胶囊采样设备（CapScan，Envivo Bio）由一个由单向阀盖住的空心弹性收集膀胱组成。该设备是通过撤离收集膀胱，将其折成两半，并在可溶解的胶囊内折叠的设备来准备包装，该设备的直径为6.5毫米，长度为23毫米，将其涂抹在肠上涂上肠涂层。胶囊和肠涂层可防止摄入期间口服 - 咽和胃微生物的膀胱收集肿瘤。当设备到达目标pH时，肠涂层和胶囊分解。对于类型2和类型4的2型和7.5的目标pH为5.5，而第4型的目标pH为2和7.5，而4型和类型4也具有时间延迟涂层，以偏向升级为升高。肠涂层分解后，收集膀胱展开并膨胀成直径6毫米的管子，长度为33毫米，从而通过单向阀绘制高达400 µL的肠道内含物。当设备通过结肠移动并暴露于凳子时，单向阀维持收集膀胱内收集的样品的完整性。

　　在这项研究中，参与者同时摄入了四个设备的集合，每个设备都带有不同的涂层，以针对小肠的内侧区域（涂层类型1和2）和更多的远端区域（涂层类型3和4）。采样后，设备在凳子中通过标本收集容器，并立即冷冻。抽样完成后，凳子解冻，并由研究人员检索设备。将弹性收集膀胱在70％的异丙醇中冲洗，并用附着在1-ML注射器上的无菌皮下注射针刺穿，以清除样品。将样品转移到微输出管中，并用INLAB Ultra Micro ISM pH探针（Mettler Toledo）测量pH。在10,000 rcf的情况下，将40 µL等分试样旋转3分钟，其上清液用于代谢组学分析，同时将颗粒用于蛋白质组学分析。将其余样品冷冻直到解冻以提取DNA。

　　该研究得到了Wirb-Popernicus集团机构审查委员会（研究1186513）的批准，并从每个参与者那里获得了知情同意。选择健康的志愿者排除患有临床可检测到的胃肠道状况的参与者或可能会干扰数据获取和解释的疾病。没有确定样本量的盲目，随机化或统计方法。

　　参与者符合以下所有研究包含的标准：（1）18至70岁的年龄；（2）美国麻醉师学会（ASA）身体状况类别1或2的风险；（3）对于生育潜力的妇女，在筛查后的7天内进行了负尿液妊娠试验，并且在整个研究期间愿意使用避孕措施；（4）流利的英语，了解研究方案和提供知情书面同意的能力以及遵守研究要求的能力。

　　Individuals with any of the following conditions or characteristics were excluded from the study: (1) a history of any of the following: prior gastric or oesophageal surgery, including lap banding or bariatric surgery, bowel obstruction, gastric outlet obstruction, diverticulitis, IBD, ileostomy or colostomy, gastric or oesophageal cancer, achalasia, oesophageal diverticulum, active吞咽困难或耳尾或用于任何胃肠道疾病的主动用药；（2）在筛查或母乳喂养后30天内怀孕或计划怀孕；（3）任何形式的活性药物滥用或依赖（包括药物或酗酒），任何不稳定的医学或精神病障碍或研究人员认为可能会干扰研究的行为的任何慢性病；或（4）在研究人员的判断中，临床状况可能在研究参与研究时可能对个人构成健康风险。

　　这项研究招募了15个健康个体，每个人在3天的过程中至少吞咽了17个设备（有关人口统计，请参见补充表1）。每日指示包括以下准则：记录所有食物以及它们全天消耗的时间；如果您锻炼身体，请在早上进行；像往常一样吃早餐和午餐；午餐后3小时吞下一套四个设备，最多三分之二的杯水；吞下设备后，至少2小时不要吃或喝任何东西；如果在2小时后饿了，请轻轻零食（最多200卡路里）；午餐后不要喝任何含咖啡因的饮料，直到第二天早上；吞咽这组设备后，从6小时开始收集所有凳子，直到吞咽下一组设备后48小时。午餐后至少6小时照常吃晚餐；晚餐后3小时，用三分之二的杯水吞下一组四个设备；吞下这套套装后，请不要在早晨吃或喝任何东西。饮酒和饮食含量不受限制。回收了所有摄入的设备，并且在研究期间没有报告不良事件。在255个摄入的设备中，有15个设置了1个安全装置（不包括在分析中），22个包含气体或较低的样品体积。晚餐后收集唾液样品，并在–20°C下立即冷冻。参与者在-20°C下立即冷冻研究期间每个肠运动的样本。共有306个样品（n = 29个唾液，n = 218个设备，n = 59凳子）提供了足够的材料用于多摩变分析（扩展数据图2A）。此外，参与者1提供了用于评估可复制性和微生物开花的其他样本。

　　为了评估体内孵化对样品收集和样品检索时间之间设备内容物的影响，参与者1摄入了一组四个设备（每种类型的设备之一）。在32小时内退出肠道后，将设备立即转移到anaerobic腔室中，并在37°C下孵化。每个样品的等分试样在32小时（排便后立即），58 h和87 h（后两个时间点模拟较长的肠道运输时间）。这些等分试样接受16S rRNA基因扩增子测序。32 h，32小时的30个最丰富ASV的排名丰度在58小时时以8-16等级的中位数和12-30级的等级移动（扩展数据图1）。在孵育期间从下方增加到检测极限的9–17 ASV共同考虑了58小时后的相对丰度为9.4-13.8％，在87小时后，相对丰度为9.4-13.8％，大概是由于孵育期间的增长而在87小时后5.2–18％。因此，尽管产物可能会改变对微生物群组成的评估，但预期的过渡时间〜58 h或更少。

　　使用瓣膜（1：1：1凡士林：羊毛蛋白：石蜡）密封带有BHI培养基的琼脂糖（1％）垫，并使用加热的环境室（Haisontech）保持在37°C。使用µmanager（v.1.4）42，在尼康Ti-e落叶显微镜上收集了相对比图像。

　　在240台设备中，有218个收集> 50 µL肠液，并经过DNA提取，16S rRNA基因和元基因组测序；其余的采样 <50 µl or were filled with gas, most likely from the colon.

　　For the 218 devices that sampled >使用微生物DNA提取试剂盒（QIAGEN）43和50 µL从设备，200 µL唾液或100 mg凳子中提取DNA。

　　使用Earth Microbiome Project-Reconcommented 515F/806R引物对和5prime HotmasterMix（Quantabio，Cat。No。2200410）使用以下程序在热循环器中生成16S rRNA扩增子。35个94°C的35个循环45 s，50°C 60 s和72°C 90 s;和72°C持续10分钟。使用UltraClean 96 PCR清理套件（Qiagen，Cat。No。12596-4）和Quant-IT DSDNA高敏化测定试剂盒（Invitrogen，Cat。No。Q33120）清洁，定量和合并PCR产品。在Miseq仪器（Illumina）上用250 bp读取样品。

　　使用Chan Zuckerberg Biohub测序设施的Illumina Bcl2fastq算法对序列数据进行反复。随后的处理使用R统计计算环境（v.4.0.3）44和DADA2，如前所述43使用伪 - 释放45。Trunclenf和Trunclenr参数分别设置为250和180。使用SILVA RRNA数据库（V.132）46分类分类法。保留具有> 2500次读取的样品进行分析。我们从210个样本中获得了足够的测序读取，这是后续分析的重点，以及来自29个唾液和58个粪便样品的测序数据（一个参与者只提供了一个唾液样本，一个粪便样本的测序读数不足；扩展数据图2A）。

　　如前所述47，使用Phangorn构建系统发育树。使用Thyloseq :: estimate_richness函数计算香农多样性，这是素食::多样性函数的包装器48,49。由于肠道样品通常由单个ASV支配（图2C），因此堪培拉距离度量标准用于成对β多样性比较。仅在≥5％的样品中以≥3个读取的455个ASV用于计算距离。

　　我们研究的一个局限性是，不能清楚地定义或验证肠内样品收集的确切位置。正常消化过程中肠蠕动和pH的变异性可能导致集合中的设备经历不同的pH梯度。因此，它们可能在预定的收集站点之前或之后打开。尽管有这一限制，但对15个个体的210个肠道样本的分析表现出人类肠中生化和微生物活性的一致趋势。在以后的研究中，可以通过以定时方式将多个顺序样品收集到单个设备中，沿纵向梯度进行更一致的采样。

　　与粪便样品相比，肠道中明显不同的胆汁酸谱图表明，在过境或样品回收过程中，粪便不太可能污染肠道采样装置。但是，由于沿着肠道的微生物密度大大增加，即使是微小的粪便污染也可能影响微生物群的组成。因此，我们使用统计方法来识别基于微生物群落组成的样本可能污染的样本。鉴于肠道的定向运动，人们会期望肠道和粪便微生物群落之间的内在重叠。使用主题模型R Package50的潜在DIRICHLET分配用于识别每个参与者的肠和粪便样本中的同时出现的微生物组（“主题” 51）。对于每个肠道样本，计算了从同一参与者的粪便中得出的主题的累积概率。≥10％的设备样本被确定为可能源自粪便主题的总社区的样本可能被标记为可能受到污染。使用这个非常保守的定义，有210个具有足够测序读数计数的肠样品中的38个（来自研究参与者的12个）被确定为可能受到污染。这项研究中提供的所有分析都使用所有可用数据来避免偏见，但是在删除了38个样本后，对所有数据进行重新分析，这些样本显示出任何潜在的粪便污染信号导致与完整样本组相同的统计趋势。

　　从所有样品中提取的DNA均在384孔板中排列，并在使用PICOGREEN DSDNA定量试剂盒（Thermofisher）定量后将浓度归一化。将DNA添加到标记反应中，在55°C下孵育10分钟，并立即中和。将混合物添加到附加Illumina引物和识别条形码的PCR的十个周期中，以允许在测序过程中汇集样品。汇总了每个井的一个微标准，并使用Ampure XP珠两次纯化了合并的库，以选择适当尺寸的频段。最后，使用Qubit仪器（Thermofisher）定量库浓度。测序是在读取长度为2×146 bp的Novaseq S4仪器上进行的。

　　串（V.0.2.2）52用于去除光明适配器，然后用bowtie2（v.2.4.1）53去除人类读数。从单个唾液，肠道或粪便样品中的宏基因组读物与巨麦（V.1.2.9）54组装。将组装的重叠群与metabat 2（v.2.15）55（v.2.15）归为7,655个基因组箱。CheckM（V.1.1.3）56和Quast（V.5.0.2）57用于评估质量；垃圾箱> 75％完整性和 <25% contamination were dereplicated at 99% ANI (strain level) with dRep (v.3.0.0)58, resulting in 696 representative MAGs across all samples. GTDB-Tk was used to assign taxonomy59. Default parameters were used for all computational tools.

　　Isolates were obtained directly from samples or from communities derived from passaging of samples60 by either plating or fluorescence-activated cell sorting (FACS)61. For plating, samples were serially diluted tenfold onto BHI + 10% defibrinated horse blood (BHI-blood) plates and incubated for 72 h at 37 °C in an anaerobic chamber. Single colonies were re-streaked onto BHI-blood plates. This process was repeated an additional two times to ensure that the colony was axenic. Single colonies were then picked into a 2-ml deep-well plate containing 500 µl of BHI supplemented with menadione (vitamin K), cysteine and hemin (BHIS). In certain cases, Reinforced Clostridial Medium supplemented with menadione (vitamin K), cysteine and hemin (RCMS) was used instead. For FACS, single cells were sorted into BHIS using a previously described protocol that allows for isolation of strict anaerobes61.

　　After 72 h of growth in an anaerobic chamber at 37 °C, frozen stocks of all isolates were made using a final concentration of 12% glycerol. To identify isolates, cultures were spun down and pellets were resuspended with PCR-grade water in a 1:1 ratio. The primers 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ and 5′-GACGGGCGGTGWGTRCA-3′ were used to amplify the 16S rRNA gene. The PCR product was sent for Sanger sequencing, and sequences were filtered using sangeranalyseR with default parameters62. These sequences were searched against the rRNA/ITS BLAST database, and the top species hit was used to identify the strain.

　　Putative genes were called on assembled contigs for each sample or on assembled MAGs using Prodigal63. CAZyme genes were identified using run_dbcan.py (v.3.0.5)64 with default parameters (searching with HMMER, eCAMI and DIAMOND). Genes identified in at least two of three programmes were dereplicated to create a curated database. metagenomic reads for each sample were mapped against this database to calculate the percentage of reads mapped. AMR genes were identified using rgi (v.5.2.0)28 with default parameters. All identified genes were filtered for >90％的覆盖范围并进行了解复，以创建AMR基因的策划数据库。每个样品的宏基因组读数都针对此数据库映射，以计算映射的读取百分比。

　　已知卡与诸如Escherichia/shigella topl28等病原体有偏见，而实际上，大肠含量/志贺氏菌种的相对丰度与肠样品中的AMR基因的丰度高度相关（扩展数据图5H）。在粪便样品中，尽管没有ASV与与卡的读数的百分比呈正相关，但肠杆菌科家族的丰度与菌心科家族的相关性呈正相关（扩展数据图5i）。为了确定这种相关是否是由外排活动驱动的，我们重新计算了AMR基因丰度，同时忽略了注释为外排泵的1,273个基因。在此分析中，肠样品没有显示出映射到非效能AMR基因的读取数量明显更高（扩展数据图5J）。我们确定了每个MAG中的AMR基因，发现肠杆菌科具有比其他分类学家族多约10至100倍的AMR基因（归一化为基因总数）（扩展数据图5K）。

　　组装后，使用VirSorter2（参考文献65），DeepVirfinder66和充满活力的67分析重叠群> 1 kb。至少通过一种算法识别为病毒的重叠群（VirSorter2评分≥0.9或DeepVirfinder评分≥0.9和P< 0.05, or VIBRANT score of medium quality or higher) were clustered using an ANI cut-off of 0.95 and coverage cut-off of 85%. The quality of the clustered contigs was analysed using CheckV68, which also classified viral contigs as prophages if they contained both viral and bacterial regions.

　　The algorithm PropagAtE69 was used to identify active prophages with default parameters. In each sample, the total reads were first rarefied so that the number of reads mapped as viral was 5 × 105 (six device samples and ten saliva samples had fewer than 5 × 105 reads, and hence all reads from these samples were used for analyses). The reads were then mapped to the prophage contigs with a minimum per-cent identity of 97%. The algorithm identifies a prophage as active (induced) when the ratio of prophage to host depth for that contig is >2和预言区的覆盖率> 50％。

　　解冻样品后，将20 µL MS级水（Pierce）添加到每个样品中，并将混合物涡流。将二十个混合物转移到96孔板上（AFA-Tube TPX板，Cat。No。520291，Covaris）。在每个样品等分试样中添加了20微透明的细胞裂解缓冲液（含有TRI，CAA，TCEP和8％SDS）9，并在PCR热环生（Eppendorf）中将样品煮沸10分钟，以还原二硫键铜管和二硫化硫酸盐和烷基化，以促进肠环和烷基化。煮沸后，将样品放在-80°C的冰箱中，以确保微生物囊解离。冻结 - 透射循环重复两次。随后，使用APAC协议（https://d24ci5y4j5ezt1.cloudfront.net/wp/wp/wp/wp-content/uploads/2020/06/06/m020141.pdf）处理样品。简而言之，我们使用以下参数使用LE220-POSE LE220-POSIC POOKE ULTASONITOR（COVARIS），在96孔板中应用自适应聚焦的声学（AFA，Covaris）超声处理，总持续时间为300 s。占空比50％；周期，200；平均功率，225 W.

　　为了准备蛋白质聚集捕获（PAC），用1 mL MS级水洗涤了三次磁羧酸盐改性颗粒（Sera-Mag，Cat。No。24152105030，GE Healthcare/Merck）。由于样品的蛋白质浓度在较大范围内变化，因此将500 µg的珠子添加到每个样品中，以确保足够的珠子，无论蛋白质浓度如何。通过在最终浓度为70％的情况下添加乙腈来诱导蛋白质沉淀。

　　随后通过磁颗粒的沉淀从溶液中提取蛋白质，并通过在2-异丙醇中洗涤三个步骤纯化。每次洗涤后，将板放在50°C下，并以1,300 rpm摇动10分钟。为了确保完全沉淀，我们在室温下再孵育10分钟，同时以1,300 rpm的速度摇动，然后允许珠子沉降10分钟而无需搅拌。

　　为了确定样品消化过程中所需的酶的浓度，我们使用纳米球体测量了蛋白质的产量。然后将样品重悬于消化缓冲液中，其中包含100 µL的100 mM Tris（pH 8.5），并补充了0.5 µg胰蛋白酶和0.5 µg lysc，以达到1:20的酶：蛋白质比为1:20，并在37°C下在1,300 rpm时在37°C下孵育过夜。

　　Following digestion, the supernatant was removed by placing the 96-well plate on a magnetic rack (DynaMag-96 Side Skirted Magnet, cat. no. 12027, Invitrogen, ThermoFisher Scientific), allowing the supernatant to be easily transferred to a 96-well PCR plate (twin.tec PCR Plate LoBind, semi-skirted, 250 µl; cat. no.0030129504，eppendorf）。使用三氟乙酸（TFA）以1％（v/v）的最终浓度将收集到的上清液中的酶促反应淬灭。使用两层SDB – RP（Empore SPE磁盘； CDS Analytical，Cat。No。98-0604-0226-4）纯化肽，通过三个洗涤步骤，两次洗涤步骤，在2-异丙醇中为1％TFA，在水中进行0.2％TFA。遵循洗涤步骤，使用洗脱缓冲液（80％乙腈和1％NH4+）从Stagetips洗脱肽70。将纯化的样品在60°C的Speedvac（Eppendorf）中真空干燥1.5 h，并重悬于*注射缓冲液中（2％（V/V）乙腈和0.1％（水中的V/V）TFA）。使用纳米旋转在每个样品的注射缓冲液中测量蛋白质浓度，并将样品存储在-20°C直至MS测量。

　　使用LC-MS仪器分析样品，其中包括一个易于NLC 1200超高压系统，该系统与Exploris 480搭配使用纳米电喷雾离子源（Thermofisher Scientific）。对于每个样品，在自定义的50 cm C18 LC列71上分离了360 ng纯化的肽。在90分钟内，使用线性梯度从10％到30％的缓冲液以300 nl min -1的恒定梯度从色谱柱洗脱肽，然后在接下来的5分钟内将缓冲液B逐步增加到60％，持续5分钟，增加到95％的缓冲液B。之后，我们使用95％缓冲液B进行了5分钟的洗涤，然后在5分钟内降低到1％的缓冲液B和20分钟的洗涤液。

　　使用自定义烤箱在50°C下保持圆柱温度，并使用SprayQC Software实时监测HPLC参数72。使用TOP15数据依赖性MS/MS方法获取MS数据。全扫描MS光谱的目标值在M/z范围300–1,650中为3×106电荷，最大注射时间为20 ms，在M/z 200时分辨率为60,000。前体离子的片段化通过高能量的C-trap rapiation（HCD）进行，并具有27 ev的正常碰撞能量。MS/MS扫描以M/Z 200的15,000分辨率进行，目标值为1×105，最大注射时间为28 ms。将动态排除设置为40 s，以避免重复对相同肽的测序。

　　大约每70个样品运行HELA样品，以确保在整个研究中保持LC系统的性能和MS的性能。为每个板以随机方式收集技术复制，以评估技术可重复性。总共有212个设备样品和56个粪便样品通过了质量控制，并用于分析（扩展数据图2A）。

　　使用Maxquant软件（V.2.1.0.0）73分析MS RAW文件，并针对Uniprot人类SwissProt和Trembl Fasta数据库（2022年6月）搜索肽列表。还包括一个常见的污染物数据库74。我们的搜索参数包括半胱氨酸氨基甲基化作为固定修饰，N末端乙酰化和蛋氨酸氧化作为可变修饰。蛋白质和肽的假发现率（FDR）以7个氨基酸的最小肽长度设置为0。使用一个内硅胰蛋白酶摘要，最多有两个错过的裂解位点。以7 ppm的前体质量精度和20 ppm的片段质量精度进行肽鉴定。使用反向的诱饵数据库来估计假命中率的比例。以最小比率为2（参考文献75）进行无标签定量（LFQ）。在指示时，LFQ值或非正常的强度值在R中进一步处理（v.4.1.2）。在所有样品中，对蛋白质的有效值70％过滤。对于PCA，使用软件包MISSMDA（v.1.19）的正则化方法估算缺失值，并使用PCATOOLS生成PCA图（v.2.4.0）。使用Limma（V.3.48.3）进行统计分析，并进行了带有FDR调整的调节t检验，以进行多种假设测试。

　　使用改良的96孔板双相提取76提取肠样品的上清液76。在冰上解冻微量离心管中的样品，并将10 µL转移到预定的随机阶的2 ml聚丙烯96孔板的孔中。由试点研究中的许多肠样品组成的质量控制样本用于评估分析变异。每个样品都包括质量控制样品基质（10 µL）和空白（10 µL LC-MS级水）。此外，将170 µL含有最终的甲醇甲醇作为内标添加到每个孔中。然后，将490 µL含有内标准胆固醇酯22：1的甲基-TERT叔丁基（MTBE）添加到每个孔中。将板密封，将涡旋剧烈30 s，然后在4°C的轨道摇动板上摇动5分钟。取消密封板，并将150 µL冷水添加到每个孔中。将板重新密封，将涡流剧烈30 s，并在4,000 rcf下在4°C下离心12分钟。

　　从提取井的顶相中，将两个等分试样的180 µL转移到新的96孔板上，并且将两个从底相的等分试样转移到另外两个新的96孔板上。板在旋转真空中旋转，直到干燥，密封并在-80°C下储存，直到LC -MS/MS分析。将含有提取物水相的96孔板之一溶解在35 µL的Hilic-run溶剂（8：2乙腈/水）中。使用非靶向的Hilic LC – MS/MS分析分析了五个微量液。将自动采样器温度保持在4°C。在Hilic分析后，立即将96孔板旋转在旋转真空中，直到干燥，密封并在-80°C下储存，直到靶向胆汁酸分析。

　　准备多种稀释液进行胆汁酸分析，如下所示。将上述干燥的样品溶解在60 µl胆汁酸性溶剂（1：1乙腈/甲醇中，含有六个同位素标记的胆汁酸标准液在100 ng ml – 1下）通过30 s的涡旋，在轨道振荡器上摇动5分钟。从该板上，将5 µL转移到新的96孔板上，并与145 µL胆汁酸跑的溶剂结合使用。分析了所有样品的两种稀释液，并将仍然呈现出高于标准曲线浓度最高的胆汁酸（1,500 ng ml – 1）的样品再次稀释5：145并重新分析。所有样品均使用9点标准曲线，范围为0.2 ng ml – 1至1,500 ng ml – 1。标准曲线溶液是通过干燥胆汁酸标准溶液来达到所需的胆汁酸标准质量，然后溶解在胆汁酸运行的溶剂中的。在数据采集期间每20个样品以及一个方法空白后，每20个样品后分析了三个标准曲线浓度测量。

　　为了进行粪便分析，将大约4 mg（±1 mg）的湿凳子转移到2 ml微输出管中。将二十微升的质量控制混合物添加到微量离心管中以进行质量控制样品。使用20 µL LC – MS级水生成空白样品。在每个管中，添加了225 µL含有内部标准标准的冰冷甲醇（如上所述），然后是750 µl冰冷的MTBE，胆固醇酯22：1。将两个3毫米不锈钢研磨珠添加到每个管中，并在Geno/Grinder自动化组织均匀剂中处理试管，并以1,500 rpm的速度加工1分钟。然后，将188 µL冷水加入每个管中。将试管剧烈涡旋，并以14,000 RCF离心2分钟。将两个等分试样为180 µl的MTBE层和两个等分试样，将下层的两个等分试样转移到四个96孔板上，并将板旋转在旋转真空中，直至干燥，密封并在-80°C下储存，直到用肠子分析。使用Hilic非靶向LC-MS/MS分析粪便样品，并以相同的方式稀释至肠样品，如上所述。肠样品后以随机顺序分析粪便样品。

　　使用与TSQ Altis三肢质量光谱仪（Thermofisher Scientific）耦合的征服UHPLC系统分析样品。具有生动性Beh C18防护柱（1.7 µm，2.1 mm×5 mm）的生动性Beh C18列（1.7 µm，2.1 mm×100 mm）与移动阶段A（LC-MS-MMS级水具有0.1％Formic Acid）和B（LC-MS级别的乙酸含量为0.1％）的A型和4％的A acigy and a c18 beh c18守卫柱（1.7 µm，2.1 mm×5 mm）与4.1％的actic a和0.1％的actic a和4％的A含量进行色谱分离。柱温度为50°C。该梯度在20％B开始1分钟开始，在1到11分钟之间转移到45％B，在11至14分钟之间的95％B，在14至14.5分钟之间，至99％B；将99％的B维持到15.5分钟，并在15.5至16.5分钟之间过渡至20％B；并保持20％B直到18分钟。将自动采样器温度保持在4°C。注射体积为5 µL，并为所有胆汁酸和内部标准收集了MRM扫描（补充表6）。

　　MRM扫描被进口到Skyline77软件。天际线对所有分析物进行了峰值整合，并使用真实的化学标准进行了优化的质量转换和保留时间窗口（补充表6）。手动检查每个分析物的色谱图，以确认正确的峰积分。所有分析物都导出了峰面积。如果在≥1个样品中未观察到令人信服的色谱峰，则从进一步分析中省略了分析物（补充表6）。计算并用于定量分析物与其最接近洗脱的内标。线性模型适合每个胆汁酸的标准曲线点（所有胆汁酸R2> 0.995），并将模型应用于所有样品和空白以计算浓度。从样品浓度中减去了方法空白的平均浓度。由于每个样品分析了多种稀释液，因此使用了最接近标准曲线中心（750 ng ML – 1）的测量值。将零值归为0.001至0.1 ng ml – 1。据报道，肠道样品液体上清液的浓度为NG ML – 1，而湿凳子的浓度为Ng G – 1。总共有218个设备样品和57个粪便样品通过了质量控制，并用于分析（扩展数据图2A）。

　　与氨基酸结合的胆汁酸（例如，牛油菌，leuca和苯基苯）未包括在列表中进行靶向分析。尽管如此，如前所述，使用Hilic色谱法在非目标数据采集中检测到22个微生物共轭胆汁酸。78。使用M/Z值进行前体质量，诊断性MS/MS片段离子（三羟基化的337.2526）和339.2682的M/Z值，对对应于这些微生物共偶有的胆汁酸，二羟基化的胆汁酸和相应的对相应的偶性片段片段片段（补充4）。MS/MS光谱来自三个微生物共轭胆汁酸的合成标准标准（图9扩展数据），基于先前收集的实验性MS/MS Spectra35，作为阳性对照。非靶向的HILIC分析不包括胆汁酸标准曲线以允许直接定量，因此通过将靶向分析的GCA浓度与非靶向分析的GCA峰高强度进行比较来实现近似定量。二次模型拟合到两个分析（R2 = 0.89）的GCA值，并应用于微生物偶联的胆汁酸的峰高强度值以计算其近似浓度。近似浓度用于分析通过非靶向分析测量的胆汁酸。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。