从龙卷风系统（Addgene质粒＃124362）15中采用了编码U6+27启动子（U6+27-Pre-racrna）下游的圆形RNA的序列，并由Genscript合成。具体而言，pre-racRNA设计为包含独特的25-核苷酸（NT）条形码区域和共享的25-NT共同序列，以启用Starmap Plus检测（扩展数据图1C，D）。将U6+27-Pre-Racrna序列插入MLUI和XBAI位点之间的Vector Paav-Hsyn-Mcherry（Addgene质粒＃114472）中，从而导致质粒Paav-U6-Racrna（Addgene质粒＃200824 to＃200827）。B.E.D的实验室提供了AAV包装质粒（KICAP-AAV-PHP.EB和PHELPER）。

　　如所述，产生并纯化了表达圆形RNA条形码的AAV-PHP.EB。简而言之，使用聚甲基胺（PolySciences，23966-1）以1：4：4：4：4的比率，将PAAV-U6-RACRNA和AAV包装质粒（KICAP-AAV-PHP.EB和PHELPER）共转染到HEK 293T细胞（ATCC CRL-3216）中，以1：4：2的比率与1：4：2的比率。转染后72小时，从培养基和细胞中收集病毒颗粒。将细胞和培养基的混合物离心以形成细胞颗粒。将细胞颗粒悬浮在500 mM NaCl，40 mM Tris，10 mM MGCL2，pH〜10和100 U ML-1的盐激活核酸酶（SAN，25UμL-1，Arcticzymes，70910-202）下，在37°C下1 h。将来自上清液中的病毒颗粒与40％聚乙烯乙二醇（Sigma，89510-1kg-f）沉淀，溶解在500 mL 2.5 m NaCl溶液中，并与细胞颗粒结合在37°C下再孵育30分钟30分钟。之后，将细胞裂解液以2,000克离心，并将上清液加载到碘二酚（Optiprep，Cosmo Bio USA，AXS-1114542）阶梯梯度（15％，25％，40％和60％）上。从40/60％的界面和40％碘醇梯度层中提取病毒。然后，使用Amicon过滤器（EMD，UFC910024）过滤病毒，并在无菌Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich，D8537）中配制。使用定量PCR确定病毒滴度，以测量DNase I（Roche Diagnostics，4716728001）治疗后的病毒基因组数（VG）的数量，以去除未包装的DNA，然后去除蛋白酶K（Roche Diagnostics，03115828001）治疗，以进行病毒capsid和Expose expos expose and Expose and expos and expos and expos。PAAV-U6-RACRNA的定量线性化质粒用作DNA标准，以将CT值转化为病毒基因组的量。冠状样品的AAV-PHP.EB.1（条形码集1）的病毒滴度：2×1013 VG ML-1；矢状样品的AAV-PHP.EB.2（条形码集2）：1.7×1013 VG ML-1。

　　在这项研究中使用了以下小鼠：C57BL/6（Charles River Laboratories，应变法：475，女性，8-10周龄）和B6.CG-TG（THY1-YFP）HJRS/J（Jackson Laboratory，003782，003782，003782，男性，5周）。小鼠在每个笼子中饲养2-5个，并保持12小时的光线周期，并随意食物和水在65-75°F（约18–23°C）的温度下，湿度为40–60％。对于病毒注射，用异氟烷（3-5％的诱导，维持1-2％的1-2％）麻醉小鼠。我们在注射后至少四个星期对小鼠中枢神经系统组织进行了采样，当证明病毒反应返回对照水平以最大程度地减少AAV感染对细胞键入44的副作用。实验程序得到了麻省理工学院和哈佛大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，该委员会根据动物规程编号。0255-08-19。补充表3中包括有关小鼠和组织样品切片的详细信息。

　　通过注射到成年小鼠的恢复轨道窦（C57BL/6，女性，8-10周龄），在2×1012 Vg时进行静脉注射AAV-PHP.EB.1。第一次注射后一周，进行了第二次注射以增强表达。第一次注射30天后，用异氟烷麻醉小鼠（扩展数据图10a）。快速斩首后收集脑组织。使用液压挤出来分离脊髓，以减少处理时间和损坏组织51。简而言之，修剪了200μl非过滤器移液器尖端的大端，并牢固地贴在5毫升注射器上。接下来，将脊柱穿过骨盆骨的两侧切开，穿过尾audaudal轴，在近端和远端最远端伸直和修剪，直到可见脊髓。在脊柱的远端插入了一个5 ml注射器（Gibco，10010049），并施加稳定的压力，将脊髓挤压到100毫米的Petri盘中，填充在冰上的无菌PBS。收集脊髓组织的腰部片段。将组织放在OCT中（Fisher，23-730-571），在液氮中冷冻，并在-20°C下使用低温恒温器（Leica CM1950）切成20μm的切片。

　　通过注射成人Thy1-Eyfp小鼠（B6.CG-TG（THY1-YFP）HJRS/J，男性，男性，静脉注射为1.7×1012 Vg的AAV-PHP.EB.2在1.7×1012 Vg时进行静脉内给药。表达五周后，用异氟烷麻醉小鼠，并用50 ml冰冷的DPB在心心灌注（Sigma-Aldrich，d8537）（扩展数据图10a）。然后除去脑组织，将OCT放入OCT，将其冷冻在液氮中，并在-20°C下使用低温恒温器（Leica CM1950）切成20μm的矢状切片。

　　细胞类型标记基因和大多数差异表达的基因是从SCRNA-SEQ的研究中提取的，该研究系统地调查了成年小鼠CNS，其中包括从前脑到后脑的多个大脑区域，并以最小选择为1,2。该列表进一步补充了艾伦小鼠脑转录组数据库标记13。该列表策划为1,022个基因，由5位标识符唯一编码（扩展数据图1A和补充表1）。

　　如先前所述，设计了1,022个基因的Starmap Plus探针，并进行了修改，以进一步提高目标转录检测的特异性3,4。Padlock探针的主干包含一个5-NT基因特异性标识符和一个通用区域，其中阅读探针对齐（扩展数据图1B）。此外，将第二个3-NT条形码引入了一对引物和挂锁探针之间的DNA – DNA杂交区域，以减少由分子间接近性引起的假阳性引起的可能性，其中转录标记的引物a导致p循环的循环和跨度的第6个探针。用Alexa 488、546、594和647（补充表2）标记的两个基本编码荧光探针（2base_F1至2base_F16）。

　　为了检测RNA条形码，设计了底漆以杂交到共同的25-NT区域，而挂锁探针池的设计池则是杂交到可变的25-NT条形码区域，将条形码转换为条形码唯一的标识符（扩展数据图1D）。该标识符是通过正交阅读探针（用于冠状样品的R7和矢状样品的R7）和四个用Alexa 488、546、594和647（补充表2）标记的荧光探测器（1base_F1至1base_F4）在一轮SEDAL中测序的。

　　本研究中使用的公开数据：艾伦小鼠大脑参考ATLAS18,19,20（ISH23，CCFV3（参考文献20））；成年小鼠神经系统的SCRNA-SEQ数据集（可在登录srp135960）下可用序列读取存档（https://wwwww.ncbi.nlm.nih.gov/sra），小脑srp135960），cerebellum25，可在Gene expression omnibus（GEO）访问中获得GESE NUMBER GEESE16533371，Striat gese1653371，Striave nubme omnibus（GEO），可用于GSE118020），以及全皮层和海马26（在Nemo档案中，脑部启动档案细胞普查网络：https：//assets.nemarchive.org/dat-jb2f34y）;并处理了皮质细胞类型中的AAV-PHP.EB转导率（可在Caltechdata上获得：https：//doi.org/10.22002/d1.2090，aavomics_cell_type_type_transduction_rates.csv）44。

　　数据分析中使用了以下软件包和软件50,52,53,54,55,56,57,59,59,60,61,62：基于Matlab R2019B和Python 3.6实施了clusterMap。The following packages and software were used in data analysis: UCSF ChimeraX 1.0, ImageJ 1.51, MATLAB R2019b, R 4.0.4, RStudio 1.4.1106, Jupyter Notebook 6.0.3, Anaconda 2-2-.02, h5py 3.1.0, hdbscan 0.8.36, hdf5 1.10.4, matplotlib 3.1.3, seaborn0.11.0，Scanpy 1.6.0，Numpy 1.19.4，Scipy 1.6.3，Pandas 1.2.3，Scikit-Learn 0.22，Umap-Learn0.4.3，PIP 21.0.1，Numba 0.51.2，Tifffile 2020.10.10.10.10.11，Scikit-Imim Imim Imim image-image-Image 0.18.18.1，Squid 1.1.1，Squid 1.1.1，Annnd and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and and。8.0.0。

　　如先前所述的3,4进行了较小的修改。

　　玻璃底6或12孔板（Mattek，P06G-1.5-20-F和P12G-1.5-14-F）用甲基丙烯氧基丙酰甲氧西里烷（Bind-Silane，GE Healthane，17-1330-01）处理，然后是Poly-Lysine溶液（Sigma A-003-E）。No. 2微型盖玻璃（12毫米或18毫米，电子显微镜科学，72226-01或72256-03）按照制造商的说明，用凝胶滑溶液（Lonza，50640）预处理。分别将20μm的冠状切片安装在预处理的玻璃底12孔和6孔板中。用4％PFA（电子显微镜科学，15710-S）在室温下在室温下固定组织切片，持续10分钟，在-80°C下用预寒式甲醇（Sigma-Aldrich，34860-1L-R）在-80°C下渗透30分钟，并用PbStr/glycine/ytrnna（pbs）（pbs）（pbs）（pbs）（pbs）（pbs）（pbs）（pbs）。100216-360），0.1 U µL-1 Superase-IN（Invitrogen，AM2696），100 mM甘氨酸（VWR，M103-1KG），0.1 mg ML-1酵母源（Invitrogen，AM7119）在室温下15分钟，介绍前15分钟。对于矢状切片，将甲醇处理的步骤跳过，并用1％Triton X-100（Sigma-Aldrich，93443）在具有0.1 U µL-1 Superasein，100 mM甘氨酸，100 mM甘氨酸和1％酵母TRNA的PBS中用1％Triton X-100（Sigma-Aldrich，93443）透化15分钟。

　　下面列出的反应量为12孔板井。对于6孔板孔，反应体积加倍。在IDTE pH 7.5缓冲液（IDT，11-01-02-02）中，将蜗牛探针溶解至50 nm或每个探针100 nm。每次探针的最终浓度如下：小鼠1,022基因，5 nm的蜗牛探针；RNA条形码的引物，100 nm；RNA条形码的挂锁探针，冠状样品的10 nm，矢状样品100 nm。将脑切片在300 µL杂交缓冲液（2×SSC（Sigma-Aldrich，s6639），10％甲酰胺（Calbiochem，344206），1％Triton X-100，20 mm核糖核苷盐酸盐复合物（New England Biolabs，s1402s），0.1402 ug MONN，S6639），1％Triton X-100，20 mMMM MMMM MM，µL -1超碱性蛋白，蜗牛探针在40°C下24–36 h，轻轻摇动。

　　然后将样品在37°C下用600 µL PBSTR（PBS，0.1％Tween-20，0.1 U µL-1 Superasein）洗涤20分钟，然后在37°C下用600 µL高盐缓冲液（PBSTR，4×SSC）在37°C下进行一次洗涤20分钟。在室温下与PBSTR进行短暂冲洗后，然后将样品与300 µL T4 DNA连接酶混合物（0.1 U µl-1 T4 DNA连接酶（Thermo Scientific，EL0011），1×T4连接酶，0.2 mg ml-1 bsa（0.2 mg ml-1 bsa）（New Inndland Biolland Biolland Biolland Biolland，b9200.200011）0.2 u 00 µl T4 DNA连接酶混合物（0.1 U µl-1 T4 DNA）（1×T4）b9 0.2 000.2000.2000.2000.2000.2000.200.2。在室温下轻轻摇动，然后用600 µL PBSTR洗涤2次。然后将样品与300 µL滚动扩增混合物（0.2 U µl-1 PHI29 DNA聚合酶（Thermo Scientific，EP0094），1×PHI29反应缓冲液，250 µm DNTP混合物（New England Biolabs，New England Biolabs，NE0447S），0.2 Un0447s，0.2 U反应缓冲液，0.2 us。20 µm 5-（3-氨基利亚）-DUTP（Invitrogen，AM8439）在4°C下30分钟平衡，然后在30°C下2小时进行扩增。

　　接下来将样品在600 µL PBST（PBS，0.1％Tween-20）中洗涤两次，并在100 mM NaHCO3（pH 8.0）中用400 µL 20 mm丙烯酸NHS酯（Sigma-Aldrich，730300）处理400 µl 20 mm的丙烯酸NHS酯（Sigma-Aldrich，730300）。将样品用600 µL PBST短暂洗涤一次，然后与400 µL单体缓冲液（4％丙烯酰胺（Bio-Rad，161-0140），0.2％Bis-Acrylamide（Bio-Rad，161-0142），2×SSC）孵育30分钟，在室温下30分钟。除去缓冲液，并取出25 µL聚合混合物（0.2％过硫酸铵（Sigma-Aldrich，A3678），0.2％四甲基甲基二胺（Sigma-Aldrich，T9281，T9281）在单体缓冲液中被覆盖在凝胶中，并在凝胶中覆盖1个均匀覆盖的样品，并将其覆盖在凝胶中。氮气气氛。然后将样品用600 µL PBST洗涤两次，持续5分钟。Except for sagittal brain slices, the tissue-gel hybrids were digested with Proteinase K (Invitrogen, 25530049, 0.2 mg ml−1 in 50 mM Tris-HCl 8.0, 100 mM NaCl, 1% SDS (Calbiochem, 7991)) at room temperature overnight, then washed with 600 µl 1 mM AEBSF (Sigma-Aldrich,101500）在室温下一次在PBST中持续5分钟，另外两个用PBST洗涤。样品在4°C下存储在PBST中，直到成像和测序。

　　在SEDAL之前，将样品用剥离缓冲液（60％甲酰胺和0.1％Triton X-100在水中洗涤），并用去磷酸化混合物（0.25 U µL-1南极磷酸酶（New England Biolabs，New England Biolabs，M0289L），M0289L），M0289L），1×AT 0.2 ML-GML-GML-1 BSA AT AT 37 BSA AT。每个SEDAL的周期始于两个洗涤液，带有剥离缓冲液（每个10分钟），三个用PBST洗涤（每个5分钟）。对于1,022-gene Sedal的六轮，将样品与“测序通过连接”混合物（0.2 U µl-1 T4 DNA连接酶，1×T4 DNA连接酶，0.2 mg ML-1 BSA，0.2 mg ml-1 bsa，10 µm读取探针，每个读取量和300 nm的300 nm和300 nm的探针供以16个两个级别的温度，300级供应量。对于RNA条形码SEDAL的圆形，将样品与（0.1 U µl-1 T4 DNA连接酶，1×T4 DNA连接酶缓冲液，0.2 mg ML-1 BSA，5 µm读取探针，100 nm的100 nm孵育，在室温下，在4个一个碱基荧光寡聚中的每一个）。用洗涤和成像缓冲液（10％甲酰胺，2×SSC，水中的2×SSC，每个10分钟）和DAPI染色（Invitrogen，D1306，100 ng ml -1）洗涤三次后，将样品成像在洗涤和成像缓冲液中。

　　使用LEICA TCS SP8或Stellaris 8共聚焦显微镜使用LAS X软件（版本3.5.5.19976; Stellaris 8：405 nm二极管，白光激光器，白光激光器和40×油浸目标（NA 1.3）的405 nm二极管（NAM nm nm nm nm nm nm nm nm）×194 nm×194 nm×194 nm×。DAPI是在1,022-Gene Sedal和RNA条形码SEDAL的第一轮中成像的（扩展数据图2A）。

　　使用经典的最大似然估计方法，使用Huygens Essential版本21.04（科学体积成像）实现了图像反卷积，信号比为10和10迭代。根据先前的报道3,4应用图像注册，点调用和条形码过滤。

　　我们将clustermap12方法应用于通过扩增子（mRNA斑点）分割细胞（mRNA斑点），并以质量控制基因斑点以及预处理和后处理。首先，使用背景标识过程来过滤输入点。具体而言，将10％的局部低密度mRNA斑点视为背景噪声，并在下游分析之前被删除。其次，在mRNA点簇作为后处理后，使用了额外的噪声排斥步骤。具体而言，我们删除了不与DAPI信号重叠的细胞。这些mRNA点的质量控制步骤已包括在所有20个冠状和矢状数据集的分析中。

　　首先，我们在Scanpy63中排除了具有标准预处理程序的低质量细胞。在这里，我们将20个冠状和矢状数据集组合在一起。我们将每个细胞的最小基因数和每个基因的最小细胞数设置为20，每个细胞的最小读取计数为30，每个细胞的最大读数计数为1,300。过滤后，我们通过1,022个基因获得了1,099,408个细胞的数据矩阵。然后将基质在每个单元格上归一化，然后对数转换。每个单元格的总读数的效果被回归，并最终将数据缩放到单位方差。

　　为了评估批处理效应，我们将相邻的组织切片分为批处理。我们检查了标记为批处理样品A – J的批处理效应（补充表3）。我们首先使用战斗64观察并纠正了C和D组冠状样品之间的批处理效应。我们还观察并纠正了冠状和矢状样品之间的批处理效应。功能scanpy.pp.combat用于批处理效应校正。

　　我们首先使用Harmony16集成了鼠标神经系统的Starmap加数据集和SCRNA-SEQ数据集。我们在Starmap Plus和SCRNA-Seq数据集之间使用了重叠的1,021个基因来计算调整后的主要组件，并执行关节聚类以将SCRNA-SEQ DATASET1中的主级细胞类型标签传递到SCRNA-SEQ DATASET1中的主要细胞型标签，以使其成为陷阱。函数scanpy.external.pp.harmony_integrate用于执行集成。使用等于1的分辨率来执行关节聚类，将功能scanpy.tl.leiden使用。

　　基于Starmap Plus数据集与公共SCRNA-SEQ DATASET1的集成，确定了Starmap Plus已确定的单元格的主级聚类和注释。

　　首先，如上所述，我们将Starmap Plus细胞与SCRNA-Seq数据集中的细胞集成在一起。其次，我们在所有集成细胞上进行了关节聚类，恢复了53个关节簇。第三，我们以如下的原理传输了SCRNA-Seq数据集中的细胞标签。在每个关节群中，我们检查了SCRNA-Seq细胞的细胞类型标签。如果一个关节集群中的TOP-1 SCRNA-SCRNA-seq细胞类型标签的数量超过80％，则表明在此细胞类型上成功整合了多源单细胞数据集。因此，我们将这种主要的TOPN-1 SCRNA-SCRNA-SEQ细胞类型标签分配给了该关节簇中的病变和细胞。否则，我们认为整合不成功，并将关节群集标记为“ NA”。我们使用等级1在SCRNA-SEQ数据集中使用等级1来注释Starmap Plus细胞在四个级别上进行了该原理。较高的等级意味着更详细的注释。具体而言，我们在等级1水平下注释细胞分为4种细胞类型。等级2级别的5个单元类型，等级3级别的13个单元格类型，等级4级别的22个单元格类型。在等级4到4等级的水平中存在一部分细胞类型。最后，等级4级注释被定义为主级注释（主细胞类型）。

　　然后，我们研究了单个主细胞类型，并手动注释了详细的级别细胞类型（补充图2和3）。首先，我们在每个主要簇中提取细胞，并进行了莱顿群集以确定子集群。具体而言，我们排除了每个细胞小于10的最大读数计数的基因，或者在5个细胞中以5个细胞的表达为5，计算的主成分分析（PCA）和UMAP，并在原理成分空间上构建的KNN上进行了Leiden聚类。使用函数Scanpy.tl.pca，Scanpy.pp.neighbors，Scanpy.tl.umap和Scanpy.tl.Leiden。

　　其次，我们根据标记基因和空间细胞分布手动注释了每个子类别（补充表4）。具体而言，我们首先使用scanpy.tl.rank_genes_groups确定了每个子集群的前五名基因。在每个亚集群中，我们检查了表达特定标记基因的细胞的分数和特定标记基因的平均表达。高度表达多种细胞类型的标记基因被认为是公共标记。在特定亚集群中具有特定表达式的标记被确定为集群特异性标记。此外，我们在其他SCRNA-SEQ数据库中检查并确认了这些标记基因1,2,26。我们按照上述完善了标记基因列表，并根据其余标记基因用最相关的细胞类型进行了注释。其次，要缩小到独特的注释或以相同注释区分子集群，我们检查了每个亚集群的空间细胞分布。我们观察到一些子截面明确分布在某些大脑区域，使我们可以排除无关的候选人。至于剩余的未确定子截面，我们将它们与最相关的带注释的子截图相结合，或者根据先验知识使用莱顿聚类进一步分配它们。

　　第三，我们分析了NA簇中的细胞，将这些细胞分配给有效的细胞类型，并在适当的情况下将它们组合为等级4簇。具体而言，从等级4 NA细胞中回收了以下类型：过度；非谷氨酸能神经细胞（NGNBL）；小脑Purkinje细胞（CBPC，组合成4个小脑神经元）；th+ obinh（obinh_7，合并为等级4 obinh神经元）。另外，将Na簇中的血管样细胞与秩4个血管细胞结合在一起，并重新簇。将Na簇中的神经元样细胞与等级4/meinh合并，并将4个后脑神经元和重新聚类（补充图2K）组合。由于缺乏可说的标记基因（补充图2N），仍有12个未注释的子截面（占总细胞总细胞的1.8％），这可能是由于Scrna-Seq和Starmap和Starmap Plus数据集之间的采样覆盖率差异所致。

　　值得一提的是，这项研究的细胞效果结果基于Starmap Plus数据集和已发布的SCRNA-SEQ数据集之间的共识，然后进行手动注释。Starmap Plus数据集比以前的SCRNA-Seq DataSet1绘制了更多的单元格，从而增强了更详细的单元格打字和注释。

　　细胞型工作流的示意图摘要在扩展数据中显示了图2C。

　　如前所述，我们用其他主要细胞类型的细胞量化了每种主要细胞类型细胞之间的边缘数量，如前所述12,65。简而言之，我们首先使用squidpy.gr.gr.spatial_neighbors在每个样品中通过Delaunay三角构造了网格图。然后，我们使用squidpy.gr.gr.interaction_matrix计算了来自空间连接性的近范围单元格邻接矩阵。如图4G所示，我们沿行和列轴沿行轴和列轴进行了归一化。在亚簇细胞类型水平上进行了类似的分析，并在补充表4中进行了报告。

　　对于给定样品，每个细胞的平滑表达向量是通过将其k最近的空间邻居（包括本身）的k串联的串联来表示的。66。然后将每个样品的空间平滑表达矩阵堆叠到一个数据集中，然后传递到PCA中，然后将Harmony16进行集成。然后，使用莱顿算法在主组件空间中进行聚类，然后使用UMAP50可视化。

　　值k设置为30个邻居，以识别宽解剖区域（1级），例如新皮层。为了识别子区域（级别2），例如单个新皮层层，根据预期子区域的形态，对每个级别1区域的亚集群进行了不同的K值（补充表5）。例如，由于脑膜本质上很薄，我们期望脑膜的子区域也很薄，因此需要较小的邻域尺寸K，以免平滑其更精细的结构。然后将最终水平的聚类应用于2级区域的子集，以识别基于2级基因标记的手动检查预期的更多子区域（3级）。

　　请注意，对于某个样品切片，当簇中的细胞数小于平滑值k时，无法制作串联的空间基因表达载体。在这种情况下，该单元将被进一步的亚集群拒绝。为了照顾那些被拒绝的细胞，我们进行了后处理，从其物理相邻细胞转移组织区域标签（见下文）。

　　还必须针对聚类的每个实例指定分辨率参数。手动调整了每个聚类级别的分辨率（补充表5），以根据Allen Institute小鼠地图集以及使用rank_genes_groups在Scanpy63中使用差异表达的基因分析计算的初步标记基因捕获已知的解剖特征以及初步标记基因。

　　为了鉴定组织区域标记基因，我们首先计算了每个区域所有细胞中每个基因的平均表达。然后，对于每个基因，将其在组织区域之间的分布百分比标准化为Z分数（补充表5）。

　　最后，我们手动将零散的子截面组合起来，该子截面在适当时起源于不同的主簇。为了指导空间聚类的手动策划，将非负基质分解67应用于堆叠和空间平滑的表达矩阵（即，在上面的PCA/Harmony中）识别解剖因子以及相应的基因因子负载。

　　我们首先为那些缺少注释的细胞分配了组织区域标签。在1级组织区域标签下，我们进行了KNN（此处k = 5）分类，为那些缺少1级注释的细胞分配了1级组织区域标签。同样，在2级和3级组织区域标签下，我们进行了KNN（此处k = 5）分类，分配了缺少2级或3级注释的细胞的2级或3级组织区域标签。

　　然后，我们根据3级组织区域标签（KNN，此处k = 50）进行平滑，并手动调整了某些分子组织区域标签，如下所示。首先，从平滑过程中排除了“脑膜”分子组织区域中的细胞，以最大程度地减少对附近组织区域的影响。其次，我们观察到在这个平滑过程中，附近的细胞致密区域（例如，颗粒细胞区域）将被附近的细胞致密区域（例如，分子层）淹没。因此，我们手动将分子组织区域簇保持不变的这些细胞（包括OB_5- [OBOPL]和CTX_HIP_3- [DGMO/PO]）。

　　根据公共资源21,22，我们用Allen CCFV3（参考文献20）对每个病变加上组织切片进行了注册。星形和切片的分子细胞类型图用于促进登记。具体而言，我们首先手动从Allen CCFV3手动提取一个相应的切片图像。接下来，我们在Starmap Plus Slice和相应的Allen CCFV3切片中手动单击配对的锚。软件包AP_组织学21提供了上述分析。

　　注册后，我们为每个阶层和组织切片配对了一个配对的Allen CCFV3切片。然后，我们将反向转化应用于配对的Allen CCFV3切片，并分配了Allen CCF解剖区域的标签，向Starmap和组织切片中的细胞分配，以促进分子组织区域的注释。

　　我们根据制造商的说明（Molecular Instruments（Molecular Instruments），使用商业HCR缓冲液和HCR放大器（分子仪器），在薄脑组织切片（20 µm）上进行了Smfish -HCR（v3.0）24。C57BL/6小鼠（Jackson Laboratory，000664，男性，10-13周龄）用于Smfish -HCR验证实验。简而言之，将组织切片用4％PFA在PBS上的冰上固定15分钟，用冰冷的甲醇透化30分钟，然后用PBSTR（PBS，0.1％Tween-20，0.1％Tween-20，0.1 U µL-1 Superase-IN）在室温下两次。然后将样品在HCR探针杂交缓冲液在37°C中预孵育10分钟，然后在37°C下在37°C下孵育12-16小时，并在HCR探针探针中，用自定义设计的三对HCR探针（最终浓度为25-100 nm）在HCR探针杂交液体中，并补充0.1 ML-1 YEAST-1 YEAST-1 YEAST-us trna us trna us tra us tra us，并培养。超级酶。第二天，将样品用HCR探针洗涤缓冲液洗涤，并在室温下用HCR放大器探针放大信号8-16 h。所使用的荧光扩增探针集包括B1-Alexa647，B2-Alexa594，B3-Alexa546和B5-alexa488。最后，将样品用5×SSCT（5×SSC，0.1％Tween-20）洗涤，用DAPI染色，并在PBS中成像为10％Slowfade Gold Antiffade Mountant，带有DAPI（Invitrogen，S36938，S36938），带有Leica Stellaris 8 Concocal Microscope。补充表2中提供了HCR探针的序列信息。

　　在整合了SCRNA-SEQ数据集和Starmap Plus数据集之后，我们遵循与描述的类似的归档策略，对未测量的基因进行了插补。

　　首先，我们执行了中间映射。具体而言，对于Starmap Plus中的1,022个基因中的每个基因中的每个基因中的每个基因，我们都将一个基因放出并进行了一个中间映射，以使每个Starmap加细胞与SCRNA-SEQ数据集中最相似的单元组对齐。尺寸降低和批处理效应校正方法是PCA，UMAP和和谐（与先前的分析相同）。在这里，使用了一个（基因） - 输出映射方法来评估因改变SCRNA-SEQ数据中最近邻居数量而引起的性能变化。我们评估了每个映射基因的性能得分。性能评分计算为Pearson的相关性R（跨单元）在其估算值和测量的Starmap Plus表达水平之间。根据扩展数据的结果图9a，我们选择了最近的邻居数量为200。

　　最后，我们进行了最终的归档。我们首先基于SCRNA-SEQ DATA1：平均读取<0.005的基因（即，在146,201个细胞中的总读数<740，数据的第50个百分点）生成了插补基因列表；过滤具有最大读取≤10的基因。这导致过滤后11,844个基因，我们将这些基因用于插补。为了对所有基因进行插补，我们汇总了由Starmap Plus探测的每个基因产生的中间映射。具体而言，对于每个流离失所和细胞，我们考虑了与任何中间映射中与之相关的所有SCRNA-SEQ细胞的集合。随后，对于每个细胞，我们计算了每个基因的估算表达水平，因为在相关的SCRNA-SEQ细胞集中，基因表达的加权平均值与存在每个SCRNA-SEQ细胞的次数成正比（图5A）。因此，所有基因（包括重叠基因集中的基因）的估算表达曲线与SCRNA-SEQ数对数数据的规模相同。输出为1,091,280细胞11,844-Gene矩阵。我们还通过将其与Allen ISH Data23进行比较来评估估算基因的性能得分。代表性结果如图5B所示，扩展数据图9c。

　　使用带有Starmap Plus测量的基因基因，我们检查了以下基因表达特征，以使其与保留的一（基因）（基因）OUT中间插补的插补性能相关联（扩展数据图9B，补充讨论和补充图4）。（1）Starmap Plus中的基因表达水平。（2）Starmap Plus中的空间表达异质性。对于每个基因，Moran的i（测量系数测量了总空间自相关68）用于基因的空间表达，通过函数squidpy.gr.gr.spatial_autocorr65，然后平均为20个样品切片中的每个样品中的每一个计算了该基因的空间表达。较高的Moran I代表更具图案的空间基因表达。（3）SCRNA-SEQ DATASET1中的基因表达。（4）SCRNA-SEQ数据集中的单细胞表达异质性。我们通过计算基因表达颜色的scrna-seq1 umap的moran i来量化基因的细胞表达特异性程度。

　　OLG和OPC的发展轨迹探索了。这些单元具有按照“主簇和亚集群细胞类型注释”中描述的分析，具有OLG_1，OLG_2，OLG_3和OPC的子集群注释。

　　为了量化发育阶段，我们使用功能Scanpy.tl.pca，Scanpy.pp.neighbors和Scanpy.tl.diffmap计算了PCA，邻居（KNN图）和扩散图。Scanpy软件包用于扩散MAP63,69。

　　我们将特定区域的Starmap加数据与现有区域SCRNA-SEQ数据集集成在一起，以检查细胞类型的跨数据库命名对应。

　　我们首先提到了鼠标脑皮层和海马（https://portal.brain-map.org/atlases-andlases-and-data/rnaseq)26中的scrna-seq数据集。我们提取了在顶级分子组织区域CTX_A，CTX_B，L1_HPFMO_MNG，ctx_hip_ca，ctx_hip_hip_dg和entm中提取的星形加上单元格。为了集成这些Starmap Plus细胞和SCRNA-Seq数据集，我们进行了类似的分析，如“细胞类型注释”中所述。我们首先使用Harmony16整合了所有细胞。然后，我们使用了Starmap Plus和Scrna-Seq实验之间的重叠基因来计算调整后的主要成分，并进行了关节聚类，以将SCRNA-SEQ数据集中的细胞类型标记传递到Starmap Plus Plus细胞中。根据Starmap Plus Plus与SCRNA-SEQ数据集的集成，确定了阶段性和细胞的转移标签。在每个关节群中，我们检查了这些SCRNA-Seq细胞的细胞类型标签。如果一个关节簇中的TOP-1 SCRNA-SCRNA-SEQ细胞类型标签的数量超过60％，则表明在此细胞类型上多源单细胞数据集的成功集成。因此，我们将这种主要的TOPN-1 SCRNA-SCRNA-SEQ细胞类型标签分配给了该关节簇中的病变和细胞。否则，我们认为集成不成功，并且没有将标签从SCRNA-SEQ数据集传递到Starmap Plus细胞。函数scanpy.external.pp.harmony_integrate用于执行集成。

　　然后，类似地，我们转到了鼠标脑纹状体10中的SCRNA-SEQ数据集和鼠标Cerebellum25中的SCRNA-SEQ数据集，并进行了相同的分析以生成细胞类型的对应关系。对于纹状体，我们提取了标记为顶级分子组织区域“ str”的细胞。对于小脑，我们提取了标记为顶级分子组织区域CBX_1和CBX_2的细胞。

　　我们首先根据与“ Starmap Plus数据处理”相同的过程对圆形RNA条形码点进行了呼叫。然后，在每个瓷砖中，我们对DAPI信号进行了二进制，并将其用作掩模来去除细胞核外读取圆形RNA条形码。然后，我们根据瓷砖位置信息将每个瓷砖的斑点缝合在一起。接下来，我们将圆形RNA条形码斑点分为内源基因鉴定的细胞。使用sklearn.neighbors.nearestneighbors（k = 1），我们找到了每个圆形RNA条形码点的最接近的mRNA点。然后，我们将mRNA点的细胞身份与圆形RNA条形码扩增子相关联。最后，我们计算了每个细胞的圆形RNA条形码的总数。

　　对于每个主要和亚型细胞群集，我们使用numpy.Quantile计算了第25、25、50、75、75和97.5个百分位数的汇总统计数据，以在冠状和sagittal样品（补充表8）中生成细胞类型的圆形RNA条形码表达的盒子图。

　　我们类似地计算了按照上述产生的组织区域分组细胞后，每个组织区域的2.5，第25、50、75和97.5个百分位数（补充表8）。

　　Spearman的R及其P值（两尾）在补充图1中，Pearson的R及其P值（两尾）在补充讨论中是用GraphPad Prism版本9.3.1计算的。补充图4中的P值是使用statannotations（版本0.4.4）的双面Mann – Whitney-Wilcoxon测试计算的P值（test ='Mann-Whitney'，text_format ='star ='star ='外部'）。** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。