我们使用rpxdock20,21从BGL17_A32同型聚合物中生成了碱基T = 1四面体，八面体和二十面体笼，以样品沿三倍笼子（补充信息3）沿三倍笼子沿三倍笼子的旋转和平移位移进行样品旋转和翻译位移。我们发现，对于不同的对称性，不同数量的重复单位（1.5、2.5和3.5重复单位分别用于四面体，八面体和二十面体笼子）是最佳的，对于对接具有良好形状互补性的三聚体的对接器（图3a，b，e，e，e，e，e，e，i，i，i，j，j，j and j and j and j and j and g，i，i，i，j和补充信息3.1）是最佳的。新生成的笼界面是使用蛋白质MPNN22设计的，设计模型的AF2预测小于2.0Å根平方偏差（RMSD）以进行实验表征；这些包含七个四面体笼子（TETT = 1-1到TETT = 1-7;补充表5），有12个亚基和大约13 nm的直径，8个八个板笼，八个八面的笼子（octt = 1-1至1-1至Octt = 1-8;补充表6;补充表6），有24个亚基和直径= 20 nm，4 iCos = 1-4 iCot = 1-4 iCot = 1-4 iCot = 1-1- iCot = icot = 1-47）60个亚基和大约40 nm的直径。所有四面体设计在SEC上的预期保留量（补充图20）和四个（TETT = 1-1，TETT = 1-2，TETT = 1-2，TETT = 1-4和TETT = 1-6）的峰值在结构上是NSEM在结构上均匀的（扩展的数据1和2D级别的图1），图3D和图3D nsem nsem and septiraling图3D和3D-3D-sestires and 3D-sonstruction and 3D-sonst（2D）。21）匹配设计模型（图3b，c）。八面体笼中的七个在SEC上具有单个峰，而两个（OCTT = 1-2和OCTT = 1-4）显示出与NSEM相匹配的设计模型的同质结构（图3F，G和补充图22和23）。ICOT = 1-1的二十面体笼子上有一个峰值，在SEC上有一个峰值，并且与NSEM接近设计模型（图3J，K），尽管也观察到了不完美的笼子 （补充图24）。

　　We next extracted C3, C4 and C5 symmetric cyclic oligomers (which we refer to as crowns because of their shape) from the structurally confirmed T = 1 cages by substituting in the structurally identical pseudosymmetric hetBGL0-18-17_A32 heterotrimer in place of the BGL17_A32 homotrimer (Fig. 1, third and fourth columns).使用ProteinMPNN对链A（CH_A）和CH_B接口进行重新设计，以在冠状三聚体界面相互作用；这是避免使用原始C2界面的潜在脱靶结构所必需的（补充图25）。CH_C的臂表面从冠上向外指向，重新设计为完全极性。这将牙冠隔离为独立的构件，可在下一步中用于构建t = 4个笼子。我们选择了AF2预测RMSD <2Å的CH_A – CH_B接口的设计，并且无法预测CH_A – CH_A或CH_B – CH_B – CH_B同二聚体接口形成（补充图19）。我们获得了通过这些过滤器的19套冠（Crownc3-1 to CrownC3-5的CCRCORC3-5，CrownC4-1）的基因，Crownc4-1 to Crownc4-7用于C4冠，Crownc5-1 to Crownc5-1 for CCrownc5-7 for C5 Crowns;补充表8-10），每个皇冠的三个链条分别在独立的Coli Corpires中分别分别为独立的Coli Corceli Corceli Corperies。表达后，通过SDS-PAGE凝胶密度法估计了每种蛋白质的量，并将适当量的培养物结合在一起，以与三个链的化学计量量相结合，这些链被共结合并共纯化。到SEC，五个C3中的四个，七个C4中的五个和七个C5冠中的二个在预期的洗脱体积（补充图26-31）上具有峰值，其中包含SDS -PAGE的三个不同的频段（补充图32），表明复合物是异三聚体。NSEM 2D类平均值和3D重建的NSEM映射与皇冠设计模型非常匹配（图3D，H，L和扩展数据图1）。因此， 可以通过用伪对称异构体代替同构二聚体来从较大的对称组件中提取对称子结构。

　　在我们的分层设计方法的最后一步中，我们通过将实验确认的冠与BGL17_A32同型聚体组合使用T = 4个笼子（图1，最后一列和补充信息3）。将C3，C4和C5冠与四面体，八面体和二十面体架构的三倍，四倍和五倍轴对齐，BGL17_A32与其余三倍的轴对齐。这种产生的组件在其中，异聚子体臂从冠（Heterotrimer的CH_C）向外指向外臂（CH_HO）（CH_HO）。为了找到最佳的对接接口，我们使用了rpxdock，对相互作用的臂的长度进行采样以及沿公共轴的旋转和翻译，并使用proteinmpnn设计了每个对称性的最高RPX评分模型。在AF2预测中，根据设计界面的形成和缺乏自我接口的形成对设计进行过滤（补充图19）。八面体结构的初始设计很少没有形成预测的自我接口。因此，为了降低自我相互作用的概率，我们使用蛋白质MPNN22对预测的自界面进行了明确的负面设计。我们通过实验测试了14组T = 4个笼子设计（TETT = 4-1 toT = 4-5，OCTT = 4-1至OCTT = 4-4，ICOT = 4-1 = 4-1 to ICOT = 4-5;补充表11-13），通过AF2过滤器。这四个成分在不同的大肠杆菌中独立表达。培养物与1：1：1：1化学计量和共同散热。使用固定的金属亲和力色谱和SEC纯化裂解样品，并通过NSEM表征笼子结构（扩展数据图1和补充图35-47）。如以下段落所述，每种情况下的主要物种是设计的t = 4结构。我们还观察到了较小的脱靶T = 1类笼子（补充图37、42和45）。

　　T = 4四面体笼（TETT = 4-2）具有四脚架形状（直径为33 nm），四个C3冠向外指向，同型聚合物将牙冠桥接到笼子的中心靠近，并朝向内中心（图4a，d，d，d，g和补充图36）。由于组件之间的手臂长度差（CH_A和CH_B的1.5重复单元，CH_C和CH_HO和CH_HO和CH_HO）和Interior量为6.0（图4），同型三聚体距离距离（11.5 nm）几乎是异三聚体 - 示聚体距离（6.0 nm）的两倍（6.0 nm），以及3.0 nm in。总体而言，结构映射到T = 4 Goldberg Polyhedra，具有四面体对称性23，其中三角形之间的六边形基序高度伸长（图4A）。这些结构特征在NSEM图（图4D），显微照片（图4E）和2D平均类（图4F）中很明显，并且设计模型与重建的NSEM映射非常一致（图4G）。可以轻松放松设计模型，以使NSEM 3D地图与所有四个组件清晰密度拟合（补充图36）；总体而言，放松的模型与设计模型非常匹配，除了在同构体 - 旋转三聚体界面附近的手臂弯曲导致的整体结构的轻微扭曲之外（图4D和补充图36）。

　　T = 4八面体笼（OCTT = 4-3）具有3D横切结构（直径为43 nm），其原始立方体形状的T = 1结构重复了六次，并从三个四倍的对称轴沿着x，y和z的正形和负值移开（图4B，h）。六个C4冠形成了沿X，Y和Z轴的结构的向外面，它们由将八个同构二聚体放置在靠近笼子中心的立方排列中的八个同构体连接；至于四面体笼，同构二聚体和异三聚体朝相反的方向面对（补充图40）。总体结构是T = 4 Goldberg Polyhedra，其八面体对称23，其伸长的六边形桥接正方形（图4B）和中心的10 nm腔。在NSEM显微照片（图4i）中观察到笼子的均匀种群，沿两倍，三倍和四倍的对称轴平均得分与设计模型非常一致（图4J）。NSEM 3D重建非常接近设计模型（图4K），但是冠状和同型二聚体之间略有弯曲的连接，导致整体结构略有扭曲（补充图40）。为了表征OCTT = 4-3在较高分辨率下的结构，我们收集了冷冻电子显微镜（Cryo-EM）数据，并生成了3D重建，在改进之后，该重建导致了具有6.87Å分辨率的3D Cryo-Em映射，具有清晰的二级结构（图5A – D和补充图51）。通过分子动力学放松后，设计模型非常适合冷冻EM图（图5E – G），带有冠状和同型二聚体子结构，并且单个链明确定义了（补充图41）。在HetBGL0-18-17_A32异形三聚体的四倍对称轴周围，CH_A和CH_B（图5B，E，绿色和蓝色）形成正方形图案；在低温EM地图中，每个链中的每个手臂中的五个螺旋都显而易见（图5E）。BGL17_A32沿三倍的对称轴放置均匀二聚体（图5D）；每个亚基的臂都有六个螺旋，并在末端与异构体的CH_C形成一个接口（图5F，G，紫色和橙色）。相对于设计模型，C4冠子结构的轻微扭曲源于同构体 - 旋三分体界面的变化（补充图41）。

　　T = 4二十面笼（ICOT = 4-4）由12个C5冠（Pentons）组成，这些冠（Pentons）由20个向外的同构体连接（图4C，L）。通过NSEM和动态光散射鉴定出很大均匀的75 nm大小的笼子（DLS；图4M和补充图44）。SDS -PAGE显示与每个组件相对应的清晰带，表明所有四个链都存在（补充图43）。2D类平均值（图4N）和3D NSEM重建（图4L，O）具有整体设计的形状，但是C5冠的方向，同构二聚体似乎与设计模型倒了（补充图34和47）。我们收集了冷冻EM图像，以及冷冻EM数据的3D重建和改进，产生了一个3D冷冻EM图，分辨率为13.15Å（图5H – K和补充图51），其中三线的中心孔和修剪器的方向清楚地识别。具有倒数组件的设计模型非常适合放松后的冷冻EM密度（图5L – N和补充图48）。总体结构具有t = 4 Goldberg多面体的结构，具有二十面体对称23，船型六边形图案放置在五角星之间（图4C）。围绕五倍的对称轴是由HETBGL0-18-17_A32异三聚体形成的Penton（图5H，I，绿色，蓝色和橙色）。Pentons由BGL17_A32均匀二聚体桥接，后者在三倍对称轴上形成三脚架样突起（图5H，K，紫色）。在双轴上是船型扭曲的六角形，在顶点上有两个同构二聚体和四个异三聚体。其中两个边缘是通过相互作用的异三聚体亚基形成的，并且通过相互作用的同二聚体和异三聚体亚基形成四个边缘（图5J）。ICOT = 4-4笼的外径比与腺相关的病毒capsid大约三倍（图5H），并且ICOT中心的空孔的内径= 4-4笼子约为50 nm （约为6.55×104 nm3的体积），可用于包装各种千核酸和酶等多种碳。

　　我们使用DLS（补充信息4.5）测试了OCTT = 4-3的热稳定性和pH耐受性，并测试了ICOT = 4-4个笼子。两个笼的Z平均直径（DZ）与完整笼的预期直径（ICOT = 4-4 = 4-4的约80 nm）一致，在25°C下，在25°C下，在25°C下，OCTT = 4-3）在较小的t = 1（较小的T = 1污染物）（电子显微镜观察到的较小的污染物）可能无法通过DL的较大的筛选来隔离。从25–70°C，然后降低75°C以上（图6A，B）。为了测试笼子的pH耐受性，我们测量了DZ，同时降低了缓冲液的pH值。ICOT = 40 nm的4-4 dz从pH 8.0到pH 5.3没有变化，但在pH 4.7时增加，可能是由于聚集而增加（图6C），而在pH 8.0和pH 6.4之间，OCTT = 4-3的octT = 4-3均未改变，但在pH值为5.9或pH值为5.9或pH 5.9或下降（图6D）。因此，笼子非常可热的（熔化温度高于70°C），这应该促进它们作为输送车辆的发育，并在内吞途径中采样的pH值进行pH依赖性过渡，这可能可利用内体逃逸。

　　作为探索笼子在交付应用中使用的第一步，我们通过将ICOT = 4-4（CH_HO）的四个组件之一融合到Asialoglycoprotein受体（ASGPR）的设计粘合剂26（图6E和扩展数据表6）来评估内部化。ASGPR是一种内吞内部化受体，仅在肝细胞表面表达。该受体已用于递送治疗性寡核苷酸，例如小的干扰RNA27和肝脏特异性Lytac介导的蛋白质降解26,28。通过遗传融合，在ICOT = 4-4笼的外表面上显示了60个ASGPR迷你绑定器（图6F）。我们用抗His Tag-alexa-488抗体（每个具有他的标签）标记了ASGPR笼子，并将其与肝细胞癌细胞系Hep3孵育。通过共聚焦成像，我们观察到了点状定位模式中笼子的大量细胞内积累，可能表明囊泡定位，而仅使用抗HIS-ALEXA-488抗体进行治疗，而没有笼子没有笼子，没有导致细胞内信号（图6H，I图6H，I）。该结果表明，这些大型设计的t = 4个笼子可以通过细胞内化，用于输送或LYTAC应用。