室温下在PBS中用4％PFA固定使用20分钟。洗涤具有WA1/2020 D614G的板，并与SARS2-2，SARS2-11，SARS2-16，SARS2-16，SARS2-31，SARS2-31，SARS2-38，SARS2-38，SARS2-57，SARS2-57和SARS2-7160抗S抗SANTI抗S抗体抗体。还将具有B.1.529的板与与SARS-COV-1交叉反应的单克隆抗体池一起孵育，并在RBD61上结合CR3022的表位。随后用HRP偶联的山羊抗小鼠IgG（Sigma，A8924）染色的PBS染色，并补充了0.1％皂苷和0.1％牛血清白蛋白。使用TrueBlue过氧化物酶底物（KPL）可视化SARS-COV-2感染的细胞灶，并在免疫孔微分析仪（细胞技术）上进行定量。使用具有可变斜率（GraphPad软件）的非线性回归分析分析抗体剂量响应曲线，并计算了IC50。

　　HEK293T（293T）细胞（ATCC CRL-11268）在10％FBS中培养，在37°C下在DMEM中，在一个加湿的8％CO2培养箱中，在DMEM中培养了1％青霉素 - 链霉素。使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）和含有全长小鼠ACE2的HDM质粒（GenBank：Q8R010，由Genscript构成），在感染前18-24小时，在293T细胞中对小鼠ACE2进行瞬时转染的瞬态转染。在37°C下在加湿的8％CO2孵化器中孵育5小时后，添加了10％FBS的DMEM，并将细胞在37°C的37°C下在加湿的8％CO2孵化器中孵育18-24小时。在感染前，将293T细胞用小鼠ACE2的瞬时表达用DMEM 1倍洗涤，然后用DMEM 1:75稀释的假病毒镀术。DMEM中的感染在60％至80％的汇合之间进行2.5小时，然后分别将FBS和青霉素 - 链霉素添加到最终浓度为10％和1％。感染18-24小时后，将单GLO-EX（Promega）添加到细胞中，并在黑暗中孵育5分钟，然后在协同H1混合杂种多模式读取器（Biotek）上阅读。在GraphPad Prism中绘制了在不同天（生物学重复）作为单个点的伪病毒的细胞入口水平，并将跨生物学重复的平均细胞进入计算为几何平均值。

　　用于SPR结合测定的SARS-COV-2 RBD蛋白（残基328-531的尖峰蛋白来自GenBank NC_045512.2，具有N端信号肽和C末端凝血酶裂解位点TWINSTREP-8×HIS-TAG）在Expi293f（Expi293f（Expi293f）中表达了37％的CORSCORICIC）和8％的CORESCORICICATIC cORESSICON和8％CORED co.使用Expifectamine 293转染试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行转染。转染后两到四天收集细胞培养上清液，并补充10×PBS，最终浓度为2.5×PBS（342.5 mM NaCl，6.75 mM KCl和29.75 mM磷酸盐）。使用基于钴的固定金属亲和力色谱法纯化SARS-COV-2 RBD，然后使用HIPREP 26/10脱盐柱（cytiva）或第二批SPR使用的Omicron RBD将缓冲液交换到PBS中，SPR，SuperDex 200增加了10/300 GL柱（Cytiva）。

　　The SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 and Delta (B.1.617.2) RBD-Avi constructs were synthesized by Genscript into pcDNA3.1- with an N-terminal mu-phosphatase signal peptide and a C-terminal octa-histidine tag, flexible linker and avi tag (GHHHHHHHHGGSSGLNDIFEAQKIEWHE).The结构的边界是N-328RFPN331和528KKST531-C（参考文献9,14）。在37°C下在37°C下在37°C下在悬浮液中生长的Expi293F细胞（Thermo Fisher Scientific）中生产蛋白质，该蛋白质在130 rpm旋转的混合的8％CO2孵化器中生长。使用Expifectamine 293转染试剂盒（Thermo Fisher Scientific）转染每ML的密度为300万细胞的密度，并培养3-5天。使用镍Histrap HP亲和力柱（Cytiva）从澄清的上清液中纯化蛋白质，并用10毫米咪唑的10柱体积，25 mm磷酸钠pH 8.0和300 mm NaCl洗涤，然后在梯度上洗脱至500毫米咪唑。使用BIRA生物素 - 蛋白连接酶试剂盒（Apapity）生物素化过夜，并使用TheHistraphP亲和力柱再次纯化。洗涤和洗脱后，将蛋白质换成20 mM磷酸钠pH 8和100 mm NaCl，并在闪光前使用离心过滤器（Amicon Ultra）浓缩。

　　ATUM产生了重组人ACE2（从Uniprot Q9BYF1中的19-615种残基，带有C末端AVITAG-10×His-GGG-TAG和N末端信号肽）。通过Ni Sepharose树脂纯化蛋白质，然后使用SuperDex 200增加10/300 GL色谱柱（Cytiva），通过尺寸排斥色谱分离单体HACE2，用PBS进行了平衡。小鼠（Mus musculus）ACE2胞外域构建体（GenBank：Q8R0I0）通过Genscript合成，并放入PCMV质粒中。胞外域的域边界是残基19-615。使用信号-5.0（残基1-18）鉴定天然信号标签，并用N末端MU磷酸酶信号肽代替。然后将该构建体融合到编码凝血酶裂解位点和人FC片段或在C末端的8×他的标签的序列。ACE2-FC和ACE2-HIS构建体是在37°C的Gibco Expi293表达培养基中在37°C的Gibco Expi293表达培养基中产生的，该培养基在130 rpm的37°C下在37°C下的表达培养基。使用PEI-25K（Polyscience）转染培养物，其细胞生长至每毫升300万细胞，并培养4-5天。Proteins were purified from clarified supernatants using a 1-ml HiTrap Protein A HP affinity column (Cytiva) or a 1-ml HisTrap HP affinity column (Cytiva), concentrated and flash-frozen in 1× PBS, pH 7.4 (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl).

　　使用BIACORE T200仪器对单体人和小鼠ACE2进行一式三份进行测量，并为二聚体小鼠ACE2复制。使用链霉素XT（IBA Lifesciences）共价固定的CM5芯片，用于表面捕获含双毒剂的RBD（Wuhan-Hu-1，Alpha，Beta，Omicron，Omicron，k417n），并使用了Cytiva生物素捕获KIT的折叠式捕获（用于折叠式生物蛋白捕获）（delte of Fibotiny-caption-fobotiny-nyl capture）（delte of Fibotiny-cha）rbs（与三角洲的比较）。实验使用了两批Omicron RBD。运行缓冲液为HBS-EP+ pH 7.4（细胞tiva），并在25°C下进行测量。用三倍的人ACE2（300、100、33、11 nm）或小鼠ACE2（900、300、100、33 nm）进行实验，并作为单周期动力学运行。单体ACE2结合数据是双重提取的，并使用BIACORE评估软件拟合到1：1结合模型。高浓度的二聚体小鼠ACE2表现出与帽传感器芯片参考流动池的显着结合。

　　中和测量以重复作用，并将RLU转换为中和，并使用非线性回归模型绘制，以使用GraphPad Prism软件（v.9.0.0）确定IC50/ID50值。通过Wilcoxon等级测试进行了两组配对双面数据的比较。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。