A. Thaliana Heynh的植物。除非另有说明，否则在22°C的长期条件下，在22°C的珍珠岩/土壤混合物的盆中生长生态型col和la-er，除非另有说明，否则在长期的长期条件下（150 µE m-2 s-1）生长。这些植物用于稳定转化，原生质体制备和DNA提取。如前所述61，在琼脂板上生长了茶曲霉的幼苗，用于生理测定161。对于耐热测试，生长条件如前所报道14。GABI-KAT Collection62的T-DNA敲除线，包括GK-476H03（AT5G13590; TWA1-2）和SALK Collection63，包括SALK_143411（AT2G335411;指定的CPL3-10）。

　　JAM2/BHLH013（AT1G01260）基因在PHB6：LUC线中使用CRISPR – CAS9 System64,64和Vector PDGE63失活：（Addgene Plastid，794445）。两个独立的JAM2分离株包含一个框架，这导致了氨基酸12后的早期翻译终止，我们将其指定为JAM2-2。DNA测序分析表明，密切相关的基因JAM1/BHLH017（AT2G46510）和JAM3/BHLH003（AT4G16430）中没有脱靶突变。三重突变体JAM1-2 JAM2-2 JAM3-2（JAM）是通过Crossing JAM2-2，JAM1-2（GK_285E09）和JAM3-2（GK_301G05）（GK_301G05）生成的28植物，并选择植物中的肉体性jam突变体。同样，通过与SALK_112730（TPR2-2）和SALK_002209（指定的TPR4-2）工厂，通过将TPL-8（SALK_036566）越过TPL-8 TPR4-2三重突变体（TPR）获得。先前报道了RCAR1-和RCAR6过表达的线的产生61。通过将多个PYR/PYL/PYL敲除线Pyr1 Pyl1 Pyl2 pyl4 pyl5 pyl866，RCAR9 Mutant67和Lines SALK_083621（RCAR1）（RCAR1）和GK-012D02（RCAR13）组合来获得四边形的RCAR-敲除线。三重突变体ABI1-2 ABI2-2 HAB1-1（PP2C_A）和ABI1-2 HAB1-1 PP2CA-1（PP2C_B）19是P. L. Rodriguez的礼物，以及多个Pyr/Pyl/Pyl敲除。将突变体越过ABA记者线PRD29B：LUC和PHB6：LUC23。在整个实验中，都使用了用于报告基因构建体和突变等位基因的纯合子。

　　从ABA记者phb6：luc23的Col-0背景中的甲基甲烷二硫酸亚硫酸亚硫酸乙二醇化的A. thaliana种子的筛网中回收了具有ABA - 甲状腺敏感的报告基因激活的突变体。简而言之，将M2幼苗生长在固化的半强度MS培养基上5天，然后转移到补充3 µm（+）-Cis-trans-Aba（Chemos; Chemos; www.chemos-group.com）或0.3 m mannitol或0.3 m mannitol的培养基或24 h man硝酸（https://hcimage.com/)23。在恢复的突变体中，某些突变体对外源应用ABA高度敏感，而对ABA反应不变的突变体被认为是在规范ABA信号通路上游的干旱应力信号传导中携带病变。筛选了约115,000个幼苗，并选择了109个推定的超敏突变体。表现出超敏者反应的候选者被传播，并重新检查后代。最后，确认了24个突变体，其中16例被发现是ABA - 甲状腺素敏感，发现8种在ABA上游的干旱应力信号中受到影响。我们选择具有强大表型的突变体，用于基于MAP的克隆与下一代测序结合使用，并将TWA1-1与突变体等位基因到CPL1和CPL3一起鉴定。TWA1-1突变体被回到PHB6：Luc Reporter系列四次。

　　TWA1基因座已通过批量的分类分析鉴定。68。简而言之，与参考基因组COL-0相比，将大约50个纯合突变幼苗合并并处理以进行下一代DNA测序分析，以鉴定单核苷酸多态性（SNP）。该分析限制了靶基因在染色体5的180 Kb基因组片段中的位置。在该片段中，在基因中发现了四个SNP，其中两个是同义词。非同义突变在编码序列的核苷酸744的AT5G13590中产生了过早的TGA终止密码子，另一个在5G13930引起了保守的氨基酸交换。TWA1的身份（AT5G13590）通过辅助通过基因转移的7 kb基因组碎片的基因转移，其中包含1.1 kb的启动子区域，结构性基因和终结剂（用于启动点和限制性点的列表中，在补充表1中显示了启动基因和限制点的列表）证实了ABA - 甲状腺敏感的表型。

　　如先前所述，进行了植物RNA提取，cDNA合成和质粒的质粒构建效应子表达。61。简而言之，cDNA是从A. thaliana col-0，A。Lyrata和S. alba的叶片中分离出的mRNA产生的。使用Analytik Jena-Innuprep植物RNA试剂盒（Analytik Jena）从叶子中纯化总RNA，并使用ReverTAID First Strand strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。将效应子的编码序列集成到一个修饰的Bluescript矢量中，其表达式盒由35S启动子组成，然后是编码序列和NOS终端61。补充表1中提供了用于克隆的引物和限制位点的列表。围绕HVR的AltWa1基因的363 BP AVRII – Hindiii DNA片段与AVRII – HINDIII与TWA1的avrii – hindiii片段交换。使用金盖特系统69克隆用于FRET-FLIM分析的构建体。将TWA1，TWA1-1，JAM2和JAM3 cDNA克隆到I级向量（li_bpii），然后随后将LII表达向量（JAM2和JAM3：LII_3-4_CEN_LEU）与发起人PTDH3和终端TDH1，以及n-Terminal twa _1 twaa; twaaa; twaaa; twaa;PTDH3和TDH1，以及N末端GFP标签）。对于分子内的FRET，将TWA1克隆到LII_3-4_CEN_LEU中，带有PTDH3和TDH1，包括N端MCHERRY标签和C端GFP（所有构造中使用的GFP）（所有结构中使用的GFP）是通过GFPS链接到glycine – gggs linkgg; ggg; ggg; ggg; ggg; ggg; ggg; ggg; ggg;gggggggggggggggs）。作为对照，将两个荧光团与相同的甘氨酸 - 塞林接头融合在一起，并使用LII_3-4_LEU表达式盒表示。使用TWA1（ALHVR）盒式将GFP-TWA1（ALHVR）构建体克隆到PGREG57470中（见上文） 和萨利。如前所述54所述，通过在PRD29B：LUC中替换RD29B启动子的RD29B启动子：LUC中的RD29B启动子的产生，如先前所述54。通过DNA测序分析验证了所有构建体的正确性。使用LightCycler 480仪器（Roche）和基因特异性引物，使用基于Bryt Green Dye的QPCR（GOTAQ QPCR Master Mix套件，Promega）和基因QPCR（GOTAQ QPCR Master Mix套件）和基因表达进行定量基因表达。TIP41L，UBC9和UBI10用于归一化。补充表2显示了用于定量PCR的引物列表。

　　通过针对NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi?page=proteins）的基因组进行BLASTP搜索来鉴定TWA1的同源物。将TWA1和代表性蛋白的氨基酸序列与NCBI钴比对工具对齐71。

　　使用metapredict（https://metapredict.net/)72对本质上无序区域进行预测。

　　thaliana原生质体中的瞬时表达分析，PRDB29的表达盒：Luc，p35s：GUS和效应子已被描述为先前73。列出了用于生成效应子构建体的DNA扩增和限制位点的引物（补充表1）。从哥伦比亚WT登录（COL-0）的叶子或Col-0背景的突变管线中分离原生质体。简而言之，用不同表达盒的DNA转染了105种原生质体，包括ABA反应性PRD29B：LUC报告基因（5 µg），p35s：GUS对照报告基因（3 µg）表达归一化，以进行归一化和指示的各种效应质粒和在25°C中的指示量，因为葡萄糖醛酸酶活性。TWA1和TWA1的异位表达（TWA1-1的突变等位基因），A。thaliana植物中的AltWa1和Satwa1在TWA1-2背景下在35S启动子之下。TWA1变体和直系同源物的cDNA表达盒作为ASCI DNA片段插入到PGREENII 0179 Vector74中，在T-DNA区域通过ASCI克隆位点进行了修饰。如先前所述，通过农杆菌介导的基因转移产生转基因植物75。

　　如先前报道的14。简而言之，将5天大的光生幼苗（22°C）暴露于45°C下的热应激，持续90分钟至180分钟，间隔15分钟，以评估基础热耐耐受性。为了分析获得的耐热性，幼苗在38°C下的90分钟适应周期，然后在45°C的热应激之前进行120分钟的恢复阶段（22°C）。对于根生长测定，在连续光（22°C）下允许幼苗恢复5天，并确定热应激后的根伸展。

　　为了进行叶绿素分析，在确定新鲜重量后，使用Tastuelyser II（Qiagen）匀浆，将幼苗在液氮中冷冻，并用甲醇提取以确定叶绿素，如先前报道的76。在665 nm和652 nm处记录清除提取物的吸收。在电解质裂解测定中，将3周大的A. thaliana植物的叶子放入含有25 ml水的培养皿中，并在37°C或22°C下在光（65 µmol M-2 S-1）中孵育24小时。此后，将单个叶子浸入1 ml双倒流的水中，并在Eppendorf管中浸入30分钟，并温和摇动9。使用电导率计（七个易于的Mettler Toledo，Inlab 752-6 mm电导率传感器）测量电导率。将样品加热至99°C后，将电解质泄漏标准化为电导率10分钟。

　　GFP – JAM2在A. thaliana col-0原生质体中表达，在不存在或存在ABA（10 µM）的情况下孵育16小时。用空载体转染的原生质体用作对照。通过离心（500G，2分钟）收集原生质体，并丢弃上清液。如前所述，随后的步骤（核分离，剪切，预删除，免疫沉淀，反向交联和DNA纯化）如前所述进行77。从圣克鲁斯生物技术（抗体1：2,000稀释）获得抗GFP抗体，并从ProteIntech获得Chromotek GFP-trap-Trap琼脂糖。使用来自免疫沉淀样品的定量PCR对包含RD29B启动子的不同DNA片段（与对照组相比）进行了富集。

　　如先前所述，进行了气体交换测量和热成像。为了量化整个玫瑰花结的净光合作用（AN），蒸腾（E）和气孔电导（GS），GFS-3000气体交换系统配备了定制的整个植物比例（Heinz walz）。使用仪器供应商的软件，以150 µmol M -2 S -1 PAR，400 µmol mol -1外CO2和水蒸气赤字为1.3±0.1 kPa进行分析。PAM成像是通过使用Maxi版本的Imaging Pam（Heinz Walz）进行的。PAM成像系统的操作是根据制造商的说明进行的。简而言之，将植物深色适应30分钟，然后进行饱和光脉冲，并根据基本（F0）和最大荧光水平（FM）计算光系统II（ϕpsiimax）的最大量子效率。然后使用阳光光（150 µmol M -2 S -1 PAR），并在照明1小时后触发饱和的光脉冲以确定瞬时荧光（FT）和最大荧光（FM'）。光系统II（ϕPSII）的相应量子效率被计算为（FM' -ft）/FM'。确定非光化学淬灭（NPQ）为（fm-fm'）/fm'的比率。使用标准的错误颜色代码显示NPQ的图像，其重新定位值（原始值除以4）范围为0到1。

　　如前所述进行共聚焦显微镜和FRET -FLIM分析78。简而言之，将5周龄的烟草（N. benthamiana）的叶子浸入了tumefaciens GV3101（MP90）的悬浮液中，用于表达病毒p19蛋白和A. thaliana蛋白。细菌包含用于GFP-TWA1/TWA1表达的二元II质粒79，以及在植物叶片中病毒35S启动子的控制下与JAM2，JAM3和TPL的MCHERRY融合。将浸润的植物在20°C下孵育2天，并暴露2小时至37°C或20°C。为了分析酵母，将AH109菌株的新鲜转化的酵母细胞（MATA，从J. Uhrig，Cologne获得）在不同温度下在1 mL合成的右旋糖培养基（SD）中培养过夜，如共焦分析之前所示。使用Olympus Fluoview 3000逆激光扫描共聚焦显微镜与UPLSAPO 60xW 60 x 60×/Na 1.2/WD 0.28 0.28水免疫物镜（Olympus）进行共聚焦分析。为了对GFP和MCHERRY荧光团进行成像，组织样品分别在488和561 nm处受到激发。通过减去背景荧光80来计算细胞核中的特异性GFP荧光。对于FRET – FLIM数据采集，使用了Picoquant Advanced FCS/FRET -FLIM/RAPICFFLIM升级套件（PicoQuant）。使用脉冲激光器（脉搏率，40 MHz；激光驱动器，PDL 828 SEPIA II； LASER，LDH-D-C-485，PICOQUANT）激发GFP在485 nm处激发GFP，并使用Hybrid Photolultiplipliper time-time courting coutcor courting time courting courting time courtect time time courtection; pdl 828 sepia ii; ldh-d-d-c-485，picoquant）和荧光发射。模块（分辨率为25 ps； picoquant）。对于每个分析的样品，每个像素至少记录了至少250个光子。数据拟合到双指数衰减函数，并使用Synphotime 64软件（PicoQuant）进行卷曲。

　　除非使用PGAD424（GenBank：U07647）另有说明，否则进行酵母生长和Y2H分析，除非另有说明，否则对a。thaliana蛋白（Clontech）的表达进行了Pbridge载体。用A. thaliana Y2H库进行了与TWA1相互作用的蛋白质的屏幕27,81。TWA1和同源物的编码序列表示为与GAL4激活结构域（AD）的融合，而JAM，MYC2，TPL和TPR将其融合到GAL4-DNA结合域。For analysis of yeast growth in liquid culture, precultures of three independently transformed yeast colonies per construct were used for inoculation of 1.5 ml SD medium containing 2% glucose supplemented with 20 mg l−1 uracil, 20 mg l−1 methionine and, for selection of plasmids and protein interaction, supplemented with 20 mg l−1 histidine, 60 mg l−1 leucine and 50 mg l−1色氨酸如所示。在200 rpm和30°C的旋风振动筛中生长过夜后，加入了13.5 mL补充的SD，并进一步培养了悬浮培养物，直到在600 nm（OD600）的光密度下达到指数生长阶段的开始，为0.6和0.8。随后，将细胞沉积（1,500G，5分钟），重悬于选择性SD中，并用于将20 mL新鲜SD接种到0.020的最终OD600，以监测不同温度下的生长（200 rpm）。使用公式µ =（ln [OD24 h/od0 h]）/24小时，在培养的前24小时内计算出明显的生长速率µ。酵母中的生长速率用于将TWA1响应的Q10温度系数近似为Q10 = [µT2/µT1] 10/（T2 -T1），其中T分别为Celsius和µT1和µT2的温度是T1和T2时的速率。Q10值分别在25°C和20°C下的测量速率分别为0.138和0.011 H -1估计。

　　统计数据从不包括技术重复的生物重复的数据中得出。使用G*功率v.3.1.9.7 Software82计算样本量，用于未配对的双面t检验，原生质体和酵母实验的n = 3，其推测效应大小为5，α和β为0.05，功率为0.05，功率（1-β）= 0.95。幼苗生长测定中的单个数据点的生物学重复数为n = 6，推测的效应大小为2.5，α和β为0.05，功率（1 -β）= 0.95。每个实验重复至少两次，结果相似。代表性共聚焦图像在图1和图2中显示。2D和3C。在酵母中，大约85％的荧光细胞在30°C下显示出GFP – TWA1亚核拥挤，从未观察到TWA1产物（图2d，n> 100）。在烟草表皮细胞中，GFP – TWA1的核亚域在37°C时的积累为75％（图3C，N> 50）。在独立的实验中，核TWA1拥挤是一致的。除非另有说明（https://www.socscistatistics.com/tests/tests/mannwhitney和https://www.statskingdom.com/170mediandiandimiandimian_mann_mann_whitney.html，以计算<0.000001的p值）。使用SPSS v.16.0软件对Windows进行了单向方差分析。使用Excel 2016进行了学生的t检验。使用OriginPro 2020绘制框图。有关统计分析的详细信息，请在源数据中找到。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。