Huh7.5（人肝细胞癌，C.B.W.的礼物），A549-ACE2（人肺泡基底上皮癌细胞，BEI Resources NR-53821），Vero E6，Vero E6（非洲绿色猴子肾细胞CRL-3216），HELA（人宫颈腺癌细胞，ATCC CCL-2），扁桃体（人扁桃体上皮细胞，UT-SCC-60A），HACAT，HACAT，HACAT（永生化的人角质形成细胞Dulbecco的修改后的Eagle培养基（DMEM）补充了10％热灭活的胎牛血清（FBS）和1％青霉素 - 链霉素（Pen-Strep）。在补充1％支气管上皮细胞生长补充剂（Sciencell 3262）的支气管上皮细胞培养基（Sciencell 3211）中培养HTEPICS（Sciencell 3220）。Calu-3（人肺腺癌细胞，ATCC HTB-55）在Eagle的最小必需培养基（EMEM； ATCC 30-2003）中培养，其中10％FBS和1％的笔迹。除非另有说明，否则所有细胞均在37°C下培养，并与5％CO2孵育。

　　HEK293T-ACE2，HELA-ACE2，TONSIL-ACE2，HACAT-ACE2和LET1-ACE2细胞是通过在上述原始细胞系中稳定表达人ACE2产生的。简而言之，通过用PLV-EF1A-HACE2-HYGRO，PSPAX2和VSVG转染细胞，将慢病毒包装在HEK293T细胞中。转染后48小时，收集培养基，通过0.45μm滤波器过滤，并将其添加到靶细胞24小时中。随后在进一步治疗之前，用湿霉素选择细胞7天。通过蛋白质印迹和病毒感染测试了ACE2的表达。

　　兔抗GAPDH单克隆抗体（60004-1-Ig），小鼠抗GFP TAG单克隆抗体（66002-1-Ig），兔抗PLSCR1多克隆抗体（11582-1-AP）（11582-1-AP），小鼠抗Halo TAG小鼠抗体单克隆抗体（28Aa）（29270-1-AP）和兔抗IFITM3多克隆抗体（11714-1AP）是从蛋白技术中获得的。兔抗NA，K-ATPase多克隆抗体（3010s），兔抗fag抗质量抗体单克隆抗体（14793s）和兔抗β-微管蛋白单克隆抗体（2128S）是从细胞信号中获得的。山羊抗ACE2多克隆抗体（AF933）购自研发系统。Mouse anti-PLSCR1 monoclonal antibody (MABS483), mouse anti-dsRNA monoclonal antibody (MABE1134), rabbit anti-TMEM16F polyclonal antibody (HPA038958), sheep anti-mouse IgG horseradish-peroxidase-conjugated secondary antibody (GENXA931-1ML) and绵羊抗兔IgG辣根 - 过氧化物酶偶联的二抗（Gena934-1ml）从Sigma获得。兔抗SARS-COV-2核素单克隆抗体（40143-R019）和兔抗SARS-COV-2 SPIKE S2抗体（40590-T62）购自Sino Biological。小鼠抗EEA1单克隆抗体（610456）是从BD生物科学获得的。兔抗LY6E多克隆抗体（AB300399）购自ABCAM。抗SARS-COV-2尖峰（GTX632604）的小鼠单克隆抗体是从Genetex获得的。驴抗山羊IgG辣根 - 过氧化物酶 - 偶联的二抗（PA1-28664），驴抗小鼠IGG Alexa fluoro-488（A21202），驴抗兔子IgG Altibit IgG Alexa igg Alexa fluoro-488（A21206），Donkey Antkey Antek-Mouse IGGIGENECA，（A10037），驴抗兔IgG Alexa Fluoro-568（A10042），驴抗小鼠IGG Alexa Fluoro-647（A32787）和Donkey Antikey Antikey Antike Antike Antike Antike Igg Alexa Fluoro-647（A31573）是从Thermo Fishericic购买的。兔抗SARS-COV-2尖峰（NR-53788）单克隆抗体，小鼠抗SARSARS-COV-2 Nucleocapsid单克隆抗体（NR-53792）和兔抗SARSARS-COV-2核酸-2核酸2核蛋白酶单克蛋白抗体单核抗体抗体抗体抗体抗体 （NR-53791）是通过NIAID的Bei Resources获得的。山羊抗小鼠Fab AF647（115-607-003）获自杰克逊免疫搜索。山羊抗兔IgG CF660C（20813）购自生物群。

　　Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（14190-144）和LB Miller Broth（BP1426-2）购自Fisher Scientific。FBS（10438-026），DMEM（11965-092），胰蛋白酶-EDTA（0.25％），带有苯酚红（25200072），Pen-Strep（15140122），Hanks的汉克斯的平衡盐溶液（HBSS），无苯酚红色（14025092），高gl glucose（14025092），luccose（14025092），100000,000,00046，luccose（121000）DND-189（L7535），Picopure DNA提取试剂盒（KIT01013），Lipofectamine 2000转染试剂（11668019），紫霉菌素二氢氯化物（A11113803）（H3570），Avidin珠（53150），卡替尼西林disodium盐（10177012），膜联蛋白V – AFAF647（A23204），Dithiothreitol（dtt，r0861）和Diic18（DIIC18）和DIIC18（D7757）（D7757）获得了Thereo Fishersocientic。从ATCC获得EMEM（ATCC 30-2003）。多聚甲醛（SC-253236）获自Santa Cruz Biotechnology。重组人IFNα2A（CYT-204），IFNβ1A（CYT-236）和IFNλ1（CYT-117）蛋白来自ProSPEC Bio。重组人IFNγ（285-IF-100/CF），TNF（210-TA-005/CF）和IL1β（201-LB-010）购自R＆D系统。荧光素酶测定试剂（E4550）和纳米GLO分析试剂（N2011）购自Promega。甲状酸酯（SML0057），E-64D（E8640），Brefeldin A（B652），羟基氯喹硫酸盐（H0915），纤维素（435244），多晶型氢丙酰胺（P9155）和Polybrene（tr-1003）均为s goly（tr-1003）。从Takara Bio购买了用于克隆的融合式快速组装主混合物（638948）和恒星竞争的细胞（636766）。从Cellvis获得了四孔室盖玻璃（C4-1.5H-N）。TWEEN-20（AB02038-00500）和二甲基亚砜（AB03091-00100）从American Bio获得。硫酸NHS-SS-BIOTIN（A8005）和离子霉素钙盐（B5165）购自Apexbio。多聚甲醛（PFA; 4％，SC-281692）从Chemcruz获得。戊二醛（50％，16320）是从电子显微镜科学获得的。Alexa Fluor 488 Chrompure人类转铁蛋白（009-540-050） 是从杰克逊免疫学获得的。从Roche获得了完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（11697498001）。从NEB获得了高保真2X PCR主混合物（M0541L）。

　　以下构建体来自Addgene：Plenti-Hace2-Hygro（161758），HIV-1 GAG-MCHERRY（85390），PLV-EF1α-ERES-HYGRO（85134），PLV-EF1A-EF1A-IRES-BLAST，BLAST（85133），PMSCV-blasticidin（PMSCV-BlasticidIdin（75085），lactrasticistin（75085），Lact-cfp，lactasticin（75085）。BAT COV-WIV1（PTWIST-WIV1-COVΔ18）（164439）和HCV糖蛋白表达质粒（PD603 H77 E1E2）（86983）的蛋白表达质粒（164439）和HCV糖蛋白表达质粒（PD603 H77 E1E2）。通过BEI资源，NIAID，NIH：与SARS相关的冠状病毒2，Wuhan-Hu-1 Spike D614G d614g d614g PSEUDOTYTE型慢病毒Kit（NR-53817）获得以下试剂，包括Plenti-luc2/Zsgreen，Phdm-Gag/polc-prc-recike11b，Phdm11b，Prc-prc-phdm，C.B.W.提供了编码SARS-COV-2（USA-WA1/2020），SARS-COV，MERS-COV和HCOV-NL63的尖峰蛋白的质粒。S. Chen提供了SARS-COV-2 Delta（B.1.617.2）和Omicron（B.1.1.529）的尖峰蛋白表达质粒。Yamamoto和Z. Matsuda提供了PMX-PH-HALO-LGBIT。CYPA-HIBIT由W.M.提供HCOV-229E（VG40605-UT），HCOV-OC43（VG40607-UT），HCOV-HKU1（VG40021-AUT）和EBOV（VG40304-CF）的HCOV-229E（VG40605-UT），HCOV-OC43（VG40607-UT）的表达质粒。PLV-EF1α-FLAG-IRES-HYGRO通过在启动子区域和多个克隆位点之间插入FLAG标签，从PLV-EF1α-IRES-HYGRO修饰。

　　通过使用plenti-hace2-hygro（Addgene 161758）作为模板，将人ACE2亚克隆用于PLV-EF1α-IRES-HYGRO载体。使用HUH7.5或A549细胞中的cDNA获得了编码人PLSCR1，TMEM41B，LY6E和IFITM3的全长cDNA。通过PCR从小鼠肝脏的cDNA获得了编码小鼠PLSCR1的全长cDNA。编码R. sinicus plscr1的全长cDNA（NCBI参考序列：XM_019748913.1）直接从Azenta – Genewiz直接合成。编码人CD74 P41（NCBI参考序列：NM_001025159）和NCOA7同工4（NCBI参考序列：NM_001199622.1）的全长cDNA。

　　通过克隆PCR片段将相应基因编码到PLV-EF1α-IRES-HYGRO载体中，通过输注克隆来生成PLV-HG-PLSCR1，PLV-HG-LY6E和PLV-HG-TMEM41B。通过将PCR编码PLSCR1克隆到PMSCV-blasticidin中来产生PMSCV-PLSCR1。PLV-FLAG-PLSCR1，PLV-FLAG-MPLSCR1，PLV-FLAG-BATPLSCR1，PLV-FLAG-TMEM41B，PLV-FLAG-FLAG-IFITM3，PLV-CD74-P41和PLV-FLAG-NCOA7同工4通过插入将PLV frv a INCOD-FVR-FVR VLV插入plv frv by-ncoa7同工4，从而产生输液克隆。通过将编码PLSCR1和EGFP的PCR片段克隆到PLV-EF1α-IRES-HYGRO VECTOR中来产生PLV-GFP-PLSCR1。PLV-LACT-C2-GFP是通过从Addgene购买的模板质粒扩增Lact-C2-GFP片段而产生的，并将其克隆到PLV-EF1α-IRES-HYGRO中。通过从PMX-PH-HALO-LGBIT扩增pH-Halo-LGBIT片段，然后将其克隆到PLV-EF1α-IRES-HYGRO中来产生PLV-PH-HALO-LGBIT。PLV-HG-PLSCR1-KKHA（K258K261H262A）;PLV -HG -PLSCR1 -H262Y，-H262Q，-H262A，-H262F，-H262W，-H262D，-H262E，-H262E，-H262K，-H262R，-H262R，-H262L，-H262L和-H262V;PLV-HG-PLSCR1-F281A;PLV-HG-PLSCR1（5CA）（C184C185C186PC188C189至AAAPAA）;PLV -PLSCR1 -I105A，-I108A，-I279A，-L283A，-L285A，-M293A，-M293A，-D242A，-D244A，-S260A，-S260A，-W263A，-W263A，-T264A，-T264A和-N276A;PLV-HG-MPLSCR1-Q271Y;PLV-HG-BATPLSCR1-Q286Y;MSCV-PLSCR1（5CA）;MSCV-PLSCR1-F281A;和MSCV-PLSCR1-H262Y是通过基于PCR的位置诱变产生的。PLV-HG-FLAG-PLSCR1-86-CT，PLV-HG-FLAG-PLSCR1-Δ86-118和PLV-HG-HG-FLAG-PLSCR1-1-1-190是通过编码相应的PLSCR1截断的PLSCR1截断的PPR片段而产生的

　　我们的研究中使用了以下病毒：SARS-COV-2 USA-WA1/2020（BEI Resources NR-52281），SARS-COV-2-MNG（C.B.W.的礼物），SARS-COV-2 Delta变体（B.1.617.2）（B.1.617.2（B.1.617.2）MHV-A59-GFP（BEI Resources NR-53716），登革热（DENV-I，BEI Resources NR-82）和HSV-1 VP26-GFP（A. Iwasaki的礼物）。

　　从先前的报告中，对全基因组CRISPR – CAS9敲除屏幕进行了修改。如先前所述52，对lenticrispr-V2合并库（Gecko V2）进行扩增。总共5×107 HUH7.5或A549-ACE2细胞被带有壁虎V2库（MOI = 0.3）的慢病毒转导（2μgml-1），持续5天。将存活的细胞分为两组（+或-IFNγ），并以每个烧瓶5×106的密度为20 T-175烧瓶。24小时后，添加IFNγ（R＆D系统），再增加20 h（HUH7.5的10 U mL-1，而A549-ACE2的70 U ml-1）。随后在MOI = 1（用于HUH7.5）或MOI = 0.3（对于A549-ACE2）的MOI = 1（用于HUH7.5）或MOI = 1（对于A549-ACE2），将细胞感染。在24 hpi（A549-ACE2）或48 hpi（HUH7.5）时，将细胞胰蛋白酶固定并固定在4％PFA中，持续30分钟，并在FACSARIA（BD）上进行分析。将细胞分为两组：根据MNG的强度，Mnghigh或Mnglow。根据制造商的说明，使用皮皮埃DNA提取试剂盒提取细胞DNA。使用高保真PCR主混合（NEB）扩增SGRNA序列，并从2.5％琼脂糖凝胶中纯化扩增子。使用Illumina HISEQ2500（每个样品读取4000万读）对扩增子进行了测序。Mageck算法对Mnghigh与Mnglow的基因富集进行了排名，并且在静止和IFNγ激活条件下每个基因的Mageck P值都被计算出来以进行比较。

　　将细胞固定并收集在FACS缓冲液（1×PBS，1％FBS，5 mM EDTA）中，并通过40 µM细胞过滤器过滤FACS使用BD FACSARIA进行分类。为了对HUH7.5和A549-ACE2细胞进行排序，在IFNγ-未治疗和IFNγ处理的条件下，绘制了大门将细胞分成Mnglow和Mnghigh种群。GFP受到488 nm激光的激发，并用550 nm滤光片检测到。根据其MNG强度对细胞进行分类，并将其收集到单独的管中以进行以后处理。用FlowJo（BD生物科学）分析数据。

　　将HUH7.5细胞用100 U ML -1IFNγ处理24小时。使用RNeasy Plus迷你试剂盒（Qiagen）分离总RNA。根据标准Illumina协议制备用于测序的mRNA文库。使用耶鲁干细胞中心基因组核心的Illumina Novaseq测序系统进行测序（100 bp，配对末端）。使用默认设置将RNA-Seq读数映射到以局部模式为局部模式的人类基因组（HG38）。使用功能列表的独特映射读取（截止：映射质量得分（MAPQ）> 10）用于编码基因注释（v.24）。用R包DESEQ2分析差异基因表达。具有log2转换的倍数变化> 1和调整后的p <0.05的转录本被视为差异表达。

　　使用Jaspar网站53（https://jaspar.genereg.net/）分析了人类PLSCR1基因的启动子区域。从NCBI下载了PLSCR1转录启动位点上游的2-KB区域的序列，并使用ISRE和GAS Profiles扫描Jaspar。将相对得分0.85设置为阈值。

　　对于使用SARS-COV-2-MNG的荧光记者测定，使用P3库存进行感染。在感染前2天，将细胞在96孔板的40％汇合度中播种。第二天，在感染前18小时，将细胞未经治疗或用IFNγ（HUH7.5：8 u ML-1; A549-ACE2：70 U ML-1）启动。在感染过程中，IFNγ将其保存在培养基中。分别以MOI = 1和MOI = 0.2感染HUH7.5细胞和A549-ACE2细胞。随后，在1 DPI（A549-ACE2）和2 DPI（HUH7.5）下，将培养基从井中取出，然后用PBS洗涤一次细胞，然后用PBS洗涤一次，然后用4％PFA固定30分钟，并用Hoechst 33342染色20分钟。然后，进行了细胞的高含量成像（Cytation 5，Biotek）以测量MNG表达。通过Gen5软件对每个细胞的MNG平均强度以及感染细胞的百分比进行了分析。在以下条件下进行其他细胞系的感染：Calu-3（MOI = 1，24 hpi），Hela-ace2（MOI = 0.2，24 hpi），tonsil-ace2（MOI = 1，24 hpi），HACAT-ACE2，HACAT-ACE2（MOI = 1，24 HPI）和LET1-ACE2（MOI = 0.1，24 HPI）。

　　对于SARS-COV-2 USA-WA1/2020的病毒RNA实验，DELTA变体（B.1.617.2）和Omicron变体（BA.1），HUH7.5细胞在感染前2天在12韦尔平板的40％融合中播种。在感染当天，分别以MOI = 1（2 dpi）感染了HUH7.5细胞，MOI = 0.5（1 dpi）和MOI = 0.5（1 dpi）。上述所有感染测定均在生物安全3级（BSL-3）设施中进行。

　　对于其他病毒感染，实验条件如下：HELA细胞在MOI = 0.2时用HSV-1 VP26-GFP感染48小时。LET1细胞在MOI = 0.1时用MHV-A59-GFP感染48小时。Huh7.5细胞在MOI = 0.1时用DENV-I感染24小时。随后，在1 DPI（A549-ACE2）和2 DPI（HUH7.5）下，将培养基从井中取出，然后用PBS洗涤一次细胞，然后用PBS洗涤一次，然后用4％PFA固定30分钟，并用Hoechst 33342染色20分钟。然后，进行了细胞的高含量成像（ImageXpress PICO，分子设备）以测量GFP表达。通过细胞Reporterxpress软件对每个细胞的GFP的平均强度以及感染细胞的百分比进行了分析。

　　为了进行共聚焦成像，用SARS-COV-2 USA-WA1/2020在1,000g，37°C旋转A549-ACE2细胞30分钟以同步感染，然后用预燃烧的PBS洗涤两次。将预热的DMEM添加到细胞中以启动病毒进入。将细胞在37°C的各个时间段内孵育。用于实验的MOI在图中指示。

　　第二天，将Vero E6细胞以每孔的9×105细胞播种，以感染6孔板，以感染SARS-COV-2 USA-WA1/2020。首先，除去介质，并用PBS洗涤每口一次。然后，将200 µl病毒的10倍连续稀释液添加到相应的孔中，每10分钟将细胞在37°C下孵育1小时。之后，将2 mL的覆盖培养基（DMEM，2％FBS，0.6％甲基纤维素）添加到每个孔中。在2 DPI时，除去培养基，并用PBS洗涤一次细胞。然后，用4％PFA固定细胞30分钟，然后用0.5％晶体紫溶液染色15分钟。最后，将细胞用PBS洗涤3次，然后干燥，然后再计算形成斑块形成单元（PFU）的数量。

　　在使用TRIZOL试剂（Thermo Fisher Scientific; 13778030）提取总RNA之前，将生长在12孔板中生长的细胞洗涤两次，然后用直接-Zol RNA MiniPREP试剂盒（Zymo Research; R2050）纯化。然后，使用Primescript RT Master Mix（Takara Bio; RR036B）对RNA进行反转录。使用Powerup Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Scientific; A25776）进行QPCR之前，将cDNA稀释为1：5。SARS-COV-2（US-WA1/2020，DELTA变体和Omicron变体）通过使用特定于Nucleocapsid（N）mRNA的引物（远前5'-GGGACTCTCCTGCTGCTGCTAGAAT-3';反向5'-cagacatttgctctctctcagctg-3''来量化复制。使用特定于非结构蛋白1（NS1）mRNA（正向5'-GCATATTGACGCTGGGAGAGAC-3';;反向5'-TTCTGTGCCTGCCTGGAATGATGCTG-3'的引物（NS1）mRNA（正向5'-GCATATTGACGCTGGAGAGAC-3'）对DENV-I复制进行定量。将所有病毒mRNA水平归一化为β-肌动蛋白（正向5'-Cattggcaatgagcggttc-3';反向5'-aggtctttgcggatgtgtgtgtcccacgt-3'）。对QuantStudio实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems）进行了反应。对于mRNA水平的相对定量，使用ΔΔCT方法比较循环阈值（CT）值。

　　在1.2×SDS -PAGE样品加载缓冲液中制备细胞裂解物。将细胞裂解物在SDS -PAGE（12％凝胶）上分离，并转移到聚偏二氟化物（PVDF）膜上（Millipore; IPVH00010）。将膜用1×TBST的5％牛奶（1×Tris缓冲盐水，0.1％Tween-20）封闭，然后在4°C下在5％BSA中与原代抗体孵育过夜。随后，将膜用1×TBST洗涤3次，然后与辣根 - 过氧酶偶联的二抗孵育。使用Clarity/Max Western ECL底物（Biorad; 1705062）暴露了膜，并使用Biorad Chemidoc MP系统检测到读数。

　　基于HIV-1的PSV是在镀在10厘米板上的HEK293T细胞中产生的。用慢病毒主链（9μgplenti-luc2/zsgreen）和辅助质粒（2μgPhdm-GAG/POL，2μgPrc-rev1b和2μgPrc-rev1b和2μgPhdm-Tat1b）转染细胞，以及与gllycoprototein gene的表达质粒（3）。在37°C下孵育4小时后，将培养基替换为新鲜培养基（DMEM，10％FBS，补充了笔迹）。转染后48小时收集PSV颗粒，通过离心（1,000g×5分钟）阐明，通过0.45 µm滤波器过滤，然后等分以在-80°C下存储。

　　mCherry-labelled HIV-based pseudoviral particles were prepared by transfecting 293T cells plated on a 10-cm dish with 9 μg pLV-EF1a-IRES-Blast, 4.5 μg psPAX2, 1.5 μg HIV-gag-mCherry and an expression plasmid encoding spike protein from SARS-CoV-2 Omicron variant (3 μg) by Lipofectamine 2000. At转染后48小时，将上清液通过0.45μm滤光片过滤，将上清液放在20％的蔗糖（1×Hbss中）垫子上，并使用Sorvall Th-641转子在100,000g下进行离心2小时。将上清液丢弃，并用500μL的DMEM细胞培养基重悬于沉淀中的假病毒颗粒。

　　在透明底部96孔板的每个孔中，总共将1.2×104 HUH7.5的细胞接种。两天后，将100 µL的PSV添加到每个孔中，并在室温下以1,000克离心30分钟。将感染的细胞孵育两天，然后在4°C下用1x无源裂解缓冲液（Promega; E1941）裂解20分钟。然后，将80 µL荧光素酶测定试剂（Promega; E4550）添加到裂解物中，并使用微孔板读取器（Biotek）测量相对发光。

　　在96孔板中，将HUH7.5和A549-ACE2细胞以每孔2.5×104个细胞接种。第二天，以以下浓度或稀释液在蛋白酶抑制剂上启动细胞：模拟DMSO（1：200），E-64D（25μM），Camostat（20μM），Brefeldin A（5μgmL-1）和HCQ（10μm）。三个小时后，分别以MOI = 1和MOI = 0.2的SARS-COV-2-MNG感染HUH7.5和A549-ACE2细胞。在感染过程中，抑制剂将抑制剂保存在培养基中。在1 DPI（A549-ACE2）和2 DPI（HUH7.5）时，用PBS洗涤细胞，然后用4％PFA固定。用HOECHST染色细胞核，并通过高含量成像测量MNG表达。

　　对于CALU-3中的抑制剂测定，将细胞在12孔板中以每孔2.75×105个细胞接种。当它们达到90–95％的汇合度时，将细胞与以下浓度或稀释液的蛋白酶抑制剂进行启动：模拟DMSO（1：800），E-64D（25μM）和果皮（25μm）。三个小时后，在感染期间将细胞在MOI = 1时感染了SARS-COV-2 USA-WA1/2020。将抑制剂保存在培养基中，并在37°C下孵育1小时，每10分钟轻轻摇动。之后，去除感染培养基，并用PBS洗涤两次细胞。然后，将带有抑制剂的新鲜培养基添加到每个孔中。在1 dpi。时，将细胞洗涤两次，然后使用Trizol试剂提取总RNA，然后使用Direct-Zol RNA MiniPrep试剂盒纯化。随后，使用特定于SARS-COV-2核素mRNA的引物通过QRT-PCR测量病毒RNA。

　　在6孔板中，将A549-ACE2细胞以每个孔的2×106细胞接种。两天后，用生物素标记细胞表面蛋白。首先，用DBPS+溶液两次洗涤细胞（DPB，补充了0.9 mM CaCl2和0.49 mM MGCL2，pH 7.4）。接下来，将细胞与2.5 mg ML-1生物素（EZ-linkTM Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin，Thermo Fisher Scientific）在DBPS+溶液中在4°C下孵育30分钟。之后，将细胞在100 mM甘氨酸中洗涤3次，持续5分钟，然后在20 mm甘氨酸中另外两个洗涤循环5分钟。随后，将细胞用裂解缓冲液（1％Triton X-100、50 mM Tris/HCl pH 7.4、150 mM NaCl，1 mM EDTA和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒）裂解，并将整个细胞提取物的一部分等分为输入。将剩余的提取物与4°C的摇杆上的Avidin珠一起孵育过夜。最后，将整个细胞提取物和珠（生物素下拉）的混合物用裂解缓冲液洗涤六次，然后煮沸以进行免疫印迹。

　　为了进行免疫染色，用PBS将在盖玻片上培养的细胞洗涤两次，用4％PFA固定30分钟，并用0.2％Triton X-100透化3分钟。将细胞用1％BSA在PBS中封闭1小时，并与原代抗体（1：50-1：200稀释）在4°C的PBS中孵育（1：50-1：200被稀释），然后在4°C下过夜，然后在室温下孵育二级抗体（1：500）。用Hoechst 33342（1：4,000稀释）染色5分钟。

　　使用Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜获得了所有共聚焦图像，该显微镜具有405 nm和488 nm激光器以及脉冲超脑白色光源（470 nm – 670 nm）。为了分析蛋白质的亚细胞定位，在HC PL Apo 100×100×油浸入物镜（N.A. 1.44）中拍摄图像（1,024×1,024），平均为4帧。为了确定DSRNA焦点的数量或SARS-COV-2核素的分布，在HC PL Apo CS2 63×油浸入物镜（N.A. 1.40）下拍摄图像（1,024×1,024），其平均为4帧。为了确定峰值和核素双阳性颗粒的数量，在光学截面的HC PL Apo CS2 63×油浸入物镜（N.A. 1.40）下获得了Z-stack图像（512×512）。

　　为了使PLSCR1包裹囊泡的形成的延时显微镜检查，在感染前一天，将A549-ACE2细胞播种在4孔腔室盖玻片（1.5）上。用麦克利标记的伪病毒在4°C下以1,000g的1,000克旋转30分钟。图像（512×512）在63倍的浸入式OMX SR显微镜系统上捕获，在63倍油浸入物镜（N.A. 1.40）下，在37°C，5％CO2和80％的湿度下，其间隔为1分钟约2小时。

　　在4PI Configuration 54中具有两个相反目标的定制显微镜上，在定制的显微镜上执行了两色4PI-SMS41。将A549细胞接种在30毫米直径的NO上。1.5h圆形盖玻片（Thorlabs），并在感染前生长1天。用4％PFA固定感染的细胞30分钟，并用0.2％Triton X-100透明3分钟。将细胞用PBS中的10％山羊血清阻塞1小时，然后在4°C下与小鼠抗PLSCR1和兔抗尖峰抗体一起孵育。通过山羊抗小鼠Fab AF647（Jackson Immunoresearch）和山羊抗兔IgG CF660C（Biotium）以1：200稀释（在室温下2小时）检测到原代抗体。将样品在3％PFA+0.1％戊二醛中固定10分钟，并在4°C下储存在PBS中。样品安装，图像采集和数据处理主要如前所述进行54，只是成像速度为200 Hz，642 nm激光强度约为12.5 kW cm-2。通常，记录了3,000×100〜200帧。DME用于漂移校正。使用Vutara SRX 7.0.06软件（BRUKER），使用点脱落模式（20 nm粒径）呈现所有4PI-SMS图像和视频。

　　图像是在LAS X（Leica），Softworx（V.7.0），Fiji或Imaris 9.8（Oxford Instruments）软件中处理的。使用默认设置在LAS X中进行荧光图像的反卷积。使用Imaris软件进行荧光共定位分析。通过为两个通道设置适当的阈值以避免背景信号，可以计算与LAMP1或CD63共定位的PLSCR1荧光信号的百分比以及Mander的重叠系数的百分比。使用Imaris自动检测到表面重构自动检测到PLSCR1阳性灶。通过将PLSCR1阳性焦点的总数或荧光强度除以每个随机选择的图像中的细胞总数，可以计算出每个细胞PLSCR1阳性焦点的平均数量或荧光强度。使用Fiji手动鉴定具有较大DSRNA焦点的细胞，并通过将DSRNA焦点的细胞数除以每个图像中的细胞总数来计算具有较大DSRNA焦点的细胞的百分比。使用斐济手动鉴定具有分散或内体核素信号的细胞。通过每个图像中的总细胞计数将带有指定核蛋白酶分布的细胞百分比标准化。使用Imaris自动鉴定尖峰和核素双阳性颗粒，每个细胞的平均双阳性颗粒数量通过每个图像中的总细胞数量标准化。对于所有图像分析，随机捕获了总共120-250个单元格的10-13张图像（如图中所示）。使用斐济手动对每个细胞中涂有PLSCR1的含SARS-COV-2-2的囊泡的百分比；在每种情况下计数约25个单元。

　　对于病毒结合测定，将A549-ACE2细胞预先冷冻至4°C，持续15分钟，然后在4°C下与SARS-COV-2（MOI = 20）孵育1小时。通过用预磨的PBS洗涤三次去除未结合的病毒颗粒。通过qPCR定量对β-肌动蛋白标准化的结合病毒的相对量。

　　对于病毒内在化测定，使用上述相同的条件将细胞与SARS-COV-2孵育。然后将细胞转移至37°C 30分钟，以允许结合病毒的内在化。通过在4°C下用0.25％胰蛋白酶处理15分钟的细胞去除非内在的病毒颗粒。作为阴性对照，在病毒结合以消化所有结合但不内端病毒后，将另一组细胞直接用胰蛋白酶处理。通过qPCR定量定量为β-肌动蛋白的内在病毒的相对量。

　　根据先前描述的40,55进行修饰的方法，进行病毒 - 细胞融合测定。通过将293T细胞转染在10厘米的盘子上，用9μgplenti-luc2/zsgreen，4.5μgpspax2、2μg cypa-hibit和3μgPVP40-Spike（由SARS-cove）（通过SARS-COV）转染，由9μgplenti-luc2/zsgreen，4.5μgpspax2、2000 cipe-pe）（通过SARS-cov）（通过SARS-COV）来制备，制备含有CYPA刺激性的假病毒颗粒，制备含有CYPA刺激性的颗粒。转染后48小时，将上清液通过0.45-μm滤光片过滤，将上清液放在20％的蔗糖（1×Hbss）垫子上，并使用Sorvall TH-641转子在100,000g下进行离心2小时。将上清液丢弃，并用500μL的DMEM+10％FBS培养基重悬于沉淀中的假病毒颗粒。

　　在感染前一天，用PMX-PH-HALO-LGBIT转染293T-ACE2细胞。Huh7.5细胞用PLV-PH-HALO-LGBIT稳定转导，然后选择7天的湿霉素（350μgml-1）选择。

　　将表达LGBIT片段的靶细胞铺在白色不透明的96孔盘中。电镀后的一天，用100μl含有CYPA-ribit的伪病毒在1,000g和4°C下旋转30分钟，然后在37°C孵育1 h（293t-ace2）或2 h（HUH7.5）。去除培养基，并将纳米基因测定试剂添加到靶细胞中。通过Spectramax I3X微孔板读取器（分子设备）测量互补的纳米核的活性。

　　根据先前描述的方法25进行修饰，进行病毒 - 细胞融合测定。如上所述，用编码隔离纳诺克群（pH-Halo-lgbit）的互补片段的构建体稳定转导的HUH7.5细胞（受体细胞），如上所述。将293T细胞（供体细胞）用编码SARS-COV-2 Omicron的尖峰蛋白的质粒与编码HIBIT片段的分裂纳米构建体一起转染。转染后二十四小时，将供体和受体细胞（以1：1的比例）混合并在37°C下在96孔板中共培养18小时，然后分析前18小时。去除培养基，并将纳米基因测定试剂添加到靶细胞中。除去培养基，并将纳米基形测定试剂添加到细胞中。通过Spectramax I3X微孔板读取器（分子设备）测量互补的纳米核的活性。

　　为了可视化细胞 - 细胞融合后形成的合胞体，用编码SARS-COV-2尖峰蛋白和EGFP的质粒转导293T细胞。转染后二十四小时，将指示基因型的HUH7.5细胞与293T细胞在37°C下共培养18小时。用PBS洗涤细胞，用4％PFA固定并用Hoechst染色。如上所述，使用高含量成像（ImageXpress Pico，分子设备）获得图像。

　　根据先前的报告56对尖峰裂解测定法进行了修改。用含有SARS-COV-2尖峰的伪病毒颗粒在1,000g的4°C下在4°C下旋转24孔板上的A549-ACE2细胞。然后将细胞用DPB两次洗涤，并与预热的培养基一起孵育，并转移至37°C。在不同的时间点收集细胞，然后进行蛋白质印迹分析。完整的S2结构域和处理后的S2片段均通过特异性识别S2结构域的抗体检测到。用组织蛋白酶抑制剂E-64D处理的细胞用作阴性对照。

　　根据制造商的说明，使用与Alexa647（A23204，Thermo Fisher Scientific）结合的膜联蛋白V检测到PS外部化。简而言之，通过胰蛋白酶消化A549-ACE2细胞，旋转为200g，并用PBS洗涤两次。将细胞颗粒重悬于100μL的1倍结合缓冲液中（由制造商提供的5倍储备溶液制备），密度为每毫升5×106个细胞，并用DMSO或10μM离子霉素处理10分钟。随后将细胞与5 µL膜联蛋白V – AF647在室温下孵育20分钟，然后添加400 µL 1×结合缓冲液。然后使用Beckman Cytoflex S流式细胞仪（APC滤波器）分析细胞。

　　使用疯狂的python.py.py.py python script58组装了使用PLSCR1的AlphaFold57结构与N末端区域进行的粗糙粒度模拟，并在磷酸膜上（pC）peclosprane（Ref。59）和Martinize2（参考文献59）和Martinize2（参考文献60）组成，由磷酸脂质（PC）：2 pephosprane（PC）：pe磷酸叶酸酯和磷酸叶limavasticylAmolamine（2）。PC：PE：PS：PTDINS（4,5）P2（2：5：2：1）在上部小叶中。进行5 µs模拟以平衡系统。然后，使用CG2AT工具61将其回到原子分辨率。突变H262Y在此时使用Pymol进行，然后使用最陡的下降算法进行能量最小化步骤。另外，与先前所述的同一膜上使用Charmm-GUI（参考文献62,63）组装了带有棕榈酰尾部的原子系统。该蛋白质在残基C184，C185，C186，C188和C189上添加了棕榈酰链。

　　每个系统（棕榈酰化的野生型和H262Y突变体）进行了三个重复。每个模拟使用310 K时2 fs的时间步长使用Charmm 36m（参考文献64）力场和TIP3P水，为50 ns。水键角和距离受到沉降的约束（参考文献65）。使用LINCS算法66限制氢的共价键。速度recrecale67和parrinello-rahman68耦合方法与时间常数为τp= 1.0 ps和τt= 0.1 ps的压力和温度分别为0.1 ps。蛋白质，脂质和水和离子分别为温度耦合。使用gromacs v.2021.3（参考文献69）进行仿真。范德华相互作用使用了1.2 nm的单个切口。粒子网埃瓦尔德（PME）方法用于静电相互作用，切断为1.2 nm。

　　使用GMX RMSF工具在所有重复序列上计算RMSF，并在Pymol中可视化。用VMD进行氢键分析。

　　根据先前描述的方法70,71进行GPMV的制备。简而言之，将A549-ACE2-PLSCR1-KO细胞稳定过表达的GFP-PLSCR1-WT或-5CA被铺在涂有聚赖氨酸的T-25板上。24小时后，将细胞用1 µg mL-1 DIL-C18染色20分钟，用GPMV缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl和2 mM CaCl2）洗涤四次，并与1 ml GPMV缓冲液一起孵育，其中含有1.9 mm DTT和27.6mmmMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM。诱导后十六小时，从上清液中收集了GPMV，并新鲜用于分析。使用共聚焦显微镜检查GPMV的质量。

　　通过使用微管吸入GPMV，并使用被聚焦红外激光束捕获的球形珠来估算GPMV的膜弯曲模量。作用在系绳上的力为，其中κ是膜弯曲模量和σ是膜张力72。膜张力通过更改抽吸压力ΔP，σ=Δprp/[2（1- rp/rv）]而变化，其中RP和RV分别是微孔和GPMV的半径为73。对于σ的每个值，使用来自光学陷阱中心的被困珠的位移来测量所得的F。弯曲模量是从拟合的线的斜率估计的，该图作为σ的函数。对不同的GPMV重复该过程。

　　我们的家用光学镊子设置与旋转碟共聚焦系统74结合使用，该系统使我们能够验证野生型PLSCR1-GFP定位于GPMV膜，而5CA突变体在GMPV中分散分布。使用流体动力流方法75校准陷阱刚度，对于聚苯乙烯珠（直径= 3.15 µm，PP-30-10，Spherotech），为283 µm-1。

　　为了进行微管抽吸，我们使用了一个附着在可编程的三轴压电阶段（100 µm范围，P-611.3纳米接管）上的微孔支架，并配以控制器E-727和Mikromove软件，Physik Entrumente，Physik Entrumente），安装在用于粗制运动的手动操纵器上（Newport M-462，Newport，Newport，Newport，Newport）。将微目体和玻璃室涂有1％BSA涂层，以最大程度地减少GPMV粘附，并促进Micropipette内GPMV膜的自由流动。通过垂直移动连接到微型行李箱的水库来控制抽吸压力。在吸入GPMV之前，通过将珠子带到微量移液器（3-6 µm）附近，并调节储层高度，直到珠子停止移动，将压力归零。随后，将一个珠子捕获，并记录其零强度位置（X0，Y0）。然后，将GPMV与珠子短暂接触（大约1-3秒），然后被拉开以形成膜系绳。从图像堆栈的分析确定珠位置（X，Y）。通过视觉或通过释放陷阱并观察到珠子向GPMV的缩回来证实束缚的存在。系绳力是根据珠的位置偏离其无负荷值的偏差和使用定制编写的MATLAB程序74的陷阱刚度的。所有图和拟合均使用Origin 2023（OriginLab）完成。

　　对数据进行统计分析，并使用Microsoft Excel 2010或GraphPad Prism v.9.0进行绘制。D'Agostino和Pearson Omnibus正态性测试或Kolmogorov – Smirnov检验用于确定数据的正态分布。对于具有正态分布的数据，使用具有相等方差的组的双面学生的t检验进行了单个比较，而Welch的校正用于差异不平等的组。使用非参数测试（Mann – Whitney测试）分析了未遵循正态分布的数据集。通过单向方差分析（Tukey）的事后测试或Tukey的事后测试通过单向方差分析（Tukey）的事后测试或双向ANOVA评估了多个比较，而棕色 - 福利和韦尔奇ANOVA和邓内特（Dunnett）事后测试将棕色 - 福利和韦尔奇ANOVA用于具有平等差异的组。对于所有分析，P <0.05被认为具有统计学意义。结果报告为平均值±S.E.M.或平均值±S.D.如所示。计算P值的方法在图传说中指示。从统计分析获得的所有P值均在图表或源数据文件中列出。除非图中另有说明，否则将所有实验重复至少3次，结果相似。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。