包括16岁的18-30岁健康成年人，没有证据表明先前的SARS-COV-2感染或疫苗接种（血清疫苗）被包括在SCRNA-SEQ样本处理和分析的更广泛的队列（36名参与者）（参与者）的分析（参与者）中，作为人类SARS-COV-2挑战赛的一部分，由人类SARS-COV-2挑战赛的一部分，由伦敦帝国伦敦伦敦伦敦大学伦敦大学伦敦皇家大学伦敦大学伦敦大学伦敦大学伦敦皇家大学（Royal College nectruty），伦敦伦敦大学（Royal College nectry and London Scalles and London Scullsion）。从2021年6月到2021年8月，将这些参与者作为第5和6人群的一部分。此外，将20名健康的成年人作为同一研究的一部分（较早的同类群）7，而血液和鼻（中涡轮）样本被处理为Bulk RNA-Seq的样本，如前所述，如前所述为12（请参阅补充表1Q（请参阅补充表1Q）概述bulk rna-seq的样本及其样本，并列出了bulk rna-seq的样品。在这些参与者中，有十个人如前所述获得了先发制人的remdesivir 7。在入学前使用MOSAIQ COVID-19抗体微阵列（商）测试了志愿者是否存在抗SARS-COV-2蛋白抗体，并根据阳性测试以及根据临床病史，身体检查和筛查评估评估的风险因素排除了志愿者。参见参考。7有关包含和排除标准的完整列表以及有关挑战设置和道德规范的更多详细信息。简而言之，在筛查和学习入学之前，从所有志愿者那里获得了书面知情同意。临床研究已在ClinicalTrials.gov（标识符NCT04865237）中进行了注册。这项研究是根据协议，源自国际准则的共识道德原则进行的，包括赫尔辛基宣布和国际医学科学国际组织国际道德准则委员会，适用的ICH良好临床实践指南，，良好的临床实践指南， 以及适用的法律和法规。筛查方案和主要研究得到了英国卫生研究局-AD专家伦理委员会的批准（参考：20/UK/2001和20/UK/0002）。

　　符合注册标准的参与者11后来发现接种前中和和尖峰结合抗体的接种水平较低（请参阅下面的血清抗体滴定方法）。该个体被归类为基于病毒动力学的流产感染（请参见下面的病毒学方法）。经过测试时，发现该人的排除不会改变我们的任何结论（数据未显示）。

　　接种后跟踪参与者1年，并在未来的研究中收集了持续的样品和元数据，以使研究社区受益。没有观察到参加该研究的参与者在此最后时间（1年）中出现任何长圆形症状，其中包括研究临床医生的访谈以评估症状和完整的体格检查。所有参与者的UPSIT分数都恢复了基线，没有其他症状报告，生理观察和对生命体征的体格检查都被认为是正常的（包括温度，心率，血压，呼吸率，外周氧气饱和度[SPO2]，肺活量测定法和心电图）。值得注意的是，尽管大多数症状被认为是自发解决的，但作为单细胞组的一部分，有六位参与者（参与者2）在六个报告中报告了厌食症或障碍症，他们接受了额外的气味训练和短暂的类固醇（接种后28天）7。但是，这项研究主要集中在接种后的前28天（如下所述，一个参与者的46天除外，请参见下面的样本收集）。

　　值得注意的是，在参与者从隔离区出院并在第28天的随访之前（收集了其他血液样本）之后，两名参与者据报道要么有第一个SARS-COV-2疫苗（参与者9）或社区感染（参与者7）。简而言之，参与者9在接种后的第14天接受了第一次疫苗（在28天样本之前2周）。参与者7在他们的第二天访问之前测试了阳性。因此，随访延迟了2周，导致该参与者的第28天样本，而在接种后的第46天进行。对该参与者进行的ELISPOT揭示了在第28天和第90天的样本中的响应（数据未显示）。此外，接种后的第29天，参与者8测试了阳性，在他们的第28天样本后的第二天。但是，对于该参与者而言，ELISPOT在第28天没有响应，在第90天没有响应。请参见图1A参见图1A，概述每个参与者所包含的样本和时间点。这些人和时间点没有改变我们的任何结论。

　　参与者在第0天的剂量10 TCID50处通过野生型前alpha SARS-COV-2挑战病毒（SARS-COV-2/HUMAN/GBR/GBR/484861/2020）接种。接种后，穿鼻夹，以确保与鼻和咽粘膜的最大接触时间。每天使用羊群植入的拭子两次收集中脑前脑鼻和喉咙样品，并将其放置在3毫升的病毒转运培养基（BSV-VTM-001，Bio-Serv）中，该介质（BSV-VTM-001，Bio-Serv）等分并存储在-80°C下，以评估如下“病毒学”中所述的病毒动力学（感染状态）。接种后，参与者至少在隔离区隔离14天，直到满足以下排放标准：两次连续的每日鼻子和/或喉咙拭子，没有病毒检测或QPCR CT值> 33.5> 33.5，并且没有通过免疫荧光通过夜间孵化病毒培养的过夜孵化病毒培养。有关人类SARS-COV-2挑战研究中使用的方案和伦理的详细信息，请参见参考文献中方法的“挑战病毒”部分。7。

　　接种后，经过培训的医疗保健提供者在皇家自由医院收集样品，并在接种后第1、3、5、7、10和14天。要求参与者清除其鼻腔中的任何粘液，并使用floqswab（Copan羊群羊群，参考文献501CS01）收集鼻咽样品，沿鼻中隔插入，上方，鼻腔上方的鼻腔上方，直到鼻咽中有轻微的阻力。然后将拭子在两个方向上旋转10 s，并在仍旋转时缓慢去除，并立即将其存储在含冷冻培养基的湿冰中（90％热灭活的FBS和10％二甲基亚硫代氧化物（DMSO））。在湿的冰上，将冰冷的人转移到医院的水井，在那里他们被送到实验室（<2 min at room temperature), placed in a slow-cooling device (Mr. Frosty Freezing Container, Thermo Fisher Scientific) and stored at −20 °C until all samples were collected, at which point they were moved to −80 °C freezers for at least 48 h for optimum freezing. Samples were moved and stored in liquid nitrogen for later processing.

　　Peripheral whole blood was collected at the Royal Free Hospital in EDTA tubes at 5 time points: day –1 (pre-inoculation) and days 3, 5, 10, 14 and 28 after inoculation. Each day, the blood was transferred at room temperature to Imperial College London for fresh isolation and collection of PBMCs by means of Histopaque Ficoll separation (Merck, H8889-500ML). The peripheral whole blood was first diluted 1:1 with 1× PBS (Merck, D8662-500ML) before being gently overlaid onto a maximum of 15 ml of Histopaque, at a ratio of 2:1 (blood to Histopaque). The samples were then centrifuged at 400g (with no breaks) for 30 min at room temperature and the PBMC white buffer layer was collected, washed (with PBS about 50 ml) and spun down (400g for 10 min at room temperature), before the supernatant was carefully discarded and the cell pellet was resuspended in 10 ml PBS. The cells were filtered using a 40 or 70 μm cell strainer and then both the cell number and viability were assessed using Trypan Blue. The cells were further centrifuged (400g for 10 min) and resuspended in the required volume of cell freezing medium (90% FBS (Sigma, F9665-500ML) and 10% DMSO (Sigma, D2650-100ML)), before being cryopreserved at −80 °C using a slow-cooling device. The blood and nasopharyngeal samples were collected within 2 h of each other.

　　Participants were carefully monitored and assessed daily using an array of blood tests, spirometry, electrocardiograms and clinical assessments (vital signs, symptom diaries and clinical examination). Full details of all the safety and clinical data collected with the human SARS-CoV-2 challenge study can be obtained in the methods in ref. 7, with an overview of metadata and demographics for the 16 participants enrolled for the scRNA-seq part of this study (up to 28 day after inoculation) in Supplementary Table 1g.

　　From 24 h after inoculation, twice daily samples (swabs) were taken at 12-h intervals from both the nose (mid-turbinate) and throat (pharyngeal) to assess and quantify the viral kinetics of each participant before and after inoculation (morning and afternoon) for their quarantine period (minimum 14 days, which was extended with the continued detection of virus). These were measured using two independent assays: (1) RT–qPCR with N gene primers/probes adapted from the Centers for Disease Control and Prevention protocol34 (updated 29 May 2020); and (2) quantitative culture by focus forming assay (FFA). For full details of each assay and statistical analysis, refer to the methods in ref. 7.

　　The lower limit of quantification (LLOQ) for RT–qPCR was 3 log10 copies per ml, with positive detections less than the LLOQ assigned a value of 1.5 log10 copies per ml and undetectable samples assigned a value of 0 log10 copies per ml. only samples in which participants presented with consecutive positive RT–qPCR results were further tested using the FFA assay. In the FFA, the LLOQ was 1.27 FFU ml−1. Viral detection less than the LLOQ was assigned 1 log10 FFU ml−1, and undetectable samples were assigned 0 log10 FFU ml−1.

　　Infection intervals for each participant were calculated based on the time of the first and last RT–qPCR test with detectable virus (across the nose and/or throat), time points in which tests below the LLOQ (1.5) were also counted if they occurred <2 days of a quantifiable (>LLOQ) test result.

　　An overview of the virology in each of the 16 participants included in the single-cell cohort (<28 days after inoculation) is provided in Extended Data Fig. 1b,c, with CT and FFA (virus titre) values provided in Supplementary Table 1a,b,h,i.

　　A sustained laboratory-confirmed infection was defined as quantifiable RT–qPCR detection greater than the LLOQ from mid-turbinate and/or throat (pharyngeal) swabs on 2 or more consecutive 12-h time points, starting from 24 h after inoculation and up to discharge from quarantine. Participants for whom only a single or two non-consecutive RT–qPCR tests returned quantifiable results (>LLOQ) were classified as transient infections. Participants for whom no RT–qPCR tests returned quantifiable results (>LLOQ）分类为流产感染（扩展数据图1B和补充表1A，B，H，I）。根据这些参与者在这些参与者中分别导致持续，瞬态和流产的病毒复制导致病毒暴露导致病毒暴露的假设仔细选择了持续，短暂和流产感染组的命名法。在这里，持续的感染事件类似于典型的COVID-19病例，病毒感染后，病毒通过上呼吸道组织扩散并复制至高度可检测的水平。瞬态感染代表了一组新的病例，我们提出已经发生了成功但有限的复制感染，导致可检测到边缘的病毒载荷。最后，我们建议在属于流产感染组的参与者中发生了非复制性病毒感染（即流产病毒感染）。

　　冻结后，鼻咽拭子被转移到伦敦大学学院的第3类设施中，并以7-8个样品的批量处理和处理单细胞悬架。所有工作均在符合标准类别的3级安全实践中在MSC I级引擎盖中进行。根据先前描述的方案35,36进行了鼻咽拭子的分离和收集，并进行了较小的修改。这种方法涉及多次平行洗涤和消化步骤，同时使用鼻咽拭子，并收集了冷冻和洗涤培养基，以确保最大的细胞恢复。首先，将样品暴露于DTT 15分钟，然后将ACCUTASE消化步骤接触30分钟，然后在同一样品（直接从拭子或冷冻培养基中收集并从该拭子中洗涤）的细胞在检查细胞数和生存能力之前被淬灭，汇总和过滤。

　　简而言之，将样品迅速解冻（管A），并在空的15 ml猎鹰管中收集的液体（管B）。然后用1 ml温暖的RPMI 1640培养基小心地将冰冷的，盖子和拭子小心地冲洗三次，该培养基被滴入15 mL管中，同时轻轻旋转管子以缓慢地从冷冻培养基中缓慢稀释DMSO，以防止细胞破裂。等待1分钟后，将管子（B）额外添加到额外的2 ml温暖的RPMI 1640培养基上，并在400g下在4°C下离心5分钟。然后将细胞沉淀重悬于RPMI 1640和10 mM DTT（Thermo Fisher，R0861）中，并在热糖器（37°C，700 r.p.m.）上孵育15分钟，以上述为单位，并在上面进行离心，并在上面进行了上网，并且在pellet中被抽出，并在1毫升中求解了1毫秒（MERC4）。然后将其在Thermoxer（37°C，700 R.P.M.）上再孵育30分钟。

　　与在上面的细胞冷冻培养基的加工过程中并行，将拭子移至新的1.5 ml eppendorf管（管C）中，其中包含1 ml rpmi 1640和10 mM DTT，并放置在Thermomixer（37°C，700 R.P.M.M.）上15分钟。根据上述步骤，接下来将拭子转移到一个新的1.5 mL eppendorf（Tube d）中，该拭子含有1 ml Accutase，并在37°C下与搅拌（700 r.p.m.）一起孵育。从鼻咽拭子孵育（在管中）的1 ml RPMI 1640和10 mM DTT在400g下在400g下在4°C下离心5分钟至PELLET细胞，将上清液丢弃，并将细胞颗粒置于1 ml Accutase和30分钟的30分钟（7分钟）中，并在37°C中重新固定。

　　在ACCUTASE消化步骤之后，将所有细胞（管B，C和D）组合在一起，并使用70μM尼龙滤网（用3毫升淬灭培养基预润湿：RPMI 1640，10％FBS和1 mM EDTA（Invitrogen）（Invitrogen，15555785-038））中的所有细胞（1555785-038-038-038））在50毫升conical conical in Conical Timal（in Invitrogen）（Invitrogen，1555785-038））（in Invitrogen（Invitrogen）（1555785-038））。然后将过滤器，试管和拭子用淬灭培养基彻底冲洗，以收集所有细胞，并将洗涤物组合在一起。然后将解离的过滤细胞（管E）在400g下在4°C下离心5分钟，并丢弃上清液。将细胞颗粒重悬于残余体积（约500 µL）中，并转移到新的1.5 ml eppendorf管（管F）中。然后将管E用另外500 µL的RPMI 1640用10％FBS洗涤，并与管子F结合使用，如上所述，上述取消，然后将上清液切除，细胞重悬于20 µL RPMI 1640和10％FBS中。使用锥形蓝色，评估了总细胞计数和生存能力。根据10倍铬手册，调整细胞浓度，以使7,000个靶向细胞回收率加载到10倍芯片上（每µL 700至1,000个细胞之间），并使用铬的下一个GEM单细胞V（D）J Reagent Kit Kit Kit Kit Kit Kit V.1.1（Rev E Guide）立即处理10 x 5'单细胞捕获。对于恢复少于13200个总细胞的样品，所有细胞均已加载。

　　请注意，由于样本类型，必要的冻结过程以及无法对3类流动设施进行排序的访问，因此，所处理的大多数样品被认为具有较低的生存能力（范围为5.4％至57.85％，而处理样品的平均生存能力为26.89％）。

　　将冷冻的PBMC样品解冻并分批16，以实现精心设计的合并策略。在这里，每个样品被汇集两次，分为两个不同的池，从混合时间点，每个池最多包含四个PBMC样品。请注意，每个捐赠者只有一个样本一次合并在一起，以协助随后的反复分解。这种合并策略用于帮助删除并纠正任何基于协议的批处理效果。

　　简而言之，在水浴中将PBMC样品迅速在37°C时迅速解冻。温暖的RPMI 1640培养基（20–30 mL）含有10％FBS（RPMI 1640和FBS）在300G离心5分钟之前缓慢地添加到细胞中。随后在5 ml rpmi 1640和FBS中洗涤。收集PBMC颗粒，并使用锥虫蓝确定细胞数和生存能力。

　　然后将来自4个不同捐赠者的PBMC合并在一起（每个供体的1.25×105 PBMC），以组成5.0×105个单元格。其余细胞用于DNA提取（Qiagen，69504）。将合并的PBMC重悬于22.5 µL细胞染色缓冲液（Biolegend，420201）中，并在冰上与2.5 µL Human Trustain FCX Block（Biolegend，422301）在冰上孵育10分钟。然后根据制造商的说明（每个游泳池1小瓶），用TotalSeq-C人类鸡尾酒（Biolegend，399905）染色PBMC池。有关TotalSeq-C抗体的完整列表（130抗和7个同种型控件），请参阅补充表1J。在与TotalSeq-C人类鸡尾酒V1.0抗体（在黑暗中4°C下）进行了30分钟的孵育期之后，使用细胞染色缓冲液向上向上添加PBMC，并将其离心至小节（在4°C下为500 g），以下是超级中断的。然后，使用重悬式缓冲液（HBSS中的0.05％BSA）重新悬浮并以相同的方式重悬于2次，然后最终重悬于20-30 µL重置缓冲液中，然后再次计数。然后将PBMC池立即处​​理以进行10x 5'单细胞捕获（Chromium Next Gem单细胞V（D）J试剂盒V.1.1具有针对细胞表面蛋白质ret-Rev d方案的特征条形码技术）。从每个池中加载了总共25,000个电池，直达10倍芯片。

　　为了进一步验证和研究我们的单细胞数据集中的SARS-COV-2抗原特异性T细胞种群，第10、14和28次接种后所有16位参与者的接种后PBMC样品进一步富集并处理单核测序，用于使用44个SARS-2抗原 - 抗原 - 抗原特异性dcude dcude dcude dcude dcude decude dexcude decude dextrabic（10x）的单细胞测序（可见）完整面板）。该面板包括五个抗原特异性T细胞种群，涵盖了四个MHC I类和一个MHC II类等位基因（总共覆盖15名参与者；请参阅补充表1L）和几个阴性对照。然后将样品用几种FACS抗体（用于单核细胞和T细胞）染色，并使用MacSquant Tyto细胞分系剂（Miltenyi Biotec）进行排序，然后收集PE-DCODE脱氧剂阳性细胞并处理以进行10x 5'单细胞捕获。这通过将单细胞V（d）J表达叠加到Dcode Dextramer阳性细胞簇上来定量配对的克隆TCR序列和TCR特异性。

　　葡萄糖染色方案取自Immudex，并进行了优化和适应以适合我们的样品以及汇总和染色策略。简而言之，将PBMC样品融化为7-8个样品的批处理，并为每个样品的细胞数和使用锥虫蓝色计算的细胞数和生存能力，如上所述。然后将每个样品中的所有细胞一起在新鲜的1.5 mL eppendorf管中合并在一起。请注意，这里的汇总策略是，每个参与者或每个池只使用一个样本或供体来启用基因型的随后反复替代，每个池都包含时间点的混合物，以帮助减少批处理效应。为了确保收集尽可能多的细胞，然后用200 µL染色缓冲液（1×PBS pH 7.4含有5％热灭活FBS（Thermo Fisher Scientific，10500064）和0.1 G L – L – 1 Herring Sperm DNA（Thermo Fisher Scientific，Themo Fisher Scientific，15634017）和pool pool。然后将管子上装满1.4毫升，并用染色缓冲液向下离心至颗粒（400g在4°C下持续5分钟）。仔细去除上清液，并根据颗粒的大小轻轻重悬于总计30-40 µL染色缓冲液中，准备染色。

　　同时，根据制造商的协议制备了Dcode Dextramer Master Mix（在黑暗中）。To help avoid aggregates, each individual Dextramer reagent was first microcentrifuged at full speed for 5 min before adding 2 µl from each dCODE Dextramer specificity to a low-bind nucleus-free 1.5 ml Eppendorf tube (Eppendorf, 30108051) containing 8.8 μl 100 μM -Biotin (Avidity Science, BIO200) (0.2 µl- 生物素每数量的dcode脱氧剂特异性，即44）。在将总体积（96.8 µL）添加到重悬的细胞中之前，将Dcode Dextramer主混合物通过轻轻的移液混合。然后将样品在黑暗中彻底混合并在室温下孵育30分钟。在添加了抗人CD14-FITC（Biolegend，325603）和CD3-APC（Biolegend，300458）（在1:50）之后，将细胞再孵育20分钟（在室温下在黑暗中），然后用洗涤液（1×PBS PH 7.4含5％含量）添加到1.4 ml，然后将其孵育至1.4 ml，含有1.4 ml。将细胞离心至沉淀物（400g在4°C下5分钟），并丢弃上清液。然后将洗涤步骤重复2次，后者使用1.4 ml洗涤缓冲液和1：5,000 DAPI（Sigma）作为活/死污渍。除去上清液，并将细胞沉淀重悬于4 mL FACS缓冲液中（1×PBS，1％FBS，25 mM HEPES（Thermo Fisher Scientific，15630-056）和1 mM EDTA）。然后根据制造商的指南（设置：混合速度= 800 r.p.mm，comberm = 4°C，压力= 150 hpa，噪声theashold = 14.40，trest = 14.40，使用MacSquant Tyto细胞混蛋对样品进行过滤样品（35 µM尼龙网细胞过滤器）和Pe Dcode脱氧阳性细胞进行排序。请注意，为了在分类过程中收集尽可能多的单元，整个样品都在MacSquant Tyto上运行， 通过收集并重新运行的负面运行，以确保不会丢失真正的阳性。有关分类的门控策略，请参见图8D。然后收集PE Dcode葡萄糖阳性细胞，离心（400g在4°C下持续5分钟），然后在计数细胞之前重悬于重悬培养基中。然后对整个样品进行10x 5'单细胞捕获的处理（Chromium NEXT GEM单细胞V（D）J试剂盒V.1.1具有特征条形码技术用于细胞表面蛋白质REV D方案）。对于收集超过25,000个单元的情况，样品平均分配并在两个车道上加载。

　　为了提供其他控件，还处理并用于确定背景噪声，并处理了具有非兼容HLA类型的参与者，包括一名志愿者（参与者_4）匹配多代价Dcode dcode Dextramer面板的HLA类型。

　　铬的下一个宝石单细胞5'V（d）J试剂盒（V.1.1化学）用于所有鼻咽拭子样品的SCRNA-SEQ库构造，并且铬铬的下一个GEM单细胞V（D）J试剂盒（D）J试剂盒v.1.1带有用于PBMCS的细胞表面蛋白的特征型蛋白质技术，用于pbmcs conse pbmcs conse pbmcs，抗体面板和Dcode Dextramer（兼容10倍）面板。GEX和V（D）J库是根据制造商的协议（10X基因组学）使用单个铬i7样品指数制备的。如前所述37，基于内部方案生成了其他TCRγ/δ富集的文库。细胞表面蛋白质库是根据制造商的协议创建的，其略有修改用于创建由Cite-Seq抗体面板产生的库。其中包括每反应的Si引物量加倍，并将放大周期的数量减少到指数PCR期间的7，以避免雏菊链效应。GEX，V（D）J和Cite-Seq衍生的细胞表面蛋白索引库的比例为1：0.1：0.4，并在Novaseq 6000 S4 FlowCell（配对 - 端，150 bp读取）上进行测序，旨在至少50,000个单元格和5,000个单元格式读取的小组读取量和5,000个单元格，并读取5,000个单元格（pertean pertean perte perte perte perte pertean deff and-reade）。库。葡聚糖衍生的细胞表面蛋白索引库的比例为0.1。

　　从PBMCS的SCRNA-SEQ和CITE-SEQ数据与GRCH38参考（cellranger（V.3.0.0）提供的10倍基因组学）共同对齐，并使用Cellranger（V.4.0.0）进行比对。Cite-Seq抗体衍生的TAG（ADT）条形码与供应商提供的条形码参考对齐，我们注明了该条形图，以添加信息蛋白质名称并在我们的GitHub存储库中提供（https://github.com/teichub.com/teichlab/covid-covid-19_challenge_study）。使用Starsolo（v.2.7.3a）将来自鼻咽拭子样品的SCRNA-SEQ数据与相同参考进行对齐，并通过从CellRanger提取的空滴管实现后进行后处理（V.3.0.2）。为了检测受感染细胞中的病毒RNA，我们在RNA-Seq比对中添加了21种病毒基因组，包括前Alpha SARS-COV-2（NC_045512.2）的RNA-SEQ比对的上述参考基因组，如前所述6。使用CellRanger（V.4.0.0）将单细胞αβTCR和BCR数据与所提供的10倍基因组学的随附的GRCH38 V（d）J参考对齐。使用CellRanger（v.6.1.2），将单细胞γδTCR数据与10倍基因组学（V.5.0.0）提供的GRCH38参考对齐。

　　使用Soupx38校正SCRNA-SEQ和ADT-SEQ数据，以删除自由浮动和背景RNA和ADT。为了纠正ADT计数，Soupx 1.5.2参数soupquantile和Tfidfmin参数分别设置为0.25和0.2，并降低了0.05的降低，直到使用自动段函数计算污染分数。使用默认设置对RNA数据进行soopx。为了自信地注释SARS-COV-2感染的细胞，我们使用了由SoupX校正的病毒RNA计数来消除由于自由漂浮的SARS-COV-2病毒体而消除误报。但是，当量化图2H中每个单元的读数量及其在图2F中的病毒基因组上的分布时，我们使用了原始计数和测序数据。为了介绍病毒读数的分布，我们从PICARD（https://broadinstitute.github.io/picard/）中删除了与标记的BAM文件中的PCR重复项，并使用每个序列读取的启动SARS-COV-2基因组中的位置。从Filtered_feature_bc_matrix文件夹中导入对齐的SCRNA-SEQ数据，以进行处理（V.4.1.0）进行处理，仅将检测到至少200个RNA特征的单元格保持。分别排除了超过50％和10％来自线粒体基因的鼻咽细胞和PBMC。通过将汤X校正的基因表达和ADT计数通过将其除以每个单元的总数并乘以10 000，然后添加一个和自然的gog转换（log（1p））。

　　将每个PBMC样品汇集两次，分为两个不同的池，每个池，每个池最多四个PBMC样品，然后是Cite-Seq和Single-Cell V（D）J测序，如上所述。SOODORCELL（v.2.0）39用于根据混合样品之间的基因型差异来消除每个池。使用SKIP_REMAP参数启用了SOODORCELL分析，并使用软件提供的常见SNP数据库进行了分析。我们使用两种互补方法将参与者的身份分配给每个汤群集群。首先，我们将簇基因型与SNP阵列得出的基因分型数据进行了比较，该数据为所有参与者生成，并使用剑桥基因组服务使用Affymetrix UK Biobank Axiom阵列套件进行了进行。其次，每个池中的样品的组合都是唯一的，它基于两个单独的池中相同基因型的独特特定于参与者的组合，可以分配参与者身份。这种多重和复制策略进一步使我们能够在下游分析中将库的特定批处理效应与参与者的特定效果区分开。

　　我们通过选择包含来自不同参与者的两种基因型的液滴来识别PBMC中的地面双线双线的输出。然后，我们将这些基真实双重击子包括在亚集群和细胞状态注释的迭代弹中，以查找出现的Doublet特定簇，然后我们随后将其删除。在亚集群和细胞状态注释的迭代弹过程中，通过识别从多种不同细胞类型表达标记基因的细胞簇来删除鼻咽数据中的双线。

　　主成分分析以来自选定的高变量基因的校正基因表达计数进行，并选择前30个主要成分以构建最近的邻居图和UMAP嵌入。我们使用Harmony40对测序库身份的PBMC数据进行批处理校正，以消除技术批处理效果。Leiden clustering41 performed at resolutions of 0.5, 1, 4 and 32 on nearest neighbour graphs and embeddings created with 500, 1,000, 2,000, 4,000, 6,000 and 8,000 selected hypervariable genes (excluding TCR and BCR genes) were used to perform iterative rounds of cell-type annotation based on marker gene expression and subsetting of clusters to obtain a highly granular cell state annotation.我们使用先前描述的细胞类型标记基因5,6来定义细胞类型。我们的细胞类型注释是由CellTypist42中提供的模型和基于先前描述的注释的定制训练模型的模型来指导的细胞类型标签。5,6。

　　在Scirpy43中导入对齐的单细胞BCR和αβTCR测序数据，以通过TCR或BCR格式化表获得细胞，然后将其添加到包含基因表达数据的Seurat对象中。使用蒲公英（V.0.2.4）44重新阐述了对齐的单细胞γδTCR数据。

　　我们使用deseq2（参考文献45）来识别显着变化的基因和基因集。在细胞状态和样品上对样品进行伪核，我们使用WALD测试来计算调整后的P值。为了鉴定与第1天的感染结果相关的基因，我们在感染样品中拟合了基因表达，这些基因在细胞类型，性别和感染结果上。我们还包括在PBMC的差异表达分析中将库身份测序作为协变量。为了量化干扰素刺激，我们使用了先前发表的基因签名6，并使用了Seurat的“ AddModulesCore”功能来量化其每个细胞的表达。如果模块得分高于0.5，则将细胞归类为干扰素刺激，并且通过Mann-Whitney U检验在模块得分上确定了显着性，该模块得分是通过Bonferroni方法对多重测试假设进行了校正的。

　　参考文献数据。使用单细胞分析Python Workflow Scanpy46处理了5,6,31,32,33。根据参考文献中概述的最佳实践，对每个数据集进行了单独过滤。47（每个细胞200至3,500个基因，每个细胞表达的线粒体基因少于10％，基因在少于3个细胞中表达的基因，默认情况下的其他参数）。在组合数据集之前，将基因集降低到其交点。细胞来自总共602名患者，有325例急性共同Covid-19，110例COVID-19患者，114名健康参与者和53名没有COVID-19的医院患者（对照组）（补充表1D）。这导致了一个综合嵌入，其中含有946,584个T细胞，由494个样品分辨出TCR，由455个供体组成，其中240名是急性Covid-19，82例患者是Covid-19，88名健康参与者的康复患者，有88名健康参与者和45名没有COVID-COVID-COVID-COVID-19（补充桌1E）的患者。集成对象中的供体总数较小，因为仅保留具有匹配V（d）J测序数据的样品。概率的SCVI模型（2个隐藏层，128个隐藏节点，20维潜在空间，负二项基因可能性，Default48的其他参数）在数据上训练了数据，以将其映射到共享的潜在空间，并使用UMAP可视化。

　　为了识别TCR克隆型组，我们使用了TCRDIST3（参考文献49）和提供的人参考，以计算所有已鉴定的TRA和TRB CDR3序列的距离矩阵的稀疏表示，而半径参数设置为150。然后，我们将TRA和TRB的距离求和以获得合并的距离矩阵。接下来，我们在5至150之间的可能的TCR距离阈值中迭代5至150，以5的增量在每个阈值下计算TCR克隆型组。然后，我们从不同的T细胞中生成了一个距离的TCR距离图，其距离低于阈值，该阈值群集以1个分辨率为1，并使用rbConfigurationVerverTeverteVerteTexpartition分区，用于使用Leiden41群集识别TCR Clonotype组。为了找到只有识别相同抗原的TCR分组在一起的最佳距离阈值，我们使用两种方法在每个阈值下量化了克隆型组污染。首先，我们假设被注释为幼稚的T细胞不应参与扩展的克隆型组，并量化了每个克隆型组中幼稚T细胞的比例，以确定我们观察到天真T细胞最小参与的最大阈值。其次，我们假设CD4+ T细胞和CD8+ T细胞绝不应成为同一TCR clonotype组的一部分，因此我们着手量化每个clonotype组中CD4+和CD8+混合的比例，以找到混合最小的最大阈值。两种方法均显示出相同的最佳阈值35，其中天真的T细胞参与以及CD4+和CD8+混合均最小，然后我们将其用于下游分析。为了识别激活的TCR克隆型组， 我们假设这些组应包括活化的T细胞，并且我们至少应该检测多种独立的TCR锁骨型，这些clonotypes似乎同时在相同的抗原上升高。因此，我们选择了至少包含一个参与激活的T细胞的克隆型组，其中至少包含两个独特的CDR3核苷酸序列。

　　为了鉴定在感染过程中激活的BCR clonotype基团，我们使用了与上述T细胞所述的类似方法。我们没有使用TCRDIST来计算距离，而是使用Levenshtein距离，并在1到20之间的可能阈值中迭代，通过量化幼稚的B细胞参与来找到最佳的阈值。这表明，Levenshtein距离为2是最佳的，可以识别仅包含识别相同抗原的B细胞的BCR克隆型基团。为了鉴定活化的BCR克隆型基团，我们假设这些组应包括分泌B细胞的抗体（浆膜和浆细胞），并且我们至少应该检测到似乎同时针对相同抗原的多个独立的BCR clonotypes。因此，我们选择了至少包含一种分泌B细胞的clonotype组，其中至少包含三个独特的CDR3核苷酸序列。

　　通过将每个clonotype组的CDR3氨基酸序列与ggseqlogo r Package51或Logomaker Python Package 52提供，生成TCR和BCR徽标。当克隆型组包含可变长度的CDR3氨基酸序列时，我们选择了每组中最常见的长度的序列仅用于可视化目的。

　　使用带有泊松结果的GLMM对每个样品中每个细胞类型的细胞的相对丰度进行建模。当有技术重复（大多数PBMC样品）时，将它们建模为单独的样本。我们对参与者标识符进行了建模，这是自接种和测序库标识符（多重库）以来的几天，作为克服这些因素之间共线性的随机效应。通过与细胞类型的相互作用项来估计每个临床或技术因素对细胞类型组成的影响。在R上实现的LME4软件包中的GLMER函数用于拟合模型。使用NumDeriv软件包估算每个因素的方差参数的标准误差。使用LME4软件包中的RANEF函数获得了每个因素的折叠变化估算的条件分布。对数转换的倍数变化相对于接种前的时间点（第1天）。倍数变化估计的重要性是通过局部真实符号率来衡量的，这是效应估计方向是正确的概率，即，如果估计的平均值为正（如果估计的平均值为负，则为估计的平均值为正），则真实对数转换的折叠变化大于0的可能性。我们使用两样本z检验计算了p值，使用效果分布的估计平均值和标准偏差（对数转换的倍数变化）。使用Benjamini -Hochberg方法将P值转化为FDR。

　　为了从细胞态丰度推断时间，我们首先使用CellTypist42生成了一个逻辑回归模型，以预测PBMC或鼻咽细胞状态，基于高度详细的手动注释这项工作中介绍的细胞状态。在默认参数下对CellTypist模型进行了训练和使用，将Check_expression设置为false，Balance_cell_type设置为true，feature_selection设置为true，将MAX_ITER设置为150。我们下一步构建了一个预测模型，以推断时间，因为使用PBMC数据在此工作中呈现了PBMC数据，因此可以推断出时间，以推理时间。我们使用上述五项研究中提到的公开可用的PBMC数据作为测试数据集，以预测自病毒暴露以来的时间。由于自病毒性暴露于自疾病严重程度不同以来的症状以来，我们特别有兴趣比较时间，因此我们排除了这些特征未知的样本。为了确保训练和测试数据集中的细胞状态比例相似，我们在两个数据集上使用了我们的细胞型模型来预测相对的单元状频率，这些频率被用作我们时间预测模型的输入。为了说明参与者到参与者的异质性和免疫反应时间表的持续变化，我们首先构建了高斯过程潜在变量Model53，以平滑自训练数据集中病毒暴露以来的时间。我们在所有预测的细胞状态丰度中应用了该Model54的Pyro实现，并将模型限制在2，自接种以来，在平方根转换时间初始化的000迭代和一个潜在变量。这导致了自接种时平滑离群值以来的平均时间的准确概括。接下来，我们将每个预测的单元格状态用作任务输入来生成多任务高斯过程回归模型55，以预测自使用GPYTORCH56接种以来的平滑时间。我们使用了ADAM优化器，并允许迭代次数，以使边缘对数可能性损失达到零。接下来，我们预测了整个测试时间表（第1天到第28天）中的细胞状态组成，并将这些细胞状态组成与我们的查询数据集中的细胞状态组成，如我们的细胞型模型所预测的那样。最后，我们选择了与观察到的细胞态组成相比，预测的细胞态组合物的平均平方误差最低的时间点。

　　与其他T细胞群体相比，我们计算了激活的T细胞群体中SARS-COV-2特异性TCR的折叠变化富集。在10个随机绘制n = 5,000个唯一种群的克隆之后，中间折叠变化= 4.99，中值p = 0.00044。

　　从制造商的方案中从Tempus Blood RNA管（Thermo Fisher，4342792）中收集的全血样品（Thermo Fisher，4342792）中提取总RNA。使用单链DNA连接的管道对TCRα和β基因进行了测序，该管道将UMIS引入附着在单个cDNA分子上的管道。UMI可以校正测序误差PCR偏置，并提供了一种定量且可重复的曲目分析方法。使用Decombinator（v.4）59的实验性TCR测序库制备和随后的TCR注释（V，J和CDR3注释）的完整详细信息均已发布。Decombinator软件可在GitHub（https://github.com/innate2adaptive/decombinator）上免费获得。

　　在整个感染过程中，在不同时间点记录了抗原特异性TCR克隆的T细胞表型（幼稚，活化，效应子和记忆）。通过至少有两个样品观察到一次激活的标签，通过具有激活的标签来过滤TCR克隆，其中一个必须在第28天。当同一克隆以几个不同的单元格标签出现时，绘制了误差频段，而误差频段的大小会导致其相对比率。

　　为了量化不同表型簇中发现的TCR的多样性，我们确定了簇中两个不同的clonotypes共享相同的CDR3氨基酸序列60的概率。为了进行可视化，我们通过在完整数据上计算出的相同数量将这些概率归一化，而不论表型如何。这种一致性的概率比例非常严格地衡量了共享相同TCR的不同clonotypes的收敛功能选择。该分析基于由高变量区域的不同核苷酸序列定义的clonotypes，并且不会直接使用克隆丰度，因为这些链接也可以反映与TCR无关的谱系差异。我们仅将分析重点放在传统的T细胞上，仅考虑至少有一个有效的功能α链和β链的细胞，并且仅保留一个有多个链的单个细胞的单个链。在每种情况下，我们都分别对α链和β链以及配对的α和β链进行了分析，在每个实例中都需要与CDR3氨基酸序列进行完全匹配。

　　为了测试HLA-DQA2在接种前一天的细胞类型表达是否可以预测挑战实验的感染结果，我们使用“ GLM” R软件包进行了逻辑回归建模。对于所示的每种细胞类型，我们拟合了是否会发生持续感染，这是否会出现在–1时表达HLA-DQA2的细胞的平均表达和分数上。为了进行交叉验证，我们使用了“ ROC” R软件包，并进行了五个1：1测试训练拆分。

　　作为前瞻性医疗工作者研究Covidsortium的一部分，收集了用于评估MAIT细胞激活的样品。参与者筛选，研究设计，样本收集和样本处理先前已在详细信息中进行了描述。在任何时间点，都有具有PCR确认的SARS-COV-2感染（Roche Cobas诊断测试平台）的可用PBMC样品的参与者。连续招募的参与者的一部分，没有SARS-COV-2感染鼻咽拭子的证据，并且在整个随访中（每周PCR和血清学的16周）被Euroimmmun Antis1 Spike蛋白和Roche抗核蛋白质蛋白保持血清神经化。该研究得到了英国研究伦理委员会（中南部 - 牛津大学研究伦理委员会，参考文献20/SC/0149）的批准。所有参与者均提供了书面知情同意。

　　如先前所述进行多参数流式细胞仪，并且以前与MAIT细胞以外的其他免疫子集有关的数据先前发表了14。将PBMC铺在96孔圆底板中（每样品0.5-1×106），并在PBS（PBS； Thermo Fisher）中洗一次，然后用蓝色固定活/死染料（Thermo Fisher（Thermo Fisher）染色20分钟，在PBS中的4°C下进行20分钟。将细胞再次在PBS中洗涤，并与要在细胞表面染色的标记的饱和浓度的单克隆抗体孵育，在4°C下稀释在50％亮紫色缓冲液（BD Biosciences）和50％PBS中30分钟。表面抗体染色后，将细胞重悬于固定/pers缓冲液中（EBISOSCIENCES，FOXP3/转录因子染色缓冲剂试剂盒，固定在固定/稀释剂中稀释1：3的PERM浓缩液）在4°C下持续45-60分钟。然后将细胞在1×PERS缓冲液中洗涤（10×PERM缓冲液FOXP3/转录因子染色缓冲剂试剂盒在DDH2O中稀释至1×），并将核内靶标的饱和浓度（KI67）染色（KI67）在1×PERM缓冲液中染色30-45 min，4°C。使用LSR II流式细胞仪（BD Biosciences）在PBS中两次洗涤细胞，然后通过流式细胞仪分析细胞。使用FlowJo分析流式细胞仪数据（Mac，Tree Star的V.10.7.1）。用细胞或抗小鼠IgG珠（BD Biosciences）制备单污染对照。荧光减去对照（FMOS）用于门控（有关FMOS和与这些污渍相关的详细门控）。请注意，Mait细胞的频率在对照或PCR+之间没有差异，如先前报道的14。

　　如前所述62，使用4％（v/v）多聚甲醛在空气 - 液体界面生长的SARS-COV-2和模拟感染的人类鼻上皮培养物固定30分钟，用0.2％Triton-X（Sigma）透化15分钟15分钟，并用5％的山羊（Sigib）固定了5％的山羊（Sigib（Sigib）（SIGMA），以前（SIGMA）均为1小时塞满1小时。第二天在室温下进行1小时进行二级抗体孵育。然后，将培养物与Alexafluor 555鬼笔环肽和DAPI（Sigma）一起孵育15分钟，然后用延长的金反发试剂（Life Tech）安装。每次孵育步骤后，用PBS-T洗涤样品。使用LSM710 Zeiss共聚焦显微镜捕获图像，并使用Nikon NIS元素渲染。来自三个单个捐助者的人鼻上皮细胞培养物（一个孩子 <12 years old, one adult 30–50 years old and one adult >每个捐赠者（模拟和SARS-COV-2感染条件）染色了70岁）。感染后72小时拍摄的免疫荧光染色的代表性图像分别在扩展数据中看到来自老年人和儿童的鼻皮细胞培养物，分别在图5B和扩展数据中看到图9a。

　　培养的人类鼻皮细胞是SARS-COV-2感染或模拟感染的培养的人，用4％多聚甲醛在0.05 M Cacodylate缓冲液中固定2.5％戊二醛在pH 7.4处固定，并在4°C下至少将其放置在4°C下24 h，如前所述24 h，如前所述，如前所述。将样品在室温下在1％的四氧化水中孵育1小时，然后在未稀释的UA-Zero（Agar Scientifitific）在室温下染色30分钟。使用增加浓度的乙醇（50、70、90和100％）脱水，然后是氧化丙烷和丙烷氧化物和阿拉尔德岩树脂的混合物（1：1）。将样品嵌入araldite中，并在60°C下留48小时。使用Reichert Ultracut E超明核病获得了超薄切片，并在室温下使用雷诺铅柠檬酸盐染色10分钟。在配备高级显微镜技术（AMT）XR16电荷耦合设备摄像头的JEOL 1400Plus传输电子显微镜上拍摄图像，并使用软件AMT捕获引擎。来自三个单个捐助者的人鼻上皮细胞培养物（一个孩子 <12 years old, one adult 30–50 years old and one adult >感染后72小时（模拟和SARS-COV-2感染）的70岁）处理并成像。来自SAR-COV-2感染的鼻中皮细胞培养的代表性图像在（图2）中显示了来自老年人（> 70年）的鼻皮细胞培养物，并带有来自儿童的其他图像（<12 years), younger adult (30–50 years) and older adult (>70年）可以在扩展数据中看到图9b。

　　如前所述7，采集来自每个参与者的血清样品，并使用两个测定法测量了抗体滴定。简而言之，通过ELISA（使用Nexelis）确定SARS-COV-2抗尖峰IgG浓度，并报告为ELU ML-1（补充表1p）。通过在英国卫生安全局的微中性化测定法确定了用于实时SARS-COV-2病毒（维多利亚谱/01/2020谱系）的中和抗体滴度，并报告为50％中和抗体滴定（NT50）。LLOQ分别为58和50.2 ELU ML-1，用于小型内中性化蛋白质和小型蛋白质。对于每个感染组中位数（IQR），请参见补充表1g中的摘要研究元数据表。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。