细胞系（MDA-MB-231，4T1和RPE-1）购自美国型培养物集合（ATCC）。TP53-KNOCKOUT MCF10A，TP53-KNOCKOUT RPE-1和TREX1基因敲除4T1细胞是来自Maciejowski实验室的礼物，位于纪念Sloan Kettering Cancer Center（MSKCC）。OVCAR-3细胞是J. D. Gonzales的礼物。所有有天赋的细胞均已从ATCC获得。来自ATCC的目录数如下：MDA-MB-231，HTB-26；4T1，CRL-2539;RPE-1，CRL-4000;MCF10A，CRL-103172;和OVCAR-3，HTB-161。MDA-MB-231和RPE-1细胞在DMEM（Corning）中培养，在RPMI（Corning）中培养4T1和OVCAR-3细胞；两种培养基均补充了10％FBS和50 U ML -1青霉素 - 链霉素。定期测试所有细胞的支原体污染。

　　细胞在盖玻片上生长，直到80-90％汇合。使用冰冷（-20°C）甲醇在冰箱中固定细胞15分钟。然后将细胞用牛血清白蛋白（TBS-BSA）1％溶液在室温下用0.5％Triton-X-100透化5分钟。随后，用TBS-BSA洗涤细胞（1％），并在室温下孵育5分钟。对于来自HGSOC患者的样品，按照先前报道的40收集标本。所有收集方案均由MSKCC机构审查委员会批准。根据机构审查委员会批准的知情同意的标准操作程序，患者同意。在进行任何与研究相关的程序之前，已获得所有患者的书面知情同意。该研究是根据赫尔辛基宣言和良好的临床实践指南进行的。用1％BSA-TBS溶液稀释抗体（有关完整列表，请参见补充表1），并在4°C下孵育过夜。然后将染色DAPI（0.5 µg mL-1）与在TBS-BSA中稀释的二抗（1％）一起添加。用Tris缓冲液（电子显微镜科学）将细胞用氟凝胶安装。如下所述收集图像（超分辨率免疫荧光显微镜部分）。组蛋白PTM阳性/阴性定量在每个组蛋白PTM的一份三份中进行，每次重复计数100微核。组蛋白PTM强度定量是使用ZEN 2（蓝色版）软件进行的，为此，将相应PTM的荧光强度标准化为DAPI通道的荧光强度。

　　将细胞用1x RIPA缓冲液（EMD Millipore）裂解，保持在冰上，并以10分钟的间隔涡旋3次。然后将裂解物以10,000 rpm离心10分钟，并丢弃碎屑。使用DC蛋白测定（Bio-Rad）对蛋白进行定量，并在每个SDS-PAGE凝胶中加载等量的蛋白质，并在120 V下运行1小时。然后使用Bio-Rad Trans-trabot涡轮转移系统中的标准方案将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中。使用与初级抗体（补充表2）在4°C下孵育的TBS阻止缓冲液（LI-COR）阻断膜。将二抗在室温下孵育1小时。使用Odyssey CLX系统（LI-COR）进行蛋白质印迹膜扫描。对于DOT印迹，将分离的核与1×RIPA缓冲液（EMD Millipore）裂解，并保持在冰上，并以10分钟的间隔旋转3次。然后将裂解物以10,000 rpm离心10分钟，并丢弃碎屑。未对DOT印迹进行定量；相反，使用了微核和原发核之间1:20的比率。然后将微核或原发核分数的RIPA提取物的2 µL斑点在硝酸纤维素膜的顶部，并驱动至少1小时。然后使用与原代抗体（补充表2）在4°C下孵育的TBS阻止缓冲液（LI-COR）将膜阻塞。将二抗在室温下孵育1小时。使用Odyssey CLX系统（LI-COR）进行扫描，并使用ImagesTudio软件（LI-COR）进行定量。补充表2中列出了用于免疫印迹的抗体。完整的未编工膜如图1所示。

　　用逆转（开曼化学公司）以0.5 µm的浓度处理细胞24小时（对于MDA-MB-231）或48 h（4T1）。使用HDAC抑制剂Vorinostat（Sigma-Aldrich;也称为Saha）以0.5 µm的浓度使用24小时，并在5 µm的浓度下使用甲基转移酶抑制剂GSK-126（XCESSBIO; EZH2）使用5 µm。通过细胞传递后24小时进行长期逆转处理，并在48小时后用正常细胞培养基代替培养基。GSK923295（Selleck Chemicals）以50 nm的浓度使用24小时。DMSO用作车辆控制。

　　如前所述，使用从Maciejowski实验室获得的质粒进行H2B-MCHERRY和GFP-CGA的表达。使用2 µg mL-1的浓度下的嘌呤霉素用于选择表达这两种蛋白质的细胞，然后使用荧光激活的细胞分选（FACS）来富集表达各自蛋白质的细胞。如前所述7，使用从Hetzer实验室获得的质粒实现了LAMI-B2-MCHERRY过表达7。在10 µg mL -1的浓度下使用blasteridin，以选择过表达层固定层B2的细胞。使用标准的慢病毒方案（H2B-MCHERRY和GFP – CGA）或逆转录病毒方案（Lamin B2-MCherry）使用HEK-293T细胞转导细胞，以产生慢病毒和逆转录病毒载体。病毒转导后，将细胞培养24小时，然后进行选择。

　　我们将500,000个细胞铺在一个6孔板中，其中每个孔中包含盖玻片，并允许粘附过夜。第二天，按照Lipofectamine Rnaimax（Thermofisher）的标准方案，将细胞用30 pmol的小型干扰RNA（siRNA）抗lamin A（预设计的siRNA，Thermofisher）或其所选阴性对照（Thermofisher）转染。48小时后，将细胞用RIPA缓冲液裂解，并使用抗层A抗体（Thermo Scientific）分析了经受蛋白质印迹的裂解物，以测试有效敲低。盖玻片固定并染色，如先前在“免疫荧光显微镜和组蛋白PTM定量”部分中所述。

　　使用配备有光体物理学Maitai HP激光器（Spectra-Physics）的Zeiss LSM 880（Carl Zeiss显微镜）显微镜收集荧光寿命图像，以进行两光子激发，并在800 nm处调谐，并使用Zeiss 63×/1.41 NA机油收集。荧光信号是通过光电倍增管（H7422P-40，hamamatsu）收集的，并使用FLIMBOX（A320 ISS模型）记录以获取寿命信息。采集的像素停留时间为16μs，图像的大小为256×256像素，积累了15帧。使用SIGFCS软件（加利福尼亚大学，加利福尼亚大学）进行拟张法案转换并使用自定义MATLAB代码来量化每个像素的数据并使用SIGFCS软件（荧光动力学实验室）记录和分析。通过获取已知寿命的溶液的荧光（0.4 mm香豆素6溶于乙醇中，τ= 2.5 ns），通过获取溶液的荧光来校正量相位的位置。寿命被确定为τ= s/ωg，其中τ是荧光寿命，g和s是相坐标，ω是激光频率（80 MHz）。

　　将样品标记为每孔Hoechst 33342（Nucblue，Thermofisher Scientific），并在孵育20分钟后成像。对于荧光寿命成像显微镜（FLIM）的每个视野，我们还记录了与Hoechst 33342相对应的2通道荧光强度图像和增强的GFP排放，以识别破裂的微核。根据以下标准，手动确定了考虑的四个子区域（异染色质，斑塑素和完整和破裂的微核）。对于异染色质，在HOECHST 33342通道中，核中的亮点对应于4T1或MDA-MB-231细胞中的异染色质添加区域。对于斑塑素，在HOECHST 33342通道中，将HOECHST 33342信号的核中的区域归类为富集素的区域。对于小核，在Hoechst 33342通道中，将微核鉴定为小于主核小的核酸阳性室。如果EGFP通道中没有信号，则将它们进一步归类为完整的，如果EGFP通道中有正信号，则它们被分类为完整。上面选择的子区域用于分割寿命图像，并获得单个寿命值作为整个子区域的中位数。对于每个细胞，都可以在五个生物学重复酸盐中获得异染色质，白染色质和微核酸（破裂或完整）的一个寿命值（破裂或完整）。MATLAB函数“ Isoutlier”删除了离群值。鉴于FLIM是在活细胞上进行的，我们假设它以及染色质压实态，它将能够观察消化的DNA，否则在其他方法（ATAC-SEEE和ATAC-SEQ）中使用的透化期间将丢失。为了解决这个问题，我们重复了TREX1-敲除细胞中的所有实验，如图3B所示。

　　如所述，对TN5产生，转座组装和ATAC-SEE进行了一些调整，以进行一些调整，以进行随后的免疫荧光实验。简而言之，将细胞在盖玻片上生长至80–90％汇合，并在室温下使用1％多聚甲醛固定10分钟。在室温下，在裂解缓冲液（10 mM Tris-CL，pH 7.4、10 mM NaCl，3 mM MGCL2、0.01％的igepal CA-630）中进行了透气化10分钟。在室温下，用PBS用PBS两次将盖玻片用细胞洗涤5分钟。转座酶混合溶液（25μl2×TD缓冲液，最终浓度为100 nm TN5-ATTO-59ON和DH2O，DH2O最高至50μL）在盖玻片上添加并在潮湿的室内盒中37°C孵育30分钟。然后将盖玻片用含有0.01％SDS和50 mM EDTA的PBS洗涤3次，每次55°C 15分钟。洗涤后，盖玻片进行了上述免疫荧光程序，从用TBS-BSA洗涤（1％）开始。

　　使用配备有通风扫描检测器（增益850，数字增益1）的倒置Zeiss LSM880（Carl Zeiss显微镜）以倒置的Zeiss LSM880（Carl Zeiss显微镜）获取图像。使用Plan-Apochromat 63×/1.4 Na油物镜，使用40 nm的Plan-Apochromat 63×/1.4 Na油物镜获得了848×848像素图像，并且停留时间为4.96μs。所使用的光学配置将激光线（以1％功率为405 nm，488 nm为3％，在7％时为561 nm），使用488/561/633 MBS，在405处使用一个隐形的光束分配器。对于检测，我们在495-550 nm和570 nm处使用了带通滤波器。每个图像被作为5个堆栈的Z堆栈，其间隔为500 nm；在使用Zeiss Zen Black软件进行定量之前，对所有图像进行了最大强度投影和通风扫描处理。对于ATAC-SEE图像，仅使用上述光学配置，仅使用两种激光线，分别为405 nm和594 nm，分别使用1％和30％的功率。每个盖玻片的10个不同部分（3个盖玻片，分别为3个生物学重复）以63倍的放大倍数对微核编号的数量进行评分。对于每个生物学重复，至少有50个经历了后期的细胞（n = 3），进行了错误进行分泌评分。

　　如前所述进行了微核纯化，除了还收集了原发核分数。简而言之，将细胞在245×245×25 mm的菜肴中膨胀，并用上述指定的反转处理。然后收集细胞并在DMEM中洗涤。将洗涤的细胞重悬于预热的（37°C）DMEM中，并补充了10μgml-1细胞切拉斯蛋白B（Sigma-Aldrich），每ML DMEM约5×106细胞，并在37°C下孵育至少30分钟。随后，将细胞以300克离心5分钟，并重悬于冷裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl，2 mm mg-乙酸盐，3 mM CaCl2，0.32 m蔗糖，0.1 mm EDTA，EDTA，0.1％，0.1％（V/V）NP-40，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5，pH 8.5 las liffers liffers in 1 lys lsiscy lissive lissition llyly lsiscy lsiscy lsiscy lsiscy lissity l lsiscy llys l llys l lsisce lifs lifs。Dithiothreitol，0.15 mM的精子，0.75 mM的精子，10μgml -1细胞切拉蛋白B和蛋白酶抑制剂。然后使用松散的杵将重悬的细胞悬浮10次。然后，将裂解液与同等量的冷1.8 m蔗糖缓冲液（10 mM Tris-HCl，1.8 M蔗糖，5 mm毫克 - 乙酸乙酸酯，0.1 mm EDTA，pH 8.0）混合，并与1 mM Dithiothreitol，0.3％BSA，0.15 mm bsa，0.15 mm spermine和0.75 mmmmmsspermidine一起添加。在50 mL圆锥管中，将10 mL的混合物层铺在两层蔗糖梯度的顶部（20 ml的1.8 m蔗糖缓冲液在15 ml 1.6 m 1.6 m的蔗糖缓冲液顶部）。然后将该混合物在4°C下以950克离心20分钟。第一个由此产生的2 ml顶部部分被丢弃；收集了接下来的5–6 mL，主要是含微核的，然后在一个单独的容器中收集了随后的3 mL，主要包含原核。用FACS缓冲液（冰冷的PBS新鲜补充了0.3％BSA，0.1％NP-40和蛋白酶抑制剂）将收集的分数稀释1：5）。然后将稀释的微核稀释液在4°C下以950克离心20分钟。通过抽吸去除去所得的上清液，并将微核或原代核重悬于2-4 mL FACS缓冲液中，并补充了2μgml-1 DAPI（但NoDAPI用于MicroNuclei纯化进行ATAC-SEC-SEQ-SEQ-SEQ-SEQ-SEQ-SECEQ和CUT＆CUR＆CURT＆CURT＆CURMENTERS）。将重悬的样品通过40-μm的官僚（Pluriselect）过滤到FACS管中。然后将小核通过FACSARIA（BD Biosciences）分选为MSKCC流式细胞仪核心设施的FACS缓冲液。降低了默认的FSC和DAPI阈值，并使用日志量表可视化微核。对于ATAC-SEQ微核纯化，使用FSC和MCHERRY代替FSC和DAPI。将分选的微核在4,000克在秋千转子中以4°C离心20分钟，并在-80°C下储存，以供以后使用或立即加工或ATAC-SEQ或CUT＆CUT＆RUN实验。

　　在55°C的360μl缓冲液ATL+40μL蛋白酶K中，将易化的冷冻细胞解冻，沉淀并至少30分钟。根据制造商的规程，通过用80％乙醇代替AW2缓冲液，使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen）进行了DNA隔离。将DNA在60 µL 0.5×缓冲液中洗脱，加热至55°C。对于核，根据制造商的方案，用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen）分离了来自核和微核的DNA，通过用80％乙醇代替AW2缓冲液，将其修饰。将DNA在60 µL 0.5×缓冲液中洗脱，加热至55°C。

　　在通过敏捷贴纸进行PICOGREEN定量和质量控制之后，使用LE220-POPE的超声波（Covaris）（Covaris）剪切97-165 ng基因组或微核DNA，并使用KAPA Hyper Prep Kit（KAPA Biosystems）制备了测序库。简而言之，在结合后清理后，使用Ampure XP珠（Beckman Coulter）对库进行了0.5倍的选择。用5个循环的PCR放大库，并以等摩尔比的比率合并。使用Novaseq 6000 S4试剂盒（300个循环）（Illumina），在PE150运行中以Novaseq 6000进行样品。每个样品的平均覆盖范围为18倍。对于微核样品，使用Mocaseq Pipeline43的HMMCopy42 v.1.38进行了复制分析，将C57BL-6NJ 6NJ44设置为这三个的正常对。还使用MoCaseq使用其CNV_PLOTHMMCOPY R脚本制作了肿瘤/正常相对拷贝数比（扩展数据图6G）的图（扩展数据图6G）。对于拷贝数与微核和主要核样本的ATAC-SEQ计数进行比较（扩展数据图6i），使用BWA-MEM（默认设置）将读取映射到MM10基因组，并使用NovoSort Markduplicates（V。3.08.02）进行了分类，进行了分类和分类。使用BedTools（v。2.25.0）获得ATAC-SEQ和WGS映射读数的5-KB垃圾箱的计数。对于图3F，使用R中的Pheatmap软件包进行了分层聚类，通过将ATAC-SEQ峰与周围的WGS数据的周围的1-KB窗口相交，将Copy-Number配置文件投影到群集上。对于扩展数据图6J，通过切割ATAC-SEQ热图的行树状图来创建复制数框图，以在上下产生微核，然后从WGS拷贝数比例中绘制相应的1-KB窗口。对于RPE-1样品，使用basePair的拷贝数变化（CNV； GATK4）管道来确定拷贝数。

　　Cutana Cut＆Run用RPE-1和DLD-1样品在自动化协议（Autocut＆Run）上进行的，该协议从前描述的45,46派生。简而言之，对于每种切割反应，将500,000个细胞（用20 mM HEPES制备500万个细胞，pH 7.5，150 mm NaCl，0.5 mm的精子氨酸，1 mm Trichostatin A，1×EDTA/EGTA/EGTA无蛋白酶抑制剂）分配给96-WELL PLATE，IMMBARIN（EPRAS）（EPER）（EPER）（EPER）（EPER）（Epper）（Epper），Eprav（Eprav）（Eppy）（Eppy）（Eppy）（Eppy）（Eppy）（EPER）（EPER）（EPER）（EPER）（EPER）（EPER）（EPER）（EPER）（EPER）。并与0.5 µg抗体（IgG，H3K4me3，H3K27Me3，H3K27AC）（所有抗体ptm ptm ptm pTM定义的Snap-chip-chip chip核心组验证的抗体）一起孵育过夜（4°C）。添加PAG-微核酸酶（Epicypher）并激活（在4°C下为2 h），并在以2：1（珠子：DNA）比率混合后使用Serapure珠纯化且富含的DNA。使用PICOGREEN对恢复的DNA进行定量，并在准备测序文库（Cutana Cut＆Run库Prep Kit; Epicypher）之前将反应标准化为5 ng DNA（或恢复少于5 ng DNA的全部反应）。所有切割步骤均已优化并在Tecan Freedom Evo机器人平台上进行，并带有温和的摇摆，以进行孵化步骤和磁性捕获，用于中等交换和洗涤步骤，如前所述45,46。

　　按照制造商的核样品手册，使用Cutana Chic/cut＆Run Kit使用Cutana Chic/Chip＆Run Kit（Epicypher，14-1048）进行Cutana Cut＆Run使用Cutana Chic/cut＆Run Kit（Epicypher，14-1048）进行。每种重复的约有50,000个原发核，1,000,000个完整的微核和100,000个破裂的微核破裂。简而言之，将核从试剂盒中固定在豆甲蛋白A珠上，并与0.5 µg抗体（IgG，H3K4me3）一起过夜（4°C）孵育过夜（4°C）。加入PAG-微核酸酶（Epicypher）并激活（在4°C时为2 h），并使用套件的纯化方案和试剂纯化了切割和富含的DNA。该反应用于使用Cutana Cut＆Run Library Prep Kit（Epicypher）的协议来制备测序库。

　　使用制造商的协议中提取RNA，在Qiagen rneasy Mini Plus Kit（Qiagen）中提取。使用poly（a）RNA序列的工作流进行库搁置和测序库，并具有80-1亿，100-100万（BP）配对末端读数的读取深度。在MSKCC综合基因组学核心中进行了库制备和测序。使用表达计数（Star）工作流程使用基本底机工具包分析RNA-seq数据，以获取每千座转录本片段的值每百万映射读取的值。使用对所有基因的归一化计数矩阵（扩展数据）或使用Partek Flow软件，版本10.0（Partek）应用于所有基因的归一化计数矩阵（扩展数据）和肿瘤基因基因（扩展数据图9C）的列表（partek）。TP53-KNOCKOUT HTERT RPE-1细胞的主成分分析（扩展数据图9C）使用R（V.4.2.1）和RSTUDIO（版本2022.07.0+548）中的stats软件包（v。4.2.1）中的PRCOMP函数（v。4.2.1）中完成。对对照和lamin-b2过表达的归一化基因计数进行了GSEA TP5​​3-KNOCKOUT HTERT RPE-1细胞，这些RPE-1细胞用Reversine或dMSO处理（扩展数据图9a，b）使用GSEA软件版本4.2.3（Broad Institter），以下参数：Metric for Clanking Genes，Signles Genes，Signle nose，Signle for Signle for Signle nose;加权富集统计；置换类型，基因集。用于GSEA的基因集来自4T1中完整或破裂的微核中染色质可及性的ATAC-SEQ分析（图3F）。使用Ensembl Biomart软件包（2.48.3）将鼠标基因符号转换为人类基因符号。通过CBIOPORTAL47（https://www.cbioportal.org/study/summary?id=brca_tcga_tcga_pan_pan_pan_pan_pan_can_atlas_2018），通过CBIOPORTAL47（https://www.cbioportal.org/study/summary?id）访问了来自TCGA乳腺癌队列的表达数据集。如上所述，对TCGA报告的基因组馏分的顶部或底部三位数进行比较的GSEA进行了比较。 并使用与上述相同的参数（图3F）。使用DESEQ2软件包（v。1.36.0）计算了Log2转换的倍数更改，并使用BioConductor中的PathView Packake（v。3.15）生成了使用PathView Package（1.36.0）生成KEGG途径（扩展数据图9D）。

　　如先前所述48。核样品上的ATAC-SEQ程序是在使用相同方案分离后立即进行的，但没有裂解步骤。原发核与微核的比率为1:20。用50 bp配对的末端读数对库进行测序，每样品的细胞读取约5000万个读取，而对于核样本，在纪念sloan sloan kettering kettering kettering cancer Cancer Integrated Genomics Core的每个样本中，用50 bp配对的末端读取到3.5亿个总读数进行测序。对于DLD-1和RPE-1细胞中的染色体-4-米斯分类实验，使用basePair Toolkit分析了RAW FASTQ数据。使用FASTP对原始读取进行修剪以从读取中删除低质量的基础（质量 <20) and adapter sequences. The trimmed reads were aligned using Bowtie2 as described49 to the UCSC genome assembly (hg38). For long-term dnMCAK and micronuclei ATAC-seq experiments in RPE-1 and 4T1 cells, reads were mapped to the hg38 (RPE-1) or mm10 (4T1) genome assembly using Bowtie2 with the following parameters: -X2000 --no-mixed --no-discordant and reads were filtered using samtools for the 1804 FLAG and mapq score of 30. PCR duplicates were identified using the MarkDuplicates function from Picard tools. Peaks were called per sample using macs2 with the following parameters: callpeak -f BAM -g hs --nomodel --shift 37 --extsize 73 --keep-dup all -B --SPMR --call-summits -q 1e-2. Final peaks across each dataset were determined based on an extension of 250 bp from the summit of each peak and merged across all samples using bedtools. Normalized bigwig files were generated using the bamCoverage function from deeptools using reads per kilobase of transcript per million mapped reads normalization. Heat maps for genomic regions were generated using the deeptools computeMatrix scale-region and plotHeatmap functions. Differential peak calling was performed using DESeq2 on raw counts for the merged peaks (an adjusted P-value cut-off of 0.01 and log2-transformed fold change of 1.5 was applied to the mouse 4T1 cell lines and an adjusted P-value of 0.05 and log2-transformed fold change of 0.75 was applied to the RPE-1 cell line). The normalized counts for peaks were used to plot the heat maps of differential peaks. Pie charts were generated using the plotAnnoPie function in the ChIPseeker R package. Pathway enrichment was performed on genes associated with differential peaks using the enrichGO function in the Bioconductor package clusterProfiler and similar pathways were merged in R using the ‘simplify’ function with a similarity cut-off of 0.7.

　　The k-means clustering of ATAC and H3K4me3 CUT&RUN data was performed on normalized count matrices with increasing k until the clusters became redundant. Hierarchical clustering was done using the pheatmap package in R. Peak annotation pie charts were created in R with the annotatePeak and plotAnnoPie functions from the package ChIPseeker. High-, medium- and low-expression groups were based on normalized expression from RNA-seq results in 4T1 dnMCAK cells and divided using the top, middle and bottom third of TPM (transcript per million) values. Peaks were annotated by gene and assigned to the expression group of the gene. ATAC and H3K4me3 CUT&RUN pie charts were based on differential peak overlaps obtained using bedtools intersect. Scatterplots were created using the normalized ATAC or H4K4me3 signal at ±500 bp surrounding a TSS and plotting the log2-transformed fold change of the averaged micronucleus/primary nucleus signal against the normalized gene expression of the matching gene.

　　WGS CRAM files were obtained from EGA (dataset ID EGAD00001004163) and unmapped from GRCh37 using samtools (version 1.3.1), and then aligned to GRCh38 using BWA-MEM (version 0.7.17-r1188). Copy-number profiles were called using Python software using the CNVKit library (version 0.9.7). Integer copy numbers were obtained using the CNVKit ‘call’ command, and non-integer copy numbers were obtained from the log2-transformed copy-number ratios reported in the CNVKit .cns files j.

　　ATAC-seq and CUT&RUN alignments were filtered from the BAM files to remove PCR duplicates, reads aligning with mitochondrial DNA, and alignments with low mapping quality (MAPQ score <15)

　　We used the ATAC-seq signal not to identify peaks corresponding to active transcriptional sites but to measure the total accessibility of DNA within a region. We generated ATAC-seq read counts for 10,000-bp genomic windows using samtools (version 1.13). We then calculated the signal values for each window by normalizing the read counts by copy number, chromosome length and total ATAC-seq reads across all chromosomes (Supplementary Fig. 5). Windows overlapping with unmappable regions (using the AmpliconSuite-pipeline genome annotation files), or with a copy number close to 0 (<0.3), were excluded from further analyses. The signal calculation for CUT&RUN data was done in the same way. The normalized signal of a clone c in a given window i with total (ATAC-seq or CUT&RUN) reads T(i) and copy number C(i) was calculated as

　　where R is the total number of ATAC-seq reads mapped across all chromosomes in clone c; L denotes the sum of ‘effective lengths’ of all the chromosomes. The effective length l of a chromosome is calculated as follows. Let P denote the expected ploidy (P = 1 for the Y chromosome; P = 2 otherwise) of the chromosome, and l(i),C(i) denote the length (in bp) and average copy number, respectively, of window i in the chromosome. Then,

　　In the case of the Y chromosome, we used only the region up to 26.68 Mbp for the above calculations because the Y chromosome did not have any confidently aligned ATAC reads beyond 26.68 Mbp until the telomeric region in any of the clones (including the parental clone).

　　The normalized ATAC signals of a clone can be compared to the parental signals by taking the log-transformed signal fold changes with respect to the parental signal in the same window.

　　The signal fold change (F) of a clone c in a given window I is given by:

　　where p is the parental clone.

　　We computed the mean and variance of log-transformed signal fold changes for each chromosome in a single clone to understand the global changes in accessibility (Supplementary Fig. 5). To control for high fold changes caused by error in windows with low read counts, windows in which neither the clone nor the parent has more than 200 reads were excluded from this calculation.

　　To understand whether the Y-chromosome accessibility changes were similar for different clones, we calculated the variance of log-transformed signal fold changes of different clones in the same genomic window. Windows where neither the clone nor the parent has more than 200 reads were excluded. Moreover, only clones with a copy number >窗口中的0.3用于方差计算。

　　我们使用Manta（1.6.0版）使用肿瘤/正常方法将父母克隆作为正常样本来调用所有克隆中的躯体变体。然后，我们检查了变体破裂密度与对数转换信号折叠的变化之间的任何相关性。我们还比较了仅包含所有区域的破裂区域的信号折叠变化方差，以确定可访问性的变化是否仅限于具有结构变化的区域。

　　使用Discovery Ultra Prokendor（Ventana Medical Systems，Roche），在MSKCC的分子细胞学核心设备上（Roche）在MSKCC的分子细胞学核心设备上进行了CGA，H3K27me3和H3K27AC的免疫荧光检测。热量32分钟（95°C）并用细胞条件1溶液（Ventana）处理后，在背景阻塞试剂（Innovex）中首先阻塞组织切片30分钟。小鼠单克隆CGAS抗体（LSBIO）的稀释度为1：200。将原代抗体孵育5小时，然后以5.75 µg mL-1的浓度孵育生物素化的抗小鼠次级（载体实验室）。Blocker D，Strettavidin – HRP和TSA Alexa 488（Life Tech）根据制造商的指示在1：150稀释，并孵育16分钟。以1：500的稀释度使用了H3K27me3（活性基序）的小鼠单克隆抗体（活性基序）。将原代抗体孵育6小时，然后以5.75 µg mL-1的浓度孵育生物素化的抗小鼠次级（载体实验室）。Blocker D，Strettavidin – HRP和Tyramide-CF594（生物群）根据制造商的说明在1：2,000的16分钟中稀释。兔多克隆H3K27Ac抗体（ABCAM）的浓度为0.05 µg ml -1。将初级抗体孵育6小时，然后将生物素化的山羊抗兔IgG（载体实验室）以5.75 µg mL-1的浓度孵育60分钟。Blocker D，Strettavidin – HRP和TSA Alexa 647（Life Tech）根据制造商的指示在1：150稀释，并孵育16分钟。在室温下将所有载玻片在5 µg ml-1 DAPI（Sigma D9542）中染色5分钟，用抗弹性安装培养基Mowiol [Mowiol 4-88（Calbiochem）]安装，并添加了盖子盖。956×956像素z堆栈图像是使用上述光学配置的倒置Zeiss LSM880获取的。采集以像素大小和停留时间分别为40 nm和4.39μs进行。 并使用以下激光器和相对功率：405 nm，为0.4％，488 nm为3％，561 nm为0.5％，为0.5％，为647 nm。如上所述，使用Zeiss Zen Black软件对图像进行处理。

　　为了检测新生的转录本，将细胞与1 mm 5-乙基尿苷孵育30分钟。根据制造商的说明（ThermoFisher），使用Click-IT RNA Alexa Fluor 594成像套件检测到5-乙基尿苷的掺入。然后将样品在抗体中孵育过夜。然后，使用免疫荧光显微镜和上面描述的组蛋白PTM定量方法对样品染色和定量进行了以下更改：对每个微核及其主要核进行了配对测量。对于所有测量值，计算了z评分，并将实验重复构成合并。带正Z分数的样品被定义为具有H3K27AC阳性染色。

　　对于免疫荧光与DNA FISH结合，如上所述进行免疫荧光程序，然后在1％多聚甲醛中进行固定15分钟，然后在Carnoy的固定剂在-20°C固定15分钟。染色体油漆探针购自metasystems。为了在相间细胞上进行鱼类，将在室内载玻片中培养的非同步细胞用PBS洗涤，并在室温下用Carnoy的固定剂固定15分钟。然后将载玻片在70％乙醇，85％乙醇和100％乙醇的顺序洗涤中脱水，然后驱动2分钟。将鱼探针应用于载玻片上的相间细胞，并用盖玻片密封。将样品和探针在75°C共同构成2分钟，然后用橡胶水泥密封，并在37°C下在加湿室中的37°C隔夜杂交。将载玻片用2×SSC洗涤3次，持续30 s。将载玻片冲洗在PBS中，用DAPI染色，在70％乙醇，85％乙醇和100％乙醇的顺序洗涤中脱水，并安装在延长的金抗弹性安装溶液中。

　　在成像前的第二天，将2500个细胞铺在同上8孔板室的每个孔中（µ-Slide 8井玻璃底部，Ibidi）。24小时后，按照制造商的说明，用PBS洗涤两次细胞，并用Nucspot Live 488（生物）或Nucred Live Live 647（Invitrogen）染料染色。当使用TNUCSPOT LIVE 488时，将染料与成像溶液中的细胞（活细胞成像溶液（Invitrogen）补充了10％FBS）一起孵育。在Nucred Live 647的情况下，将细胞用活细胞成像溶液洗涤4次，然后在补充有10％FBS的活细胞成像溶液中成像。将细胞成像在配备有计划的20x/0.8平方英尺空气物镜的轴观测器Zeiss Zeiss宽视野显微镜上成像，温度温度，二氧化碳和湿度​​和Hamamatsu相机。在488和647通道中每10分钟获取图像，其光源X-Cyte灯以20％的功率持续48小时。

　　RPE-1 cells were transfected with GFP–Cas9 (IDT) using the target sequence TTTAGTGCCCGGCCGCAAGG using the IDT Alt-R CRISPR–Cas9 sgRNA, 2 nmol platform final sequence: mU*mU*mU* rArGrU rGrCrC rCrGrG rCrCrG rCrArA rGrGrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArARurarg rurarg rcrara rgruru rarara rarura rargrg rcrura rgrurc rcrgru ruraru ruraru rcrara rcruru rgrara rgrara rarara rarara rgrurg rgrrurg rgrcrcra rcrcrg rargrg rargrg rcrgrg rcrgrg rurgrc rurgrc mu*mu*mu*mu*mu*ru。我们使用了Lipofectamine 3000（Thermofisher），并遵循制造商的协议。48小时后，根据制造商的协议，将单细胞分为单个井中，并使用4染色体涂料（metasystems）对克隆进行验证。通过DAPI染色筛选克隆以评估桥梁形成和微核速率。根据制造商的协议，使用4染色体油漆（metasystems）进行了辅助验证。然后，如上所述，对经过验证的克隆进行了DNA-Seq，RNA-Seq和ATAC-Seq的处理。

　　如所述50，从细胞沉淀中提取组蛋白蛋白，以确保单个组蛋白标记的质量识别和定量。简而言之，将组蛋白与冷冷的0.2 N硫酸（5：1，硫酸：沉淀）一起提取，并在4°C下与恒定旋转4小时孵育4小时，然后在4°C下与33％的三氯乙酸沉淀。然后除去上清液，然后用含0.1％HCl的冰冷丙酮冲洗管，使用100％冰冷的丙酮再次离心并再次冲洗。最终离心后，将上清液丢弃，并使用真空离心机干燥沉淀。接下来将沉淀溶解在50 mM碳酸氢铵，pH 8.0中，组蛋白进行衍生化，如先前所述50。简而言之，将5 µL丙酸酯和14 µL氢氧化铵（所有Sigma Aldrich）添加到样品中，以平衡pH值为8.0。将混合物孵育15分钟，然后重复该过程。然后用1 µg的测序级胰蛋白酶（Promega）在50 mM碳酸氢铵（1:20，酶：样品）中稀释的1 µg测序级胰蛋白酶（Promega）消化组蛋白。重复衍生化反应以衍生化肽N末端。最终将样品干燥在真空离心机中。在质谱分析之前，使用装有1 mg绿洲HLB C-18树脂（Waters）的96孔板过滤器（Orochem）对样品进行脱盐。接下来将样品重悬于100 µL的0.1％三氟乙酸（TFA）中，并加载到HLB树脂上，以前使用100 µL相同的缓冲液对其进行平衡。用100 µL 0.1％TFA洗涤后，将样品用含有60％乙腈和0.1％TFA的70 µL缓冲液洗脱，然后在真空离心机中干燥。

　　将样品重悬于10 µL的0.1％TFA中，并加载到Dionex RSLC Ultimate 300（Thermo Scientific）上，并与Orbitrap Fusion Lumos（Thermo Scientific）在线耦合。Chromatographic separation was performed with a two-column system, consisting of a C-18 trap cartridge (300 µm inner dimension, 5 mm length) and a picofrit analytical column (75 µm inner dimension, 25 cm length) packed in-house with reversed-phase Repro-Sil Pur C18-AQ 3 µm resin.使用300 nl min -1的流速，使用1–30％缓冲液B（缓冲液A，0.1％甲酸B，80％乙腈 + 0.1％甲酸）的30分钟梯度分离组蛋白肽。质谱仪设置为以数据独立的采集模式获取光谱。简而言之，在Orbitrap中，完整的MS扫描设置为300–1,100 m/z，分辨率为120,000（以200 m/z）和5×10-5的分辨率。在Orbitrap中使用50 m/z的顺序隔离窗口在Orbitrap中进行串联质谱法（MS/MS），AGC目标为2×10-5，高能量的C-TRAP C-TRAP分离碰撞能量为30。组蛋白肽原始文件被进口到Epiprofile 2.0 Software51中。从提取的离子色谱图中，获得曲线下的面积，并用于估计每种肽的丰度。为了达到PTM的相对丰度，将所有不同修饰形式的组蛋白肽的总和视为100％，并且特定肽的峰面积除以该组蛋白肽的所有修饰形式的总面积。通过平均每个片段离子的比率在两个物种之间的质量不同，可以估计两种同质形式的相对比。由附子型产生的肽列表导出到Microsoft Excel，并进一步处理以进行详细的分析，如下所述。组蛋白PTM量化是使用附正构2.0自动完成的 专门设计用于在质谱原始文件中提取组蛋白肽信号的软件51。通过进行提取的离子色谱法提取（联合国）修饰的组蛋白肽的丰度，即，在与肽计算的质量相对应的信号曲线下的区域。为了将原始峰面积转化为相对肽的丰度，给定组蛋白肽的未修饰和所有修改形式的总和，即所有具有相同基础序列的形式，都被视为总。接下来，将每个肽的面积除以该总数，以获得百分比的归一化相对丰度。在同种异性肽的情况下，即具有相同完整质量的肽（例如H3K18AC和H3K23AC），首先使用MS/MS片段离子来计算两种物种之间的比率并在百分比计算之前划分峰面积。最后，通过求和包含该修饰的肽的相对丰度获得的给定PTM的总丰度。例如，H3K9me3的最终相对丰度（发生在肽氨基酸9–17上）是通过求和被修改为H3K9ME3，K3K9ME3K14AC，H3K9ME3S10和H3K9ME3S10和H3K9ME3S10PK110PK14AC的肽的相对丰度获得的。重要的是要注意，微核中组蛋白PTM的变化不能归因于原发核和微核之间组蛋白H3总水平的差异（LC-MS/MS AUC（液相色谱和质谱法/质谱法）曲线下的质谱法/质谱区域）原代核和微核的3.39×1010±1.36×1010分别为P = 0.85，两侧t检验）或组蛋白尾尾的特异性降解，因为某些PTM在同一赖氨酸残基上差异化（例如，乙酰乙基化和乙酰化的损失和Trimethyl on h3k27）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。