这项工作是由与锡耶纳（IT）的Azienda Ospedaliera Universitaria Senese（IT）合作造成的，该公司提供了对Covid-19的捐助者的样本，这些捐助者均给予了两性，他们给予了书面同意。这项研究得到了Comitato Itico di地区瓦斯塔（CEAVSE）伦理委员会（锡耶纳的Parere 17065）的批准，并根据赫尔辛基宣布（2001年欧洲理事会，2001年，《美国联邦法规》，联邦法规，ICH 1997），根据良好的临床实践进行了批准。这项研究是没有盲的，不是随机的。没有使用统计方法来预先确定样本量。

　　如先前所述5进行了外周血单核细胞（PBMC）和单细胞分选策略。简而言之，通过密度梯度离心（Ficoll-Paque Premium，Sigma-Aldrich）从肝素处理的全血中分离PBMC。分离后，将PBMC用可在室温下1：500稀释的活/死固定水（Invitrogen； Thermo Scientific）染色。孵育20分钟后，用PBS洗涤细胞，并用20％的正常兔血清（生命技术）饱和。在4°C下孵育20分钟后，用PBS洗涤细胞，并用SARS-COV-2 S蛋白染色，用链球菌 - tactin XT tt dy-488（2-1562-050，iba-lifesciences）在4°C下染色30分钟。孵育后，使用以下染色混合物CD19 V421（1：320; 562440，BD），IGM PERCP-CY5.5（1:50; 561285，BD），CD27 PE（1:30; 340425，BD），IGD-A700（IGD-A700（1:15615; 5613302，1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：561302，CD）300420，Biolegend），CD14 PE-CY7（1：320; 301814，Biolegend），CD56 PE-CY7（1:80; 318318，Biolegend）和细胞在4°C下孵育30分钟。染色的记忆B细胞与BD FACS ARIA III（BD Biosciences）单细胞组合成384孔板，该平板含有3T3-CD40L馈线，并与先前所述的25天与IL-2和IL-21孵育14天。

　　如前所述5，ELISA检测到对S蛋白夹子的mAb和血浆结合特异性。简而言之，将384孔板（微孔板透明，Greiner Bio-One）涂上3 µg/ml链霉亲和链霉素（Thermo Fisher），在碳酸盐 - 双氯酸盐盐缓冲液中稀释（E107，贝尔特基实验室），并在室温过夜孵化。第二天，将板在室温下与3 µg/ml的SARS-COV-2 S蛋白孵育1小时。然后，在37°C下，将板用封闭缓冲液（磷酸盐缓冲盐水和1％BSA）的50 µL饱和1 h。封闭后，将每孔的单单元孔25 µl稀释在样品缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，1％BSA和0.05％Tween-20）中，并将其添加到板上，并在37°C下孵育。测试了从疫苗衍生的血浆样品（在样品缓冲液中的1:10的起始稀释度；在样品缓冲液中的1：2稀释），最终体积为每孔25 µl，并在37°C下孵育。孵育1小时后，加入了样品缓冲液中1：2,000稀释的碱性磷酸酶偶联山羊抗人IgG和IgA（南部生物技术）的25 µl。最后，使用每孔的PNPP（pN硝基苯基磷酸盐； Thermo Fisher）检测到S蛋白结合，并通过Varioskan Lux Reader（Thermo Fisher Scientific）在405 nm的波长下测量反应。在每个孵育步骤之后，用每孔洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲盐和0.05％的Tween-20）将板洗涤3次。样品缓冲液用作空白，样品阳性的阈值设置为空白的光密度（OD）的两倍。对MAB进行了技术重复，并为血清样品进行了一式三份。

　　ELISA对MABS和血浆筛选对RBD，NTD或S2 SARS-COV-2蛋白进行了鉴定。简而言之，将3 µg/mL的RBD，NTD或S2 SARS-COV-2蛋白稀释在碳酸盐 - 双碳酸盐缓冲液中（E107，贝尔特基实验室）中的384孔板（微孔层透明，薄饼，GRINER BIO-ONE）。在4°C下孵育过夜后，用洗涤缓冲液（磷酸盐缓冲盐和0.05％Tween-20）洗涤板，并在37°C下用阻止缓冲液（磷酸盐缓冲液和1％BSA）用50 µL封闭。洗涤后，将板在样品缓冲液（磷酸盐缓冲盐水，1％BSA和0.05％TWEEN-20）中与1：5稀释的mAB在37°C下孵育1小时，或在样品缓冲液中稀释1：2的起始稀释时等血浆。未添加样品的井是空白对照。然后加入1：45,000在样品缓冲液中稀释的山羊（Sigma）中产生的抗人IgG-过氧酶抗体（特异性），然后将样品在37°C下孵育1小时。然后将板洗涤，将板与TMB底物（Sigma）一起孵育15分钟，然后再添加停止溶液（H2SO4 0.2 m）。使用450 nm的Varioskan Lux读取器（Thermo Fisher Scientific）鉴定了OD值。如果OD值是空白的双重，则以一式三份测试每个条件，并测试的样品被认为是阳性的。

　　为了根据其与S表位的相互作用对MAB候选物进行分类，我们根据制造商的说明，将磁珠（Dynabeads His-Tag，Invitrogen）涂上了磁珠（Dynabeads His-Tag，Invitrogen）。然后，将20 µg/ml涂层的S蛋白珠与未标记的NAB候选物预孵育1：2在PBS中稀释40分钟，在室温下40分钟。孵育后，将混合珠 - 抗体用100 µL的1％PBS-BSA洗涤。然后，为了分析表位竞争，S蛋白的NTD（4A8）或S2域（L19）的MAB被用四种不同的荧光团（使用Alexa Fluor 647、488、594和405）标记为S蛋白的NTD（4A8）或S2域（L19）（使用Alexa fluor ando ando ando ando ando ando contric ando and and and ando ando ando and and and and ands and and and and and and ands ands ands ands and and ands and。蛋白珠。在室温下孵育40分钟后，将混合珠 - 抗体用PBS洗涤，重悬于150 µL的1％PBS-BSA中，并使用BD LSR II流式细胞仪（Becton Dickinson）进行分析。带有或不具有S蛋白的珠与标记的抗体混合物孵育分别用作阳性和阴性对照。FACSDIVA软件（版本9）用于数据采集，并使用FlowJo（版本10）进行分析。

　　所有SARS-COV-2正宗病毒中和测定均在锡耶纳（意大利）Toscana Life Sciences的生物安全3级（BSL3）实验室中进行，并在意大利（意大利）（意大利）进行Vismederi SRL。BSL3实验室经认证的生物安全专业人员批准，每年都会受到地方当局的检查。为了评估针对SARS-COV-2和所有VOC的NAB的中和活性，并评估了该抗体中和的广度，进行了CPE-MN5。简而言之，对于基于CPE的中和测定，我们与SARS-COV-2病毒溶液共孵育J08，该溶液中含有100个中位组织培养的感染剂量（100 TCID50）病毒，并在37°C下孵育1小时后，5％CO2。然后将混合物添加到一个96孔板的孔中，该井中含有亚含量E6细胞单层。将板在37°C下在具有5％CO2的加湿环境中孵育3-4天，然后通过两个独立操作员通过倒置光学显微镜检查CPE。所有NAB均以1：5的起始稀释度进行了测试，并根据其初始浓度评估IC100，而血浆样品则从1:10稀释开始测试。然后将NAB和等离子体样品逐步稀释1：2。对NABS和血浆样品进行了技术重复。在每个板中，如先前所述5。

　　The SARS-CoV-2 viruses used to perform the CPE-MN neutralization assay were the original SARS-CoV-2 virus first detected in Wuhan (SARS-CoV-2/INMI1-Isolate/2020/Italy: MT066156), SARS-CoV-2 B.1.1.7 (INMI GISAID accession number: EPI_ISL_736997), SARS-CoV-2 B.1.351（逃避COD：014V-04058），B.1.1.248（逃脱COD：014V-04089）和B.1.617.2（Gisaid ID：Epi_isl_2029113）26。

　　如前所述5进行了NABS重链和轻链恢复，放大和转录活性PCR（TAP）表达的整个过程。简而言之，将5 µL的细胞裂解物与1 µL随机六聚体引物（50 ng/µl），1 µL DNTP-MIX（10 mm），2 µL 0.1 M DTT，40 U/µL RNase OUT，MGCL2（25 mm），5×FS BUFFERS BUFFER IV（25 mm），40 u/µl RNase OUT（5×）RT – PCR。在42°C下进行逆转录（RT）反应，持续10分钟，25°C 10分钟，50°C 60分钟和94°C进行5分钟。进行了两轮PCR，以获得重（VH）和光（VL）链扩增子。所有PCR均在无核酸酶水（DEPC）中进行，总体积为每孔25 µl。对于PCR I，将4 µL cDNA与10 µm的VH和10 µM VL引物混合物，10 mM DNTP混合物，0.125 µL KAPA远程聚合酶（Sigma），1.5 µL MGCL2和5 µL的5×KAPA长距离范围混合。PCR I反应在95°C下进行3分钟，在95°C下进行5个循环30 s，57°C 30 s，72°C 30 s，在95°C下30 s，60 s，60 s，60 s，72°C 30 s，72°C 30 s，最后延伸30 s，最终延伸为72°C，为2 min。从3.5μl未纯化的PCR I产品开始进行嵌套的PCR II。根据制造商的说明，通过Millipore MultiscreenPCRμ96板纯化PCR II产物，并在30μl无核酸酶的水（DEPC）中洗脱。至于TAP表达，最初使用限制酶Agei，Sali和Xho消化了矢量，如先前所述，PCR II产物通过使用Gibson Assembly Neb进入25 ng的25 ng人类Igγ1，Igγ1，Igκ和Igλ表达量为27,28。使用5μLQ5聚合酶（NEB），5μLGC增强子（NEB），5μl的5倍缓冲液，10 mm的DNTP，0.125 µL的正向/反向引物和3μL连接产物，使用以下循环为98°C 98°C，使用TAP反应进行TAP反应。 72°C持续1分钟和72°C 5分钟。在相同的PCR II条件下纯化TAP产物，并通过制造商的说明按照量子荧光定量测定法（Invitrogen）量化，用于在Expi293f细胞系中进行瞬时转染。

　　使用CLC序列查看器（Qiagen）手动策划并检索了NAB的VH和VL序列读取。从数据集中删除异常序列。分析的读取以FastA格式保存，并使用Cloanalyst（http://www.bu.edu/computationalimmunology/research/software/software/)29,30进行曲目分析。

　　使用GraphPad Prism版本8.0.2（GraphPad软件）评估统计分析。非参数Mann – Whitney t检验用于评估本研究中分析的两组之间的统计意义。统计显着性显示为*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。