所有动物实验均由洛克菲勒大学的机构动物护理和使用委员会批准，并根据美国国立卫生研究院指南进行。小鼠在22°C时以12小时的光线/12小时的黑暗周期和30–60％的湿度饲养，并随意获得正常的食物饮食和水。我们使用了以下鼠标基因型：C57BL/6J（野生型（WT）；库存号000664，杰克逊实验室），NPY-IRES2-FLPO-D（杰克逊实验室，第030211号库存），Rosa26-LSL-Cas9（杰克逊实验室，库克森实验室，库克森，库存号，024857）和bnc2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-2-PA-2-2-2-2-2-2-2-2-carce（下）对于所有CRE或FLP小鼠系实验，仅使用杂合动物。样本量根据相似研究的实验决定。将同性的同立与实验组一起分配。如前所述，使用雄性和雌性小鼠进行实验。

　　BNC2-P2A-ICRE鼠标系是由Rockefeller University使用CRISPR – CAS9 Technology的CRIS和基因组编辑资源中心以及转基因和生殖技术资源中心生成的。51。简而言之，在内源性终止密码子附近插入了一个定制设计的长单链DNA（LSSDNA）供体，该供体包含P2A-ICRE序列的BNC2基因座的同源臂。两个指导RNA（SGRNA）用于诱导特定地点的双链断裂。根据标准CRISPR基因组工程协议，将带有预组装Cas9蛋白蛋白络合物的LSSDNA供体混合并将其微注射到C57BL/6J小鼠zygotes中。由PCR与两组底漆进行了基因分型，这些底漆特异性扩增了突变等位基因。通过Sanger测序确保了验证。将BNC2-P2A-ICRE转基因动物育成C57BL/6J小鼠进行维持。

　　这些研究中使用的AAV是从Addgene，UNC向量核心获得的，或者由Janelia Viral Tools Service生成的。我们使用了以下病毒：AAV5-HSYN-DIO-HM3D（GQ）-Mcherry（Addgene，Catalog No。44361，2.2×1013 VG ML-1），AAV5-HSYN-DIO-HM4DI（GI）-Mcherry（Addgene，AddGene，Catalog o.4444362，2.5×5×5×5×MCHERY）AAV5-hSyn-DIO-mCherry (Addgene, catalogue no. 50459, 2.2 × 1013 vg ml−1), AAV5-Ef1a-DIO-EYFP (Addgene, catalogue no. 27056, 1.6 × 1013 vg ml−1), AAV5-hSyn-Flex-GCaMP6s-WPRE (Addgene, catalogue no. 100845,2.9 × 1013 vg ml−1), AAV5-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP (UNC Vector Core, 2.7 × 1012 vg ml−1), AAV1-hSyn1-SIO-stGtACR2-FusionRed (Addgene, catalogue no. 105677, 2.1 × 1013 vg ml−1),AAV5-EF1A-FDIO-MCHERRY（Addgene，目录编号114471，2.3×1013 VG ML-1），AAV8-EF1A-FDIO-GCAMP6S（Addgene，Addgene，Catalog No.105714，2.1×1013 VG ML-1），，2.1×1013 VG ML-1），AAV5和DJ-EF1A-FDIO-HCHR2（H134R）-EYFP-WPRE（UNC矢量核心，1.4×1012 VG ML-1），AAV5-EF1A-MCHERRY-FLIX-FLIX-DTA（addgene，Addgene，Catalog no.58536，3.888×1012 VG ML-1）。对于LEPR删除，将AAV病毒向量克隆起来，并使用Janelia病毒工具服务与AAV5血清型包装。SGLEPR的序列为：5'-GAGTCATCGGTTGTGTTCGG-3'，5'-TGCCGGCGGCGGCGGTGTGTGTGATG GACT-3'（病毒滴度，4.9×1012 VG ML-1）；SGCTRL的序列为：5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAATTC-3'（病毒滴度，8.5×1012 VG ML-1）。在立体定位注射之前，将病毒等分试样存储在-80°C。

　　The following chemicals were used in this study: Leptin (ThermoFisher Scientific, catalogue no. 498OB05M, 3 mg kg−1 or 5 mg kg−1, intraperitoneal injection), Sema (Millipore Sigma, catalogue no. AT35750, 10 nmol kg−1, subcutaneous injection), CNO dihydrochloride (Tocris, catalogue第6329号，3 mg kg -1，腹膜内注射），蔗糖片20 mg（Testdiet，CatalogNo。1811555）和HFD（研究饮食，60％kcal％脂肪）。

　　使用异氟烷麻醉（诱导5％，维持1.5-2％）麻醉小鼠（8-10周龄），并放置在立体式钻机上（KOPF Instruments，Model 1900）。使用Drummond Scientific nanoject III可编程纳米素注射器，通过玻璃毛细管将病毒通过玻璃毛细管输送到大脑中。对于ARC区域，使用以下相对于董事的坐标：前后，-1.65 mm至-1.70 mm；内侧 - 侧面（ML），±0.25 mm至0.30 mm，背腹侧（DV），-5.9 mm。对于化学遗传学实验，BNC2神经元标记和LEPR缺失，以1 NL S -1的速率对30-50 NL的病毒注射30-50 NL。对于光遗传学，以1 nl s-1的速度单侧注射30 nL病毒，然后在弧上（前孔，-1.65 mm; mm; ml; ml，0.3 mm; dv n arc植入200 µm的光纤（Thorlabsno。CFM12U-20）的植入。对于纤维光度法实验，单侧注入30 NL病毒，然后在150 µm上方150 µm（Arc-poster，MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM; MMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM;-5.75毫米）。对于CRACM实验，将两种病毒以1：1的比率混合，将50 NL混合病毒双侧注射到ARC中。

　　雄性C57BL/6J小鼠10-12周，使用冰冷的Hepes-Sucrose切割溶液，含有NaCl（110 mm），HEPES（10 mm），葡萄糖（25 mm），蔗糖（75 mm），MGCL2（7.5 mm）（7.5 mm）和KCL（2.5毫米）和2.5毫米（2.5毫米）。随后，将大脑迅速在同一溶液中阐述，使用液氮冷冻，并在-80°C下储存直至核分离。To isolate nuclei, as described previously53,54, the samples were thawed on ice, resuspended in HD buffer containing tricine KOH (10 mM), KCl (25 mM), MgCl2 (5 mM), sucrose (250 mM), 0.1% Triton X-100, SuperRNaseIn (0.5 U ml−1), RNase Inhibitor (0.5 U ml−1).使用1 mL插入均匀均质器匀浆样品。使用40μm的过滤器过滤所得的匀浆，以600g离心10分钟，并在含有蔗糖（166.5 mm），MGCL2（10 mm），Tris Buffer（pH 8.0，10 mm），superrnasein（0.05 U mL -ML -1）中的核糖（166.5 mm），MGCL2（10 mm），Tris Buffer（pH 8.0，10 mm）中恢复为0.05 unibes ins in n.05 u n.05 u n.05 u n.05 u n u n u n u n u n u n u n u n u n u n u n u n.05 u n.05使用自动细胞计数器（Countess II，Thermofisher）评估细胞核质量和数量。For staining, nuclei were labelled with Hoechst 33342 (ThermoFisher Scientific, catalogue no. H3570; 0.5 µl per million nuclei), anti-NeuN Alexa Fluor 647-conjugated antibody (Abcam, catalogue no. ab190565; 0.5 µl per million nuclei) and TotalSeq anti-Nuclear Pore Complex Proteins主题抗体（Biolegend，目录No。682205；每百万个核0.5 mg）在4°C下15分钟。染色后，将样品用10 mL 2％BSA（以PBS）洗涤，并在600G下离心5分钟。然后将细胞核重悬于2％BSA中（在PBS中），用RNase抑制剂（超南0.5 U mL-1，RNase抑制剂0.5 U ML-1）重悬于随后的荧光激活细胞分选中。样品根据Hoechst荧光门控，以识别核，然后根据高Alexa荧光647表达进一步分类，将Neun+核指定为神经元。

　　按照制造商的规程，使用10倍基因组铬V.3捕获和条形码。加工和图书馆的制备由洛克菲勒大学的基因组资源中心进行，并使用Illumina Sequencers进行了测序。

　　使用Cell Ranger v.5.0分析FASTQ文件。使用Seurat v.4（V.4.0.3）55分别预处理ARC（WT）的SNRNA-SEQ数据。选择了超过800且少于5,000个RNA特征的细胞进行进一步分析。还取出了超过1％线粒体基因且总RNA计数超过12,000个的细胞。排除在少于三个细胞中检测到的基因。然后，我们使用seurat v.4中的内置函数基于其主题塔计数（正数量= 0.8）来消除细胞。仅保留具有单线主题标签分配的细胞进行下游分析。然后以10,000的比例系数将数据符合对数均衡。在最初的质量控制，反复分流和归一化步骤之后，然后通过主成分分析和统一的歧管近似和投影（UMAP）对所有单重尺进行缩放并缩小尺寸并降低尺寸。应用Leiden聚类（分辨率= 0.55）以识别簇。我们使用已知的细胞类型特异性基因表达来注释簇。

　　我们使用先前发表的人类成人样本分析了人弧内标记基因的共表达，并且可以通过NEMO档案（https://assets.nemarchive.org/dat-917e9vs）访问数据。如果检测到至少两个唯一的分子标识符，则认为一个细胞表达标记基因。如先前的研究中所述，通过聚类和规范标记的表达实现了弧形细胞的鉴定。在R中列出了LEPR，BNC2，AGRP，NPY和POMC等基因的共表达，并计算了两尾Fisher的测试，以评估人数据集中16,819个弧形细胞中基因对共表达的重要性。

　　将AAV病毒双侧输送到8-10周的雄性BNC2-CRE小鼠的弧线中。然后允许小鼠恢复并表达至少3周。为了激活或抑制，将动物用3 mg kg -1的CNO或PBS腹膜内注射（对照）。

　　AAV病毒单方面分配到8-10周的雄性BNC2-CRE小鼠的弧菌中，然后植入视觉纤维。随后，将小鼠的恢复期至少为3周，以允许基因表达。在实验之前，将小鼠习惯于在5天的时间内进行贴片电缆。使用陶瓷套筒（Thorlabs）连接植入的视线纤维，并连接到473 nm激光器（OEM激光/Optoengine）。在每个实验的开头验证激光的输出。使用了由473 nm激光二极管（OEM激光/光引擎）产生的，具有15 MW的功率。光脉冲（10 ms）和频率（20 Hz）由波形发生器（Keysight）控制，以激活或抑制ARC中的BNC2神经元。在激活喂养实验中，允许小鼠适应笼子20分钟。随后，启动了三个持续20分钟的喂食课程。在这些会话期间，最初20分钟关闭了光线，然后在随后的20分钟内打开，然后再次关闭剩余的20分钟。在抑制进食实验中，在适应20分钟之后，每个喂养会延长至30分钟。每次喂食期间食用的食物量是手动记录的。在实验结束时对动物进行安乐死，以确认使用免疫组织化学的病毒表达和纤维放置。

　　一个定制的两腔盒（50×50×25厘米黑色的有机玻璃），带有8.5厘米的间隙，使动物可以在腔室之间自由移动，用于该测定法。为了评估小鼠的初始偏好，将它们引入了10分钟的框中，而没有任何光刺激。随后，在初始示例之后的第二个10分钟会话中，将光刺激（15 mW，20 Hz）与腔室配对，在初次疗程中，小鼠的偏好较少。Ethovision XT V.13软件与CCD摄像头相结合，有助于记录每个腔室中鼠标所花费的时间百分比。

　　在实验前5天的时间里，每天5分钟，将小鼠适应绑扎和家庭式式舞台。使用Tucker-Davis Technologies（目录No。RZ5P，Synapse）和Doric成分的光纤光度法系统和Doric成分进行了数据采集，并通过晶体管 - 透视传播者逻辑触发在情节中同步与视频数据同步。双荧光迷你立方体（Doric）将465 nm的光线和异类405 nm发光二极管（LED）（LED）组合在一起，这些二极管（LED）通过连接到植入物的记录纤维传输。GCAMP6S荧光，代表钙依赖性信号（525 nm），并使用fomtowatt Photoreceivers（Newport，CatalogNo。2151）和以1 kHz的采样速率检测到同学对照（430 nm）。使用MATLAB脚本进行了分析，该脚本涉及涉及将漂白和移动伪像的删除使用，使用多项式最小平方拟合应用于405 nm信号，将其调整为465 nm痕迹（405拟合），然后将GCAMP信号作为％δf/f =（465signal -405 signal -4055 fftits/405 fittits/405Fitted）计算为GCAMP信号。使用移动平均过滤器过滤所得的轨迹，并以20倍的速度下采样。该代码可应要求提供。

　　用无ICE-COLD RNase PBS短暂地将小鼠短暂地灌注。然后快速收集大脑，将嵌入干冰上的最佳切割温度嵌入培养基中，并在-80°C下储存，直到低温恒温器切片（厚度为15 µm）到超冻土加上粘附幻灯片（热泡）。RNASCOPE荧光多路复用测定（高级细胞诊断生物）基于制造商的协议。所有试剂均购自晚期细胞诊断（ACDBIO）。使用了以下mRNA的探针：AGRP（目录编号400711-C3），POMC（目录号314081-C3），LEPR（CatalogNo。402731），SLC31A1（目录号（CatalogNo。319191））和BNC2（Catalog No.5185521-C2）。简而言之，在4°C的4％多聚甲醛（PFA）中固定脑部切片15分钟，然后在50％乙醇，70％乙醇和100％乙醇中的100％乙醇中的连续浸入室温度下5分钟。在室温下用蛋白酶IV处理切片30分钟，然后使用Hybez烤箱在40°C下与特定探针进行2 h孵育。通过使用Hybez烤箱在40°C下，分别与30、15、30和15分钟的AMP-1，AMP-2，AMP-3和AMP-4连续孵育，通过连续的孵育来实现信号扩增。每个孵育步骤都在rnascope洗涤缓冲液中进行2 2分钟的洗涤。在盖上覆盖之前，用DAPI Fluoromount-G（Southernbiotech）安装培养基对核酸进行染色。使用倒置的Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜可视化载玻片。获得的图像被进口到斐济以进行进一步分析。

　　首先用PBS灌注小鼠，然后将4％PFA用于固定。收集大脑并在4°C下浸入4％PFA中，以进行更多固定。将固定的大脑顺序浸入10％的蔗糖，20％的蔗糖和30％的蔗糖缓冲液中，分别在4°C下分别浸入1小时，1小时和过夜。此后，将大脑嵌入最佳切割温度嵌入培养基中，并在-80°C下储存直至低温恒温器切片（厚度为30-50 µm）。对于染色过程，首先在含有3％BSA，2％山羊血清和0.1％Triton X-100的PBS的阻塞缓冲液中阻塞脑部，在室温下30分钟，然后在寒冷室中与一抗的一夜孵育。在PBS洗涤后，将切片与荧光偶联的二抗（Invitrogen）在室温下孵育1小时。将染色的切片安装在超砂岩（Fisher Scientific CatalogNo。22-034-980）载玻片上，然后用倒置的Zeiss LSM 780激光扫描共聚焦显微镜可视化，具有×10或×20镜头。获得的图像被进口到斐济以进行进一步分析。The following antibodies were used: FOS antibody (1:1,000; Synaptic systems, catalogue no. 226308), pSTAT3 antibody (1:1,000; Cell Signaling Technology, catalogue no. 9145 s), GFP (1:1,000; abcam, catalogue no. ab13970), RFP (1:1,000; Rockland, catalogue no.600-401-379）。

　　使用含有氯化胆碱（110毫米），NaHCO3（25 mm），KCl（2.5 mm），MGCL2（7 mm），CaCL2（0.5 mm），NAH2PO4（NAH2PO4（1.25 mm），Glucose（1.25 mm），Glucos（25毫米），ASCORIC（25毫米），ASCOR酸（25 mm），铜（25 mm）的成年小鼠，使用冰冷的切割溶液通过心心灌注对成年小鼠安乐死。（3.1毫米）。随后，将大脑迅速在同一溶液中剖析，并使用振动型分为275 µm的冠状切片。然后将这些切片在含有NaCl（125 mm），KCl（2.5 mm），NAH2PO4（1.25 mm），NAHCO3（25 mm），MGCL2（1mm），1毫米），CACL2（2 mm）（2 mm）和Glucose（11 mm）的30分钟的人工脑脊髓中孵育。电流钳记录的细胞内溶液中包含K-葡萄糖酸盐（145 mm），MGCL2（2 mM），Na2ATP（2 mM），HEPES（10 mm）和EGTA（0.2 mM，286 MOSM，286 MOSM，pH 7.2）。电压钳记录的细胞内溶液中包含CSMESO3（135 mm），HEPES（10 mm），EGTA（1毫米），QX-314（氯化盐，3.3 mm），mg-atp（4 mm），Na-GTP（0.3 mm），Na-GTP（0.3 mm），pHSSO和pHossocreatine（0.3）。使用Multiclamp 700B放大器获取信号，并使用Digidata1550b（分子设备）以20 kHz数字化。使用ClampFit（分子设备）和MATLAB（MATHWORKS）分析了记录的电生理数据。

　　对于CRACM实验，在BNC2和NPY神经元上进行了电压钳记录。为了记录OIPSC，将细胞膜电位保持在0 mV。使用蓝色LED灯（PE-300 White; coolled），使用全场照明的短暂脉冲（0.5 ms，0.1 Hz，10次）激活ChR2表达轴突。随后，通过浴溶液依次施用TTX（1 µM），4-AP（100 mM）和PTX（1 µM），每个溶液施加10-20分钟。每次药物施用后至少5分钟开始，数据采集开始。

　　使用现象师自动化家居表型系统（TSE系统）进行间接量热法。在12 h的光线/12小时黑暗周期和40％的湿度下，将小鼠分别安装在环境控制的腔室中，并随意获得食物和水。以15分钟的间隔收集O2和CO2测量，其沉降时间为3分钟，样品流速为0.25 L min -1。使用CALR56分析获得的原始数据。

　　使用oneTouch Ultra米和葡萄糖测试条测量血糖水平。对于GTT，将小鼠禁食过夜，然后在0、15、30、60和120分钟时进行20％的葡萄糖注射（2 g kg -1）和葡萄糖测量。快速4小时后进行ITT，并在0、15、30、45和60分钟时进行胰岛素注射（0.75 U kg -1），并在0、15、30、45和60分钟进行葡萄糖测量。为了测试BNC2神经元活性如何影响葡萄糖代谢，在GTT和ITT实验开始之前，将CNO注射1小时。

　　所有统计分析均使用GraphPad Prism v.9。测试了数据分布的正态性（Shapiro-Wilk测试），然后使用参数或非参数测试进行比较。使用了两尾统计检验，统计显着性是通过学生的t检验，曼恩 - 惠特尼测试，费舍尔的精确测试，单向或2路ANOVA和弗里德曼测试确定的，如源数据中所示。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。