为了识别改变三聚体组装特异性的突变，我们首先确定了三聚体界面中的所有相互作用残基。触点被定义为在界面上残留物中沉重原子4的重原子内的任何残留物（即非氢原子）。然后，我们使用Rosetta来计算包含所有可能的突变对的姿势的总分，以及使用DDG滤波器的三聚体和单体状态之间的分数差异。示例脚本作为补充文件提供。通过将其DDG和总分与公式（1）进行比较与野生型（WT）界面的分数进行比较，评估了单个突变。根据等式（2），对配对突变的总得分和DDG值类似地归一化。

　　理想的突变对是一个或两个单个突变增加相对于野生型的能量（即归一化得分> 0），而双突变没有效果或稳定了三聚体（即标准化得分≤0）。我们还使用协同进化分析确定了设计的可能位置48,49。使用Gremlin鉴定出蛋白质 - 蛋白质界面处的强烈共同发展的残基。然后，我们确定了与野生型对负相关的突变，以实验测试。

　　突变体i53-50a三个尺度表达。在96孔板的孔体积为2 ml的板上以1 ml培养体积进行小尺度表达。在250毫升的奶昔烧瓶中以50 mL培养体积进行中等尺度表达式。大规模表达式在2 L型奶昔烧瓶中以500 mL培养体积进行。所有蛋白质均以TB培养基中的T7统一大肠杆菌表达，在37°C下以IPTG诱导3小时。将细胞沉淀并在-20°C下冷冻直至裂解。在裂解细胞之前，将裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，250 mM NaCl，20 mM咪唑，1 mM苯基甲基磺酰氟氟化物，1 mM二硫代硫代醇（DTT），0.1 mg ML -1 dnase和0.1μmRnasase）解脱出来。将小尺度表达式用板超声器（Qsonica）裂解，中等规模表达式用探针超声液裂解，并通过微荧光化（18,000 psi，一个通过）裂解大尺度表达式。通过在4,000克的摇摆桶转子中离心，从小尺度表达式中溶解了来自小尺度表达的裂解物。通过在固定角度转子中的12,000克离心，从中和大尺度表达裂解物中溶解裂解物。

　　五聚体i53-50b在大肠杆菌中重组产生。Genscript使用NDEI和XHOI限制性位点合成了编码I53-50B.4PT111的PET29B表达质粒。在Lb（10 g tonptone，5 g酵母提取物，10 g NaCl）中，在10 l Bioflo 320发酵罐（Eppendorf）中生长的LB（10 g tonptone，5 g酵母提取物，10 g NaCl）中表达无标记蛋白。在接种时，将叶轮速度设置为225 rpm，作为溶解氧气曝气级联的一部分，将气流设置为每分钟5级标准升，并将温度设置为37°C。在溶解的氧尖峰（OD〜12）的开始时，培养物被添加100 ml 100％甘油的推注，并用1 mM IPTG诱导。在此期间，培养温度降低至18°C，并停止补充O2，表达一直持续到OD达到约20。通过离心收集培养物，并从包含体中纯化蛋白质。首先，将颗粒重悬于PBS中，使用微流体M110P在18,000 PSI时通过微氟化均质化，然后通过微氟化裂解。在通过离心阐明样品（24,000g 30分钟）后，将上清液丢弃，并使用一系列三个洗涤液从颗粒中提取蛋白质。第一个洗涤由PBS组成，0.1％Triton X-100，pH 8.0。第二次洗涤由PBS，1 M NaCl，pH 8.0组成，最终洗涤（提取）由PBS，2 M尿素，0.75％CHAPS（3 - [（3-胆碱丙基）二甲基氨基甲基氨基甲基氨基甲酸] -1-丙硫代磺酸盐），pH 8.0。提取后，将样品应用于Akta Avant150 FPLC系统（Cytiva）上的Deae Sepharose FF柱（Cytiva）。样品结合后，将色谱柱用pH 8.0的5柱体积用0.1％Triton X-100洗涤，然后用5列的pH 8.0柱量为0.75％CHAPS洗涤5列的PBS。将蛋白质用3列的PBS在pH 8.0上用500 mM NaCl洗脱。纯化后， 将分数合并并浓缩在10K MWCO离心过滤器（Millipore），无菌过滤（0.22μm），等分试和液体氮气中的闪光，并存储在-80°C下。

　　通过Quikchange定义的诱变将单个突变引入I53-50a Trimer11中。序列验证的突变体以小尺度表达。将澄清的裂解物与颗粒分离，并列出5 µL等分试样，以通过SDS -PAGE进行表征。将颗粒重悬于裂解缓冲液中，并列出5 µL等分试样，以通过SDS -PAGE进行表征。立即将澄清的裂解物与纯化的i53-50b.4pt1 Pentamer混合。由于三聚体水平从突变体到突变体变化，因此以三种不同的浓度添加五聚体。加入10 µL裂解物，7.5、2.5或0 µL裂解缓冲液，然后在1.8 mg ml-1下为2.5、7.5或10 µL i53-50b.4pt1 Pentamer。允许在室温下进行30分钟的组装反应。纯化的i53-50b.4pt1 pentamer都包含在所有本机凝胶中。每个组装反应的10 µl等分试样将1：1与天然样品缓冲液（Bio-Rad实验室）混合在一起，将其加载到预制的4–15％聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad Laboratories）中，并用1×Tris-Grycine的天然PAGE缓冲液在200 V时进行3小时的3小时。天然凝胶上缺乏i53-50纳米层带表明单个突变破坏了三聚体形成或三聚体几何形状，因此突变体三聚体不再是能力的。

　　破坏i53-50a三聚体以及因此I53-50纳米的单个突变体与“救援”突变相结合，旨在产生伪对称i53-50a的三聚体。合成DNA编码电势组合被订购为从IDT克隆到PCDB179中的异三位体操纵子。为了促进异构体的不同成分的检测，将一个6倍的His-Sumo结构域添加到一个亚基和SFGFP中，并通过遗传融合添加到第二个亚基中的AVI-TAG。第三个亚基通过遗传融合构成链球菌标记。如上所述，使用含三聚体的大肠杆菌裂解物测试了变体的i53-50纳米层形成，并纯化的i53-50b pentamer纯化。形成i53-50纳米的组合大规模表达，并在Histrap FF柱（Cytiva）上通过Ni2+亲和力色谱法纯化。简而言之，澄清的裂解物通过预取平衡的5 ml Histrap FF色谱柱，用3–5列的洗涤缓冲液（50 mm Tris pH 8.0，250 mm NaCl，20 mM咪唑，1 mm DTT）洗涤，并在100％的阶段或40分钟的速度上洗脱，并在100％的速度上放大了速度。（50毫米Tris pH 8.0，250 mm NaCl，500毫米咪唑，1毫米DTT）。将对应于两个观察到的两个观测峰的主要部分分别合并，集中在30 kDa的截止氨基氨基浓度浓度（Millipore）中，并注入预校准的SuperDex 200增加10/300列（Cytiva）。SEC缓冲液为25 mm Tris pH 8.0，150 mm NaCl，1 mm DTT。收集了与每个色谱图对应于三聚体峰的分数，以通过天然质谱法分析。或者，将iMac洗脱液合并并加载到预定在结合缓冲液中（100 mM Tris pH 8.0，150 mm NaCl，1 mM EDTA和1 mM DTT）的链球菌HP柱（Cytiva）上。然后将色谱柱用10列体积的结合缓冲液洗涤， 或直到A280吸光度在基线时升高，并在结合缓冲液加2.5毫米Desthiobiotin中洗脱了。通过减少SDS -page分析了主要部分。

　　使用消失的超高超高质量范围Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific），使用消失的超高超高质量范围质量范围质谱仪（Thermo Fisher Scientific），通过在线缓冲 - 交换质谱质量光谱中分析三聚体纯度，身份和寡聚状态。记录的质谱是用UNIDEC版本4.2+（参考文献62）对其进行反驳的。

　　如上所述，对天然质谱验证的伪质量对称I53-50A异三聚体进行了中等规模的表达并纯化，并以1：1摩尔比与纯化的i53-50B.4PT1五聚体混合，并允许在室温下组装30分钟。如下所述，通过DLS和负污渍电子显微镜表征组装的纳米腔。

　　我们通过从i3-0114中提取五倍的五倍的五倍的五角晶剂来创建五角肌的模型。我们将未配对亚基上的界面残基恢复为原始的1WA3序列，将12个残基突变为带负电荷的氨基酸以增强表达并促进纯化，然后将每个三聚体合并到单个链中，以便可以在计算上以简单的同质体进行计算处理五端膜。我们使用先前描述的协议11进行对接和设计t = 4纳米，并对设计脚本进行了一些修改。示例设计脚本作为补充文件提供。手动筛选对接的配置，以确保在未配对的五角肌亚基和同构元中的接口。对设计进行了视觉检查，并将设计过程中引入的任何过度暴露的疏水残基恢复为野生型身份。

　　从IDT订购了三个三一个基因。N端GFP包含在五角肌异三聚体的A亚基上作为质量标签。C末端6×His标签被添加到C亚基中。基因以中等规模表达。将澄清的裂解物加载到1 mL的Ni-NTA树脂（Thermo Fisher Scientific）中，预先校准了洗涤缓冲液。用三列量洗涤缓冲液洗涤后，将蛋白质用两柱体积洗脱缓冲液洗脱。通过SDS -PAGE筛选了筛选所有三种基因产物的存在。

　　通过在Wash缓冲液中平衡的5 ml Histrap FF柱（Cytiva）（50 mM Tris pH 8.0，250 mm NaCl，20 mm NaCl，20 mM咪唑，1 mm DTT）中平衡的5 mL Histrap FF柱（Cytiva），通过在5 ml Histrap FF柱（Cytiva）上加载，以大规模表达的GI4-F7纳米含量。加载后，将柱子用3-5列的洗涤缓冲液洗涤，将蛋白质用梯度洗脱为100％洗脱缓冲液（50 mm Tris pH 8.0，250 mm NaCl，500 mM咪唑，1 mM DTT，1 mM DTT），在40分钟内，在3 ml min -1中。将洗脱的主要馏分汇总，浓缩至〜1 ml，并加载到平衡的Sephacryl S-500 HR 10/300 GL上。SEC缓冲液为25 mm Tris pH 8.0，150 mm NaCl，1 mm DTT。

　　对于体外组件，仅包含A和B链的GI4-F7的异焦点成分。A链用N端6×HIS标签修饰。当以这种方式表达时，除了AAB和ABB异三聚体外，一些AAA纳米含量和BBB同二聚体可能会组装。为了从ABB异三聚体纯化AAB，大规模表达了双分子基因，并修改了0.75％的CHAPS被添加到裂解缓冲液中，并省略了DTT。如上所述，用5 mL Histrap FF色谱柱纯化了澄清的裂解物。洗脱色谱图包含三个峰。第一个峰主要是ABB异三聚体，第二个峰主要是AAB异三聚体，第三个峰主要是AAA同型聚体组装成I3-01样粒子。任何BBB同二聚体都将在流通中。将第一和第二峰分别合并并浓缩至〜1 ml。为了删除任何残留的i3-01状纳米层，我们进一步纯化了Superose 6增加10/300列上的浓缩分数。SEC缓冲液为25 mm Tris pH 8.0，150 mm NaCl，0.75％w/v Chaps。将甘油添加到纯化的异三聚体中，最终浓度为5％，浓度由A280确定，并在液氮中闪烁1 ml等分试样。将等分试样存储在-80°C直至使用。同构聚合物组件大规模表达，并以与共表达的GI4-F7纳米量相同的方式纯化，除了将1％的CHAPS添加到所有缓冲液中。在25 mm Tris pH 8.0，150 mm NaCl，5％甘油，1.0％W/V CHAPS，1 mm DTT中，SEC在26/600 SuperDex 200 Pg柱上进一步纯化了。总三聚体蛋白浓度通过A280测量，在1 ml等分试样中液体氮中的闪光冻干，并将其储存在-80°C下直至使用。

　　为了组装git-f7纳米模式，在存在3％CHAPS的情况下取决于目标组件状态，在各种化学计量法上混合了组件，这种情况阻止了早熟组装。这对于防止在添加产生目标组件所需的多个组件期间组装脱靶物质是必不可少的。例如，在添加AAB和ABB组件之前将BBB – CCC异三聚体混合在装配 - 验证条件下会导致2D阵列而不是GIT-F7纳米含量（参见扩展数据图6）。一旦添加了所有组件，将混合物透析在室温下在30 kDa截止透析盒中透析为0％CHAP。为了额外的预防措施，AAB和ABB异三聚体首先混合，因为它们不直接与BBB同二聚体相互作用，然后添加CCC同二聚体。为每个实验制备新鲜的纳米剂，或在4°C下储存长达三天。要组装BBB – CCC 2D阵列，首先将组件单独透析以去除CHAP，然后以1：1的化学计量比率混合，并允许在室温下聚集过夜。

　　通过DLS在溶液中表征组件。根据制造商的指示，使用叔叔（未链接的实验室）以三式三份的技术重复测量样品。简而言之，将8.8 µL的样品一式化加载到毛细管盒中。对于每个重复，收集了10次收购10 s。组件以负污渍电子显微镜进一步为特征。将样品稀释至0.1至0.5 mg ml-1的总蛋白质，具体取决于组件化学计量，应用于发光的发光厚厚的厚碳膜400网状铜网（电子显微镜科学），并用2％的铀酰甲酸形染色。注意确保污渍厚度足以支撑较大的组件。以高达48,000倍的放大倍数在Talos L120C（FEI）上收集显微照片。使用ImageJ处理单个显微照片。

　　为了使抗原与组装的纳米腔结合，将CCC三聚体融合到其C末端的SpyCatcher002基序中，在大肠杆菌中表达，并通过iMac和sec纯化，如上所述。然后将纳米成像用于T = 4的适当石化图表，并通过透析成0％的CHAPS溶液过夜，将其用于T = 4和T = 9组件。然后将组装的颗粒与过量的RBD-SPYTAG002混合，并在4°C下混合3小时。通过SDS -PAGE证实了共轭，其中RBD的质量显示出约30 kDa，与纳米含量组件中的CCC蛋白结合一致。结合后，还通过负污渍电子显微镜观察到颗粒以确认完整的组件。通过在成像前3次施加3 µm纳米型溶液来制备样品。EPU软件（Thermo Fisher）用于收集每个样品的至少100个显微照片。将图像进口到冷冻条件，并将颗粒平均以获得初始的2D类。然后使用选定的类用于生成第二轮颗粒拾取的模板，并将新粒子平均多次获得，以获得图3i中所示的2D类。

　　COVA2-15 IgG Ramos细胞系由Van Gils Laboratory60慷慨地提供，未进一步验证。对于Ca2+通量实验，将细胞在RPMI1640中加载30分钟的细胞染料（Thermo Fisher）30分钟，并补充了10％的胎儿克隆II，1％ - 卢丁胺和1％青霉素 - 链霉菌蛋白 - 链霉菌素（完整的培养基）的细胞浓度为1×107 / ml ml。然后用10×体积完整培养基洗涤细胞，以每毫升为2×106的细胞重悬于完整的培养基中，并以0.25 mL等分为单个FACS管中。样品在室温下保持在室温下，然后在使用前在37°C浴中加热3分钟。在添加抗原和BCR特异性激活的测量之前，对每个样品的基准记录了30 s的Attune Cytpix流式细胞仪（Thermo Fisher）进行采集。有关门控策略，请参见补充图6。多克隆山羊抗人IgG F（AB'）2（Southern Biotech）被用作通过向细胞中添加2.5 µg IgG BCR交联引起的信号传导的阳性对照。使用FlowJo V10（BD Biosciences），使用结合（VL3中的荧光）和未结合（BL1中的荧光）的FURAD BATIO。未测试细胞系的支原体。

　　将3毫克的3毫克ML-1 GI4-F7，GI9-F7和GI16-F16加载到新鲜发光的含量R 2/2 Ultraufoil Grid上，然后使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）用0和6秒的效果涂上玻璃体标记IV（Thermo Fisher Scientific），并在0和6 sec sec sec Pllot和22°C shipity和22°C anditive和22°C C. 22°C anditive and 22°C。使用FEI Titan Krios透射电子显微镜以300 kV运行，并配备了Gatan K3 Direct检测器和Gatan量子GIF Energy Filter，以零损失模式运行，狭缝宽度为20 eV，从而获取了数据。对于GI4-F7和GI9-F7，使用Leginon63以标称放大倍率为105,000×，像素大小为0.843Å。收集7,249和2,558个显微照片，分别为-0.5和-2.5μm的散焦范围。将剂量率调整为每秒钟的每个像素15个计数，每个电影都是以40 ms的75帧分离的超分辨率模式获取的。对于GI16-F7数据集，使用LeginOn63进行自动数据收集，名义放大倍率为64,000×，像素大小为1.42Å。总共收集了2,268个显微照片，散焦范围在-0.5至-3.5μm之间。将剂量率调整为每秒钟15个计数，每个电影以100毫秒为50帧的超分辨率模式获取。使用Warp64进行了电影框架对准，显微镜对比度转移函数参数的估计，粒子拾取和提取。

　　使用CryoSparc65进行了两轮无参考的2D分类，以选择定义明确的粒子图像。使用Relion66对这些选定的颗粒进行两轮3D分类（25次迭代的角度采样7.5°，对25次迭代进行25次迭代）进行了50个迭代，并使用RIFION66与CryoSparc中的初始重构产生的初始模型。使用不均匀的细化以及CryoSparc中的每颗粒散热性细化进行3D细化。在CryoSparc中进行了另一轮不均匀的细化，然后在CryoSparc进行了另一轮不均匀的细化，然后进行每颗颗粒的Defocus细化和再次不均匀的细化。为了进一步提高ASU的密度，颗粒被对称扩展，并进行焦点3D分类，而无需完善角度和移位。选择了属于具有最佳分辨ASU密度的类的粒子，然后使用CryoSparc进行局部细化。使用CryoSparc进行了局部分辨率估计和锐化。报告的分辨率基于0.143标准的金标准傅立叶壳相关性，并校正了傅立叶壳相关曲线，以通过高分辨率噪声取代为68,69的软遮罩的影响。

　　UCSF Chimera70和COOT71用于将原子模型拟合到冷冻EM图中。使用Rosetta使用Rosetta使用锐化和未共享的MAPS72,73对GI4-F7和GI9-F7 ASU模型进行了完善和放松。对于GI4-F7或GI9-F7二十面体模型，GI4-F7或GI9-F7 ASU模型的所有侧链都被截断了，除了Gly，Cys和Pro残基，以及与对称性相关的副本都是用Cryo-Em Maps在Chimerax中生成的。

　　为了使Cryo-EM模型与设计模型保持一致，这两个模型均以原点为中心及其在Pymol74中对齐的二十面体对称轴。Cαr.m.s.d.使用Pymol中的RMS_CUR函数计算。为了测量刚体自由度的偏差，将使用Cero-EM模型的五角肌，幻灯片和三聚体（或Trimer（或Trimer for Gi9-f7）的副本对齐使用Pymol中的“超级”功能。然后，我们计算了原始冷冻EM模型的相应组件和对齐的冷冻EM模型之间的转换矩阵的旋转和翻译。我们将相同的方法应用于异三聚体（和GI​​9-F7的同构元素）分量，以获得五角孔元素，疾病对元素和同型聚物组件内的旋转和翻译。我们发现，Pymol中的“超级”功能对链和残留编号非常敏感，以及设计模型和冷冻EM模型之间的一些较小差异。因此，对于使用Pymol的所有比对，我们确保仅在仅一种模型或另一种模型中删除残留物的残留编号，链ID并删除任何残留物。因此，使用CHIMERAX75中的MM命令生成对齐图像，并进行了验证，以确保对齐匹配与Pymol中的Super函数创建的修剪模型中生成的对齐密切匹配。

　　使用Python 3.8.8，Matplotlib 3.3.4和Seaborn 0.11.1对所有数据进行处理和绘制。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。