这项研究中的所有动物实验均符合UCSF机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行，并在UCSF和Beth Israel Deaconess Medical Center批准。除非另有说明，否则所有小鼠均可自由获取食物和水，并在22°C的12 h – 12 h浅色周期下饲养，平均湿度为45％。使用CRISPR – CAS9技术应用的Stemcell生成了C57BL/6J背景中的Cul2Flox/ - 小鼠。C57BL/6J背景中的AppBP2Flox/ - 小鼠由CIRSPR – CAS9制成。通过将CUL2或APPBP2 Floxed小鼠与脂联素CRE MITE（B6; FVB-TG（FVB-TG（FVB-TG）（adipoq-cre）），开发了脂肪细胞特异性CUL2-KO（adipo-Cul2-KO小鼠）和AppBP2-KO小鼠（adipo-appbp2-ko小鼠）。Cyagen产生了携带S561N突变（相当于APPBP2基因中的人SNP）的AppBP2敲击小鼠。为了使小鼠AppBP2的人类S561N变体概括为ASN和Ser562的SER561通过将含有p.y551（TAT至TAC）的供体寡素（TAT）和p.A556（GCC）（GCC）（gcc of GCG）共同将Ser561变为ASN和Ser562。补充表1提供了用于基因分型和GRNA的引物序列的列表。

　　来自C57BL/6J小鼠腹股沟WAT，PRDM16FLOX/FLOX小鼠和AppBP2Flox/Flox小鼠的基质血管分数（SVF）通过先前所述的SV40大型T抗原表达，从而使SV40大T抗原表示永生。为了生成PRDM16-KO和APPBP2-KO细胞，将不朽的PRDM16Flox/Flox或AppBP2Flox/Flox Preadipocytes感染了表达CRE（34565，addgene），然后在200μg-ml-ml-ml-−-1-1剂量选择中选择。为了生成稳定表达CUL2的腹股沟前细胞的产生，用表达密码子优化的小鼠CUL2的逆转录病毒感染永生的前脂肪细胞，然后以10 µg ml-1的剂量选择Blasticidin。对于原代SVF细胞的AAV感染，在生长培养基中，用AAV-CRE（105537-AAV8，ADDGENE）或AAV-GFP（1055530-AAVEN）（105537-AAV8，ADDGENE）或AAV-CRE（105537-AAVEN）感染了从CUL2FLOX/FLOX或APPBP2FLOX/FLOX小鼠分离的细胞。改为新鲜生长培养基后，将细胞再培养60小时。Preadipocytes were seeded into coated plates, and differentiation was induced by culturing cells with DMEM medium containing 10% FBS (Atlanta Biologicals), 5 µg ml−1 insulin, 1 nM T3, 0.5 µM rosiglitazone, 0.5 mM isobutylmethylxanthine, 125 nM indomethacin and 2 µg ml−1 dexamethasone.48小时后，将细胞培养在含有10％FBS，5 µg ML -1胰岛素，1 nm T3和0.5μm的闪光灯的培养基中，再培养5-7天。HEK293T细胞，HEK293病毒包装细胞和C2C12细胞保持在含有10％FBS和1％青霉素 - 链霉菌素的DMEM高葡萄糖培养基中。

　　CUL1（19896），CUL2（19892），CUL3（19893），CUL4A（19951），CUL4B（19922），CUL5（19895）和CUL7（20695），从Addgene获得。我们的实验室开发了EHMT1，HA-UB，HA-PRDM16，FLAG-PRDM16，GST-PRDM16结构。使用来自质粒的标准PCR技术（用于人类AppBP2的MHS6278-202757182，MMM1013-202761267，用于鼠标AppBP2，Horizo​​n），然后插入哺乳动物的表达式中，使用质粒的标准PCR技术（MMM1013-202761267），然后使用质粒的标准PCR技术（MMM1013-202761267），然后将人类AppBP2 cDNA和鼠标APPBP2 cDNA构建体放大。通过genscript合成了反优化的小鼠CUL2 cDNA和密码子优化的人AppBP2 cDNA，并将其克隆到PMSCV-BlasticIdin载体中（75085，Addgene）。研究中使用的点突变是使用定位定向的诱变引入的，其中融合了HD克隆Plus（638909，Takara Bio）试剂盒。所有构建体通过测序确认。

　　The following reagents were used in this study: MG132 (474790, Sigma-Aldrich), MLN4924 (501146629, Thermo Fisher Scientific), anti-Flag(R) M2 affinity gel (A2220, Sigma-Aldrich), Pierce anti-HA magnetic beads (88836, Thermo Fisher Scientific), 3×Flag peptide（F4799，Sigma-Aldrich），3×HA肽（AS-63764，ANASPEC）。在这项研究中使用了以下抗体：抗UCP1（AB-10983，ABCAM），抗UCP1（U6382，Sigma-Aldrich），抗CUL2（SC-166506，SANTA CRUZ），抗脱生型CUL2（EPR3104（EPR3104（2））（EPR3104（2））（AB16669999999999999999999991999917，抗ABCAM），（NBP2-81781，NOVUS），抗flag-HRP（A8592，Sigma-Aldrich），Anti-Ha（SC-7392，Santa Cruz），抗Myc（SC-40，Santa Cruz），抗PPARγ（E-8）（E-8）（E-8）（E-8）抗泛素（SC-8017，Santa Cruz），抗GST（SC-138，Santa Cruz），抗GAPDH（SC-322233，SANTA CRUZ），抗β-肌动蛋白（A3854，Sigma-Aldrich），抗MUM1（SIGMA-ALDRICH），抗MUM1Proteintech), anti-EHD2 (11440-1-AP, Proteintech), anti-GTF2I (10499-1-AP, Proteintech), anti-HDAC1 (10197-1-AP, Proteintech), anti-CNOT1 (14276-1-AP, Proteintech), anti-CNOT9 (22503-1-AP, Proteintech), anti-CHD4（14173-1-AP，ProteIntech），抗PRDM3（C50E12）（2593S，电池信号技术），抗EHMT1（E6Q8B）（35005S，单元信号技术），Phophoplus akt（Ser473鼠标IgG（SC-2025，Santa Cruz），兔IgG，多克隆 - 异型对照（AB37415，ABCAM），山羊抗兔轻链二抗体（NBP2-75935，NOVUS），NOVUS），山羊抗MOUSE IGG，轻度抗体，轻链特异性抗体（91196），91196S，，类面，，指示灯，，91196，，抗元素（AF6295，R＆D系统），针对用重组人PRDM16免疫兔子产生的针对PRDM16的多克隆抗体（Genscript）。

　　以下慢病毒shRNA克隆购自Genecopoeia：炒对照（CSHCTR001-LVRH1H）；CUL2（MSH036079-LVRH1H）;KLHDC2（MSH034863-LVRH1H）;LRRC14（MSH038419-LVRH1H）。慢病毒shRNA构建体是通过克隆到plko.1-羟克莫霉素（24150，addgene）或plko.1-blasticidin（26655，addgene）而产生的。补充表1提供了研究中使用的序列的列表。

　　对于慢病毒的产生，使用磷酸钙方法，用10 µg慢病毒质粒和10 µg包装质粒（PSPAX2和PMD2.G）转染HEK293包装细胞。48小时后，收集培养上清液并使用0.45 µm滤波器过滤。将腹股沟WAT衍生的SVF细胞或HEK293T细胞与补充10 µg ML-1聚甲烯的病毒上清液一起孵育24小时。随后，通过选择指定的抗生素：湿霉素B（10687010，Thermo Fisher Scientific）的稳定细胞系，以200 µg mL -1的剂量为200 µg mL -1，尿霉素（A1113803，Gibco，Gibco）以1 µg mL -1或Blasticidin（A113903，Thermociencific）的1 µg ml -1或blasticiDin，g113903，Thermociencienciencienciencienciencin（a1113803，gibco）。

　　通过genscript合成了标记为标记的密码子优化的小鼠CUL2 cDNA和HA标签的密码子优化的人AppBP2 cDNA，并将其克隆到PMSCV-BlasticIdin载体（75085，Addgene）中。为了产生逆转录病毒，使用磷酸钙方法将HEK293包装细胞用质粒上方10 µg和10 µg包装质粒（VSV和GAG-POL）转染。48小时后，收集培养上清液并通过0.45 µm滤波器过滤。腹股沟WAT衍生的SVF或APPBP2-KO前脂肪细胞用逆转录病毒感染10 µg ML-1聚甲烯，持续24小时。随后，以10 µg mL -1的剂量通过blasticidin选择细胞。

　　如前所述进行蛋白质复合物纯化4,6。对于Cul2复合物纯化，用表达标记为Flag标记的CUL2或空载体的逆转录病毒感染了源自小鼠腹股沟WAT的永生前脂肪细胞。脂肪细胞生长为冲突后，并分化了4天。使用补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的裂解缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 7.4、150 mm NaCl，1％Triton X-100、1 mM EDTA）制备细胞提取物。将裂解液的上清液与抗FLAG M2亲和凝胶孵育2小时。将免疫分泌物洗涤3次，然后用3×FLAG肽（Sigma-Aldrich）洗脱。然后将洗手液TCA定位，在4–15％的丙烯酰胺梯度凝胶中分离，并通过银色染色或Coomassie Blue染色可视化。

　　对于AppBP2复杂表征，用表达HA标记的APPBP2或空载体的逆转录病毒感染了永生的AppBP2-KO前脂肪细胞。将脂肪细胞生长至相互作用后，并分化了4天，然后进行MG132治疗。将细胞匀浆以制备核提取物。将核提取物与Pierce抗HA磁珠（Thermo Fisher Scientific）孵育2小时，然后在结合缓冲液中洗涤（50 mM Tris-Cl pH 7.4，150 mm NaCl，0.5％Triton X-100）。通过3×ha肽（ANASPEC）洗脱了配合物，进行了TCA-PRECTITITIT，在4–15％的丙烯酰胺梯度凝胶中分离，随后通过银色染色或Coomassie Blue染色而可视化。

　　切除凝胶分辨的蛋白质，用胰蛋白酶消化，并使用逆相液相色谱分别分析，并使用高分辨率杂交质谱仪（LTQ-Orbitrap，Thermo Fisher Scientific）使用TOP10的TOP10方法使用Taplin Mostical speptrarvy spercrard offarctrarvys intavery seption top10方法，使用高分辨率杂种质谱仪（LTQ-Orbitrap，Thermo Fisher Sciention）使用高分辨率杂种质谱仪（LTQ-ORBITRAP，THERMO FISHER SCOSCION）进行单独分析。使用IPI鼠标数据库37搜索LC -MS/MS数据。用至少两个独特的有效肽鉴定出的蛋白质被认为是显着的，并且使用靶标的方法估计FDR为0％。38。

　　SF9细胞是从UC Berkeley细胞培养设施中获得的。将SF9细胞培养在SF-900 II SFM（10902088，Thermo Fisher Scientific）中，并补充了1％的青霉素 - 链霉素（Gibco），并保持在没有CO2的27°C下。杆状病毒包装和扩增是根据BAC-TO-BAC C-HIS TOPO表达系统（A11100，Thermo Fisher Scientific）的既定商业方案进行的。简而言之，将C末端的His标签APPBP2和FLAG-PRDM16 cDNA克隆到PfastBac Topo载体中，并转化为DH10BAC大肠杆菌竞争能力的细胞，形成重组表达bacmid。然后，使用Expifectamine SF转染试剂将BACMID转染到SF9细胞中，以生产重组杆状病毒颗粒（P0病毒）。高滴定杆状病毒通过感染更多的昆虫细胞的P0/P1病毒扩增。为了纯化，通过离心感染1 L培养基中的SF9昆虫细胞，并在-80°C下冷冻。将细胞孵育并与裂解缓冲液（50 mM Tris-CL pH 7.4、150 mM KCl，1 mM PMSF，10 mM咪唑和0.1％Triton X-100）均补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche），使用4°C搅拌1小时。随后，将细胞伸入50次，超声处理，然后以26,000 rpm离心1小时。将上清液与Ni-NTA浆液混合，并在4°C下结合1小时。将珠在洗涤缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 7.4、150 mm KCl，20 mm咪唑）中洗涤3次，持续15分钟，并在装有50 mm Tris-CL pH 7.4、150 mm KCl和250 mm咪唑的缓冲液中洗脱。洗脱的蛋白质被交换为存储缓冲液（50 mm Tris-Cl pH 7.4、100 mm KCl，1 mM DTT，PMSF，10％甘油），等分和闪光。

　　纯化了他的Flag – prdM16（400 nm），纯化了他的APPBP2（600 nm），CUL2（NEDDYBED）/RBX1（600 nm）或CUL1（NEDDYLATED）/RBX1（NM）/RBX1（600 nm），或CUL5（NEDDYLAID）/RBX2（NEDDYLAID）/RBX2（600 nm）（20 µm），UBE2D1或UBE2D3或UBE2R1（400 nm）在含有50 mM Tris -HCl，pH 7.4、5 mM MGCL2、2 mM ATP和1 mM DTT的反应缓冲液中混合。该反应在37°C的30μl体积中进行60分钟，然后通过SDS -PAGE解决。通过免疫印迹检测到泛素化产物。除非指定，否则所有蛋白质均从波士顿生物化学蛋白获得。

　　使用磷酸钙方法将HEK293T细胞用指定的质粒转染。42小时后，将20 µm Mg132直接添加到培养基中。孵育6小时后，收集细胞并用RIPA缓冲液（9806s，细胞信号技术）裂解，其中含有1％SD，并补充了无EDTA的蛋白酶抑制剂。将细胞裂解物短暂超声，在95°C煮沸10分钟，然后以12,000 rpm离心15分钟。然后将上清液用RIPA裂解缓冲液1：9稀释，以将SDS浓度降低到0.1％。将Pierce抗HA磁珠（88837，Thermo Fisher Scientific）与稀释的裂解物在4°C下孵育2小时。将免疫沉淀物用RIPA裂解缓冲液洗涤四次，并通过免疫印迹进行分析。

　　使用甲基-UB处理纯化的重组FLAG-PRDM16蛋白，以进行体外泛素化反应。泛素化的Flag -prDM16通过SDS -PAGE分开，凝胶用Coomassie Blue染色。切除蛋白质带，在1 mm DTT中在60°C下降低30分钟，然后在5 mM碘乙酰氨酰胺中进行烷基化。凝胶消化后，从5％甲酸/50％乙腈的凝胶中提取肽，并在速度VAC中完全干燥。在分析时，将样品重悬于2％/0.1％乙腈/甲酸溶液中。通过分析毛细管柱（100μM×25 cm）分离提取的肽，该毛细管柱，填充有2.6μm球形C18反向相硅珠（Accucore，Thermo Fisher Scientific）。ACCELA 600 HPLC泵用于产生以下HPLC梯度：60分钟内5–35％（a，水中的0.1％甲酸； b，乙腈中0.1％甲酸）。将洗脱的肽喷洒到配备纳米电动喷雾电离源的LTQ Orbitrap Velos Pro离子陷阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific）中。质谱仪以数据依赖性模式进行操作，其中一个MS扫描，然后在每个循环中进行20个碰撞引起的解离。使用以下搜索参数对PRDM16蛋白序列进行续集（Thermo Fisher Scientific）进行数据库搜索：前体离子的10 ppm质量公差；产品离子的1个质量公差。数据库搜索中包括对赖氨酸的114.0429质量单位的修改，以确定泛素修饰的肽。所有数据库都包含所有序列的相反版本，并且将数据过滤至1％或更低的肽FDR。手动检查匹配的泛素化肽的串联MS数据是否有效性。

　　如先前所述，进行了两步免疫沉淀和泛素化测定法。在第一轮免疫沉淀试验中，使用裂解缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 7.4、150 mM NaCl，1％Triton X-100和1 mM EDTA）制备细胞裂解液，并补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche），并与抗Flag M2 Affiniencation Cocktail（Roche）一起制备。使用相同的缓冲液广泛洗涤琼脂糖凝胶。在第二轮免疫沉淀测定中，琼脂糖上的结合蛋白通过在含1％SDS的裂解缓冲液中煮沸5分钟来变性。使用裂解缓冲液稀释溶液1:10。用抗FLAG M2亲和凝胶重新免疫了稀释的洗脱液。洗涤四次后，通过SDS -PAGE分离结合的蛋白质并使用免疫印迹分析。

　　我们的研究40中使用了已发表的协议。简而言之，用指示的质粒转染的分化脂肪细胞或HEK293T细胞分别以20 µg mL -1和10 µg mL -1的终浓度分别用环己酰亚胺处理。在指定的时间点收集细胞。通过免疫印迹的PRDM16分析细胞裂解物。PRDM16特异性蛋白表达的强度通过图像J软件进行了量化，并标准化为β-肌动蛋白信号的强度。对于统计分析，根据n = 3个生物学独立的样本进行了两尾未配对的学生的t检验。

　　各种形式的GST标记的PRDM16蛋白在大肠杆菌中表达，并如前所述纯化4。将GST – PRDM16蛋白片段与预校准的谷胱甘肽 - 塞肾珠（GE Healthcare）一起孵育2小时，然后进行大量洗涤。预装的GST树脂在4°C下与MYC标记的APPBP2蛋白一起孵育2小时。将沉淀物洗涤四次，并通过SDS -PAGE分离，然后使用免疫印迹进行分析。

　　使用24孔板或96孔板中的Seahorse XFE细胞外通量分析仪（Agilent）测量OCR。将分化的腹股沟衍生的脂肪细胞接种并分化4或5天。为了测量去甲肾上腺素诱导的呼吸，用1 µM去甲肾上腺素刺激分化的脂肪细胞。为了测量24孔板中未偶联的呼吸，用5 µM寡霉素处理细胞，然后用苯基氢氮酮（5 µM）和抗霉素（5 µM）处理。为了测量96孔板中未偶联的呼吸，用1 µM寡霉素处理细胞，然后用苯基氢氮酮（3 µM）和抗霉素（0.5 µM）处理。为了测量去甲肾上腺素诱导的组织OCR，将脂肪组织（蝙蝠为0.5 mg，腹股沟1.5 mg，附子wat的2.5 mg）置于XF24胰岛捕获微层中，并用10 µM去甲肾上腺素刺激。

　　为了用稳定的CUL2敲低或争夺控制对腹股沟细胞进行RNA-Seq分析，使用RNeasy Micro Kit（Qiagen）分离总RNA。使用UCLA技术基因组学技术中心的HISEQ 3000仪器（Illumina）进行高通量测序。使用Bowtie2 v.2.1.0映射读取到最新的UCSC转录本，并使用RSEM（V.1.2.15）41估算基因表达水平。M值的修剪平均值（来自EDGER）用于使基因表达归一化。使用富集42进行了基因本体分析。RNA-Seq和图书馆的建设是由UCLA基因组核心的技术人员进行的，他们对实验组视而不见。为了对PRDM16-KO小鼠衍生的腹股沟脂肪细胞进行RNA-seq分析，使用Zymo Direct-Zol RNA制备试剂盒（R2052，Zymo）分离了总RNA。将提取的RNA（400 ng）用NEBNEXT RRNA耗竭试剂盒（E7400X）处理以耗尽核糖体RNA，然后使用NEBNEXT mRNA第二链合成模块（E6111L）转换为双链cDNA。使用Qubit和Bioanalyzer分析cDNA，然后使用Nextera XT XT DNA文库制备试剂盒（Illumina FC-131）对12个循环进行分析。通过Qubit和Agilent Bioanalyzer分析生成的库，最终浓度为1.35 pm，并在NextSeq 500系统上进行了测序。使用BCL2FASTQ（v.2.20.0）对适配器进行了分类和修剪测序读数。使用FASTP（V.0.20.1）进行次级适配器修剪，NextSeq/poly（g）尾部修剪和读取过滤；从读取池中除去修剪后的24个核苷酸的低质量读取和读取。鲑鱼（v.1.4.0）43用于同时映射并量化读取为GRCM38/MM10小鼠组装的Gencode M24基因组注释中的转录本。鲑鱼是使用完全选择性对准的，序列特异性和碎片GC偏置校正已打开 （分别 - 塞克比亚和 - gcbias选项）。使用TXimport软件包对R44进行了整理，并将其总结为基因丰度。使用EDGER进行了归一化和差异表达分析。对于差异基因表达分析，如果基因通过FDR缩短的FDR≤0.05，则认为它们是显着的。RNA-seq转录组的热图是使用化合生剂（v.5.0）45生成的。

　　使用Thermo Fisher Scientific Pierce磁芯片套件（26157，Thermo Fisher Scientific）根据既定的商业协议进行芯片测定。简而言之，通过在室温下轻轻旋转并用1×甘氨酸淬灭5分钟，将分化的AppBP2-KO脂肪细胞和对照脂肪细胞固定在1％甲醛中10分钟。将样品用冰冷的PBS补充两次用停止的鸡尾酒洗涤，收集，然后放入含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的膜提取缓冲液中。在9,000克离心3分钟后，取出上清液。将细胞核用MNase消化缓冲液在37°C的MNase消化缓冲溶液中消化15分钟，然后进行超声处理以打破冰上的核膜。将消化的染色质以9,000克离心5分钟，并在旋转平台上在4°C下添加抗体以在4°C下孵育。在4°C下添加芯片级蛋白A/G磁珠。将样品用带有套件的IP洗涤缓冲液洗涤。用剧烈摇动在65°C下用1×IP洗脱缓冲液洗脱样品30分钟。随后将样品用蛋白酶K处理，然后进行柱纯化以恢复DNA。目标富集计算为输入百分比。PRDM16的靶基因座是根据先前的研究选择了Brown脂肪细胞46中PRDM16的芯片序列的。补充表1中提供了引物序列的列表。

　　APPBP2遗传变异的代谢特征（RS34146848）是从Finnmetseq外显子组序列Data33获得的。该分析还可以在2型糖尿病知识门户（https://t2d.hugeamp.org/）和Pheweb（http://pheweb.sph.umich.edu/finemich.edu/finmetseq/variant/17:58525018-C-T）中找到。APPBP2遗传变异（RS34146848）的人口频率可以在GNOMAD浏览器（https://gnomad.broadinstitute.org/variant/17-58525018-c-t-c------------------------------------------- t = gnomad_r2_134中找到SNP中的9.dataset and SNP的频率更高（17）与其他种族相比，41,342个等位基因，频率为41.4％）。因此，我们独立地测试了AppBP2基因座位的遗传变异与肥胖（对BMI调整的体重指数，腰围和腰围比）的测量方法（体重指数，腰围和腰部比率）在UK BioBank35中使用螺栓固定模型GWAS模型GWAS模型GWAS中的非洲血统（n = 7,447）中的非洲血统（n = 7,447）。对年龄，年龄平方，性别，基因分型阵列和遗传主成分进行调整，然后进行反向正常转化。

　　雄性adipo-cul2-ko，adipo-appbp2-ko和6周大的C57BL/6J背景中的各自的同窝对照小鼠在22°C下以HFD（60％脂肪，D12492，研究饮食）为6周。每周都要测量体重。使用人体成分分析仪Echomri（Echo Medical Systems）系统在HFD上测量小鼠的脂肪质量和瘦小质量。对于葡萄糖耐受性测试，在HFD上进行3周或9周的小鼠，从09:00到15:00禁食6小时（1.5 g kg-kg-1体重）。对于胰岛素耐受性测试，将HFD上的小鼠从09:00到12:00禁食3小时，用胰岛素（1 U kg-1体重）注入腹膜内。对于丙酮酸耐受性测试，将HFD上的小鼠用丙酮酸（1 g kg-1的身体重量）腹膜内注射11周，并禁食16小时。在注射前后的指示时间点收集血液样本，并使用血糖测试条（Freestyle Lite）测量葡萄糖水平。

　　在HFD 3周后，使用综合实验室动物监测系统（CLAM，CLAM，CLAM，CLAM，CLAMS，哥伦布仪器）监测全身能量消耗（VO2，VCO2），脂肪CUL2-KO小鼠和同窝控制小鼠的全身能量消耗，食物摄入量和运动活性（光束断裂计数）。为了分析脂肪APPBP2-KO小鼠，使用Promethion代谢笼系统（Sable Systems）在30°C下测量全身代谢率。adipo-appbp2-ko及其同窝控制小鼠在转移到代谢笼之前，将其适应至30°C 3天。在测量能量消耗期间，小鼠接受了单次腹膜内注射Cl-316,243（Sigma-Aldrich；每公斤体重0.1 mg）。通过CAIR-Ancova（https://calrapp.org/）分析了获得的间接热量法数据，这是一种基于回归的能量消耗分析。

　　脂肪酸氧化测定是根据我们以前的工作48所述的方案进行的。简而言之，在暴露于8°C的HFD上，从脂肪CUL2-KO中分离出蝙蝠，腹股沟WAT和胃肌组织，并在暴露于8°C或脂肪appbp2-ko之后从脂肪-CUL2-KO中分离出。将组织切成小块，将其放入聚丙烯圆底管中，然后在37°C的1 ml Krb-Hepes缓冲液中孵育，该缓冲液在60 rpm的37°C下含有0.5μCIML-1 [1-14C]油酸。在将350μl30％过氧化氢加入反应混合物中后，将[14C] CO2捕获在中心井中，在室温下添加了300μL氢氧化苯甲烷溶液20分钟。使用液体闪烁计数器测量14C放射性，并标准化为组织质量。

　　为了测量肝脏甘油三酸酯含量，收集脂肪 - CUL2-KO或脂肪APPBP2-KO小鼠的肝组织在350 mL乙醇KOH（100％乙醇和30％KOH的比例为2：1）中均匀，并在55°C下孵育过夜。随后，将组织裂解液补充为50％乙醇至1 mL的最终体积。离心后，将上清液与1 M MGCL2混合，并在冰上孵育10分钟。使用Infinity甘油三酸酯试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测量甘油三酸酯的量。BIDMC的Longwood小动物成像设施进行了血清胆固醇和血清甘油三酸酯的测量。

　　在HFD 4周时，将脂肪APPBP2-KO小鼠及其同立物材料对照禁食4小时，然后在1.3 U kg-1体重下腹膜内注射胰岛素。注射后10分钟去除肝脏，epiwat和腹股沟水，并在RIPA裂解缓冲液中裂解，并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。通过SDS -PAGE分离裂解物，并使用免疫印迹分析。Phophoplus Akt（Ser473）抗体二重奏用于蛋白质印迹分析。

　　将脂肪 - cul2-ko小鼠，adipo-appbp2-ko小鼠及其各自的同窝立液对照小鼠保留在常规的食物饮食中。将小鼠适应30°C 11天，然后暴露于8°C 6小时。使用TH-5温度计（PhysItemp）每1小时监测小鼠的直肠温度。

　　脂肪组织和肝脏在4％的4％多聚甲醛中固定在4°C中，然后在70％乙醇中脱水。脱水过程后，将组织嵌入石蜡中，并以5μm的厚度切成切片。根据BIDMC病理核心的标准方案，对这些切片进行了用于血久毒素和曙红染色的切片。使用旋转显微镜（Echo Laboratories）获取图像。

　　根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen）从细胞中制备总RNA。使用Trizol试剂以及Rneasy Mini Kit（Qiagen）获得从组织中提取的总RNA。根据提供的方案，使用iscript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad Laboratories）对RNA样品进行反转录。使用ABI VIIA 7 PCR或QS6 Cycler（Applied Biosystems）通过QPCR（Applied Biosystems）进行了基因转录本的定量。36B4或TBP用作内部控制。补充表1提供了用于扩增靶基因的PCR引物的列表。

　　根据制造商的说明，将总DNA从成熟的脂肪细胞（MB6918，Sciencell）中分离出来。使用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific）测量DNA浓度，并用双二驱动的H2O稀释至20 ng ml-1的终浓度。使用针对线粒体COX1，COX2，COX3，ATP6和ATP8基因的引物扩增mtDNA拷贝数，并通过扩增β-珠蛋白基因来归一化为基因组DNA。补充表1中提供了引物序列的列表。

　　将细胞用PBS洗涤一次，固定在4％多聚甲醛中15分钟，然后在环境温度下用油红色O溶液染色10-20分钟。随后，用PBS将细胞洗涤3次，然后用旋转显微镜（Echo Laboratories）成像。

　　在12孔板上培养了永生的腹股沟前叶脂细胞5天。Cells were fixed for 2 h at room temperature with fixative solution (2.5% glutaraldehyde, 1.25% paraformaldehyde, 0.03% picric acid in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.4), washed in 0.1 M cacodylate buffer and post-fixed with 1% osmiumtetroxide (OsO4)/1.5% potassium ferrocyanide（KFECN6）持续1小时。在水中两次洗涤样品，一次1×maleate缓冲液（MB）一次，并在1％的MB中孵育1％，然后在水中洗涤两次，然后在水中洗涤两次，随后在酒精等级中进行脱水（以50％，70％和90％的含量为单位，为10分钟，在10分钟内为100％）。脱水后，将丙烯氧化物添加到盘中，并使用转移移液器将细胞抬起，并在1：1的丙烯氧化物和Taab Epon（Taab Laboratories设备; https://ttps://taab.co.uk）中进行沉淀和浸入过夜。然后将样品嵌入Taab Epon中，并在60°C聚合48小时。在Reichert Ultracut-S显微镜上切割超薄截面（约60 nm），将其捡到用柠檬酸铅染色的铜网格上，并在Jeol 1200EX透射电子显微镜或Tecnaig2 Spirit Biotwin系统上检查，并用AMT 2K CCD摄像头记录图像。

　　所有生物学实验至少重复两次并再现。一次进行RNA-seq，但分析了三个独立的样本，并使用替代方法（例如RT – QPCR）进一步验证。蛋白质印迹数据通过两个或三个独立的样本证实。从生物学独立的样品中收集了介绍的数据。使用GraphPad Prism v.7.0（GraphPad）进行统计分析。所有数据均表示为平均值±S.E.M.除非另有说明。未配对的学生的T检验用于两组比较。单向方差分析，然后进行邓内特测试进行多组比较。双向方差分析用于多组的海马测量。进行双向重复测量方差分析，然后对Fisher的LSD检验进行了测试，以确定体重增长，全身能量消耗结果，葡萄糖耐受性测试，胰岛素耐受性测试和基因型之间的丙酮酸耐受性测试的统计差异。图传说中指定了每个实验所使用的统计参数和鼠标数。没有使用统计方法来预先确定样本量。P <0.05在整个研究中被认为很重要。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。