基于先前的分析为6,7,8,9,10,30,31，使用人CGA（HCGAS）和D. melanogaster CG7194的氨基酸序列鉴定了适合晶体学的动物CGA同源物，以播种seed位置特异性迭代效果（PSI-blast）搜索NCBI非纯蛋白质数据蛋白蛋白数据。进行PSI-BLAST搜索，E值截止值为0.005，以包含在下一个搜索回合中，Blosum62评分矩阵，GAP成本为“存在11”和“扩展1”，并使用条件组成分数矩阵调整。从此搜索中鉴定出的候选同源物包括未表征的人蛋白MB21D2和T. castaneum序列XP_969398.1。使用DALI32进行了PDB中HMB21D2，TC-CGLR和蛋白质结构之间的成对结构比较，在GraphPad Prism中绘制了彼此相同（PDB90）的同源物的Z分数。选择TC-CGLR的Z分数为15，而HMB21D2的Z得分为13，以较低的截止值，以强调分析中直接相关的同源物。

　　使用PSI-Blast搜索在双翅目中进一步鉴定了HMB21D2和T. castaneum XP_969398.1的结构确定，使用PSI-Blast搜索与D. melanogaster CG7194或TC-CGLR序列或TC-CGLR序列进行了进一步鉴定，在每个回合中选择匹配已知CGLRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRITE的domain domain Symant Systim Systim Systim Systim doctiment Systim doctive systiment Systim domain domains and Simpitie。使用MAFFT（FFT-NS-I迭代精炼方法）对齐双翅目CGLR序列33，并使用Neighbour-Joining方法和Jukes-Cantor遗传距离模型在Geneious Prime V2020.12.23中构造系统发育树。使用HHPRED34和PHYRE235的对齐和预测结构同源性进行了进一步的手动分析和候选CGLR序列的策划。选择序列以预测的与CGA的结构同源性，包括存在具有G [S/G]活化环的保守核苷酸转移酶结构域和A [E/D] H [E/D] X50-90 [E/D] [E/D]催化三合会。手动细化还用于排除重复序列，基因同工型和小于250或大于700个残基的蛋白质。最后一棵树中有42种的NCBI可用基因组表示，其中包括果蝇属的31种。最终未根树中序列的聚类用于定义进化枝，在不同进化枝的成员之间共享的序列身份不超过30％。对树的进一步手动分析用于确定通过物种预测的CGLR的数量和分布（参见扩展数据图2a）。Promals3D36用于apo HCGA（PDB：4KM5）12，HMB21D2和TC-CGLR的结构指导对准图1a。MAFFT（FFT-NS-I迭代方法）33用于在扩展数据中对齐刺激序列图8a。Geneious Prime软件用于生成图3F和扩展数据图中的序列比对。1a，3a，8a。

　　使用先前针对HCGAS14优化的方法表达重组CGLR和DSTING蛋白。将动物CGLR和DSTING序列反应为大肠杆菌中的表达，并从合成构建体（Geneart或Integrated DNA Technologies）中克隆到具有N端6×His-MBP融合标签或N-MBP融合标签或N-N-Terminal 6×His-Shis-Shis-ShSumo2 fifue的自定义PET16表达载体中。除HCGA 157-522，小鼠CGAS 147-607，HMB21D2 S29 – F491，DS-CGLR1 19-393和D. eugracilis Sting 150-340外，全长编码序列被使用。D. eugracilis sting 150–340的N末端与通过Gly-Ser接头序列连接的T4溶菌酶的全长编码序列融合在一起。简而言之，转化后的BL21-Codonplus（DE3）-ril E. Coli（Agilent）在MDG培养基中生长了一夜之间，然后在0.0475的OD600接种M9ZB介质之前，将其种植。M9ZB培养物的生长至2.5的OD600（在37°C下约5小时，在230 rpm时摇动），然后在冰上冷却20分钟。用500μMIPTG诱导培养物，然后在16°C下孵育过夜，以230 rpm的振动摇动。第二天将培养物固定，然后在液氮中闪烁，以在-80°C下储存或直接裂解以纯化。如前所述，使用改良的生长方案纯化硒甲米甲氨基氨基二取代的蛋白用于晶体学实验。

　　对于大规模蛋白质纯化，用6×His-sumo2（Tc-CGLR，DS-CGLR1，DEU-CGLR，LC-CGLR和DSTING）或6×His-MBP（DM-CGLR1和DER-CGLR1和DER-CGLR1）融合标签和生长大约4-8-8-8-8-BB介绍了蛋白质的蛋白质。通过在裂解缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5、400 mM NaCl，30 mM咪唑，10％甘油和1毫米二硫代硫醇）中进行超声处理裂解，并在47,850g的47,850g下通过4°C和以4°C的液化方式进行离心。重组蛋白通过Ni-NTA树脂（Qiagen）上的重力流量纯化。用补充1 M NaCl的裂解缓冲液洗涤树脂，然后用补充300 mM咪唑的20 mL裂解缓冲液洗脱。SUMO2融合蛋白通过补充约250μg人类SENP2蛋白酶（D364 -L589带有M497A突变）在4°C下在4°C下透析（20 mm HEPES pH 7.5，250 mm KCL和1 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm dithi-）。将MBP标记的融合蛋白用缓冲液与4％甘油和无咪唑交换为裂解缓冲液，以优化重组TEV蛋白酶在大约10°C下通过重组TEV蛋白酶过夜切割的条件。接下来，使用5 mL HITRAP肝素HP色谱柱（GE Healthcare）通过离子交换色谱法纯化CGLR蛋白，并在150-1,000 mM NaCl梯度上洗脱。合并目标蛋白级分，并通过使用16/600 SuperDex 75列或16/600 SuperDex 200列（Cytiva）和存储缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，250 mm KCl和1 mm TCEP）进一步纯化尺寸纯化。将最终蛋白浓缩至约20–30 mg mL -1，并用液氮冷冻，并在-80°C下储存以进行晶体学或补充10％甘油，然后再冷冻生物化学实验。使用Ni-NTA亲和色谱法从1 L M9ZB培养物中纯化TC-CGLR和DS-CGLR1突变蛋白，并直接透析直接透析到存储缓冲液中（20 mM HEPES pH 7.5，250 mM KCl， 10％甘油和1 mM TCEP）无SUMO2 TAG裂解。

　　对于二翅目CGLR筛网中使用的小规模蛋白纯化，重组蛋白用6×His-MBP融合标签表达，除了HCGA，小鼠CGAS，TC-CGLR，DEU-CGLR，DEU-CGLR，LC-CGLR，LC-CGLR，LC-CGLR和DS-CGLR1外，还用6×fusion a 6×fusion-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sum-sumsoumsoumsoum f。在20 mL的M9ZB培养基中生长小规模培养物，具有超声处理，重组蛋白被纯化如前所述9。简而言之，通过离心并通过2 mL迷你自旋柱（Epoch Life Sciences）离心和流通液直接从裂解物中纯化蛋白质。用洗脱缓冲液（20毫米HEPES pH 7.5、400毫米NaCl，300 mM咪唑，10％甘油和1毫米二硫代硫醇）洗脱后，将缓冲液交换为储存缓冲液（20 mm HEPES pH 7.5，250 mm KCl，10％Glycerol和1 mm Tcep）。新鲜蛋白质制剂立即用于体外核苷酸合成反应。

　　使用悬挂式蒸气扩散在18°C下生长了18°C生长的天然和硒甲米甲氨基氨基氨基氨基氨基氨基氨基蛋白溶质的HMB21D2 S29 – F491，TC-CGLR和T4溶菌酶-I340的晶体。将优化的晶体在易于Xtal的15孔托盘（隔壁生物技术）中生长，并具有350μl的储液溶液和2μl液滴，并设置为1μl蛋白质溶液和1μL储层溶液的比例。hMB21D2 crystals were grown using the reservoir solution (1.2 M ammonium sulfate, 5 mM MgCl2 and 100 mM MES pH 6.2) based on conditions previously identified by Wang and Huang (University of Illinois at Urbana-Champaign)38 for 1 day before cryoprotection with reservoir solution supplemented with 30% glycerol and freezing in liquid nitrogen.使用储液溶液（0.3 M硫氰酸钾和10–16％PEG-3350）生长TC-CGLR晶体，在用储液溶液中加冷冻保护前5-16天，在含有15％乙烯乙二醇和液态氮气中冷冻的储层溶液中生长TC-CGLR晶体。使用储层溶液（0.2 M柠檬酸钠，0.1 M Tris-HCl和22％PEG-3350）生长Apo T4溶菌酶dsting晶体7天前7天，用储层溶液补充了15％乙烯和液态氮气中的冷冻溶液。使用储层溶液（0.1-0.2 m乙酸钠pH 4.8、0.2 m铵甲酸铵甲酸铵和20–22％PEG-3350）使用储层溶液（0.1-1-0.2 m乙酸钠pH 4.8、0.1-0.2 m），用250μm3'2'2'2'pe替换为3'2'2'-cyport（生物学）替代3'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'2'-cypotervoeririririririririririririririririririririririr，在液氮中冷冻。单个HMB21D2和TC-CGLR晶体的生长通过条纹播种进一步优化。X射线衍射数据是在高级光子源束线24-ID-C和24-ID-E上收集的，在高级光源束线5.0.1和8.2.2上。使用SSRL AUTOXDS脚本（A. Gonzales，SSRL，Stanford，CA，美国，美国）使用XD和Aimeless39处理数据。使用从硒甲米氨酸取代晶体收集的数据确定所有蛋白质的实验相信息。鉴定了异常位点，并在phenix40中用autosol生成初始图。结构建模在COOT41中完成，并用苯金石进行了完善。将最终结构精制成Ramachandran图的立体化学统计（受青睐/允许），Rotamer Outiers和Molprobity评分如下：HMB21D2，97.72％/2.28％，0.71％和1.27；TC-CGLR，98.17％/1.57％，0.28％和1.02；DSTING APO，98.00％/2.00％，0.33％和1.30；和DSTING-3'2'-CGAMP，97.06％/2.86％，1.72％和1.63。有关存储的PDB代码，请参见补充表1和“数据可用性”部分。所有结构图均用Pymol 2.3.0产生。

　　如前所述9，通过薄层色谱（TLC）分析了CGLR核苷酸合成活性。对于双翅目CGLR屏幕，将重组蛋白制剂在含有0.5μlα-32p标记的NTP（ATP，CTP，GTP和GTP和UTP的ATP，CTP，GTP和UTP的ATP大约0.4μCI）中孵育，200μm未标记的NTPS，10 mM mmmmmmmmMM MM MN Clanc 2 IN CTP，CTP，GTP和UTP）孵化。pH 7.5、100 mm KCl和1 mm TCEP。另外，用大约1μgpoly I：C或5μMISD45 dsDNA补充反应。将反应在37°C下孵育过夜，然后在37°C下用1μl快速CIP磷酸酶（新英格兰Biolabs）处理20分钟，以去除未反应的磷酸盐信号。将每个反应稀释在100 mm乙酸钠pH 5.2中，并在20厘米×20厘米的PEI-纤维素TLC板上发现0.5μL。用1.5 m kh2po4溶剂运行板，直到距板顶部约2.5 cm，在室温下干燥，并在使用台风三重量变量模式成像器系统（GE Healthcare）的信号检测之前暴露于磷光屏幕。对于通过TLC可视化的所有其他核苷酸合成反应，分别用5μM核酸配体和1 mM MNCL2或10 mM MGCL2在5μM下测试酶，用于昆虫CGLR或CGAS。hMB21D2 activity was tested with 1 mM MnCl2 and 10 mM MgCl2 using the following synthetic innate immune agonists: lipopeptide Pam3CSK4 (Invivogen), Staphylococcus aureus lipoteichoic acid (LTA-SA; Invivogen), Saccharomyces cerevisiae cell wall preparation (Zymosan; Invivogen), Bacillussubtilis peptidoglycan (PGN-BS; Invivogen), synthetic lipid A mimic (CRX-527; Invivogen), B. subtilis flagellin (FLA-BS; Invivogen), imidazoquinoline (Imiquimod; Invivogen), CpG oligonucleotide (ODN 2006; Invivogen) and S. aureus 23S rRNA oligonucleotide（ORN SA19； Invivogen）。除了双翅目屏幕反应， 在PEI-纤维素TLC板上发现之前，未在乙酸钠中稀释样品。使用fiji42对TLC图像进行调整以进行对比，并使用ImageQuant（8.2.0）进行定量。根据每个反应的产物与总信号的比率测量核苷酸产物的形成。对于无花果。1C，2D和扩展数据图2。3c，d，4b，5c，相对活性被计算为每种反应的百分比相对于野生型酶观察到的最大转化率的百分比，或在昆虫CGLRs的40 bp dsRNA和CGA的45 bp dsDNA中观察到的最大转化率。

　　如前所述，对体外蛋白 - 核酸络合物的形成进行了分析。简而言之，将1μm40bp dsRNA或45 bp dsDNA与DS-CGLR1或HCGAS NTase域（D157-522）孵育，浓度为0.5、1或2μM。用最终反应缓冲液（20毫米HEPES-NAOH pH 7.8、75 mm KCl和1 mm双硫代醇醇。在4°C下20分钟孵育20分钟，然后使用0.5×TB buffer（45 mm buffer）在2％琼脂糖凝胶上分离，在4°C下孵育20分钟，并在2％琼脂糖凝胶上分离，并在45毫米buald buald buffer and and Acriation and AID AGRAID AID AGROR AID AGROR AIN AGRORIS AIN AGRORIS AID AG ROARS A AG AGROSIN孵育20分钟。使用Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）可视化，在25°C下温和摇动的0.5×TB缓冲液在25°C下均匀摇动45分钟。

　　如前所述，分析了体外冷凝物的形成18,43。简而言之，DS-CGLR1用Alexafluor-488（AF488）羧酸（Succinimidyl酯）（Thermo Fisher Scientific）标记，根据制造商的手册，使用4°C时1:10使用摩尔比为1:10。Excess free dye was removed by dialysis against buffer (20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 250 mM KCl and 1 mM dithiothreitol) at 4 °C overnight, and AF488-labelled Ds-cGLR1 was then further purified on a PD-10 desalting column (GE Healthcare) eluted with storage buffer (20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 250 mM KCl和1毫米TCEP）。最终的AF488标记的DS-CGLR1浓缩至约5 mg ml-1，在液氮中闪烁，并在-80°C下以等分试样的形式储存。如先前所述，制备了HCGA和HCGAS NTase结构域（D157 – F522）蛋白。

　　To induce condensate formation, Ds-cGLR1 (10 μM, containing 1 μM AF488-labelled Ds-cGLR1) was mixed with various lengths of RNA (10 μM each) in buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mg ml−1 BSA and 1 mM TCEP) in the presence of various salt concentrations at 25 °C in a total reaction volume of 20 μl.图中指出了蛋白质，核酸和盐浓度的细节。将DS-CGLR1-RNA反应放在384孔的非结合微板岩（Greiner Bio-One）中，并在25°C下孵育30分钟，然后成像以允许冷凝物沉降。使用安装在倒置显微镜（DMI6000; Leica Microsystems）上的Leica TCS SP5 X（Leica Microsystems）的Leica TCS SP5 X（Leica Microsystems）在25°C下获取荧光显微镜图像。AF488标记的DS-CGLR1，HCGA和HCGAS NTase结构域蛋白在488 nm处的激发检测（在500–530 nm处发射）。用fiji42处理显微镜图像，并为每个酶的均匀阈值设置调节对比度。

　　人类HEK293T细胞直接从美国型培养物中（ATCC）购买，并在37°C的完整培养基（补充了青霉素，链霉素和10％FBS）中。HEK293T细胞通过ATCC验证，未对支原体污染进行测试。对于所有测定，将4.5×104个细胞铺在96孔板中。如前所述，使用双 - 荧光素酶报道器测定系统（Promega）进行了刺激和CGLR活性测定，如前所述的112进行了修改。Lipofectamine-200000用于转染IFNβ-FIREFLE荧光素酶和TK-renilla Luciferase Reporters和5 ng pcDNA4-MOUSE-MOUSE-MOUSE STING或15 ng的PCDNA4-DSTSTING混合构建体（与人类刺激性型号融合了D. eugracilis spherracilis spptn-eplains domain domain（C末端）。对于CGLR信号测定，另外转染了150 ng果蝇CGLR1，30 ng HCGA，或120 ng空的载体或150 ng空载体。每个CGLR和刺激PCDNA4质粒使用天然编码序列。转染后二十四到三十小时，使用Glomax微板读取器（Promega）测量荧光素酶，并通过将萤火虫标准化为Renilla读数来计算相对的IFNβ表达。对于Poly I：C刺激CGLR活性，用100 ng Poly I：C（滴定实验的6.125–200 ng）转染细胞后5小时。对于DSTING信号测定，将500 pm至50μm2'3'-CGAMP或3'2'-CGAMP的最终浓度使用荧光素酶测量前10小时传递到细胞中。

　　使用含有10μMCGLR酶，200μMATP，200μMGTP，10μgPoly I：C，1 mm MM MNCL2和50 mm Tris-HCl pH 7.5的CGLR核苷酸产物进行HPLC分析进行HPLC分析。必要时使用蛋白质储存缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、250 mM KCl和1 mM TCEP），以将KCl浓度调节至约100 mm。将反应在37°C下孵育1小时，然后通过通过30 kDa截止浓缩剂（Amicon）过滤反应来回收核苷酸产物，以去除蛋白质。使用C18色谱柱（Zorbax Bonus-RP 4.6×150 mm，3.5μm）在40°C的Agilent 1200 Infinity系列LC系统上分离核苷酸。以1 ml min -1的流速洗脱产物，缓冲液为50 mM NAH2PO4 pH 6.8补充了3％乙腈。

　　为了净化DEU-CGLR产物进行质谱分析，对核苷酸合成反应条件进行了缩放，如先前所述的细菌CGAS/DNCV样核苷酸转移酶反应的情况9,45。简而言之，一个10 ml反应，其中包含528 nm DEU-CGLR酶，125μMATP，125μMGTP，约250μgPoly I：C，1 mm MNCL2，Tris-HCl 250 mm Tris-HCl 7.5 7.5，与37 h的旋转旋转37°C的旋转量为37°C（均为37°C）。使用补充了α-32p标记的NTP的20μL等分试样监测反应，并通过TLC可视化产物形成。孵育后，通过10 kDa浓缩剂（Amicon）过滤大规模反应，并使用用水洗涤的1-ml Q-Sepharose柱（Cytiva）通过阴离子交换色谱法纯化，并用水洗脱0-2 m乙酸铵乙酸铵梯度。通过HPLC分析，与对应于与2'3'-C-DI-AMP相对应的分数区分了与主要产物3'2'-cgamp相对应的馏分。使用SuperDex 30增加10/300 GL（Cytiva）将DH2O作为运行缓冲液增加10/300 GL（Cytiva），进一步纯化了产品分数。将峰值分数在1 ml体积中洗脱，在质谱分析之前合并并蒸发以存储。

　　在温和的氮流下在40°C下蒸发纯化的核苷酸产物样品。将残留的沉淀重悬于200μlHPLC级水（J.T. Baker）中，然后将40μL与40μL的水混合，其中含有50 ng ml -1 Tenofovir作为内标，并转移到测量小瓶中。

　　对3'2'-CGAMP识别的实验是在Acerity UPLC I-Class/Vion IMS-QTOF高分辨率LC-MS系统（Waters Corporation）上进行的。在C18色谱柱（核杜尔金字塔C18 50×3 mm;3μmMacherey Nagel）上在30°C下进行逆相色谱分离，该圆形柱与C18安全防护罩（Phenomenex）和2-μm柱储备器相连。使用含有10毫米乙酸铵和0.1％乙酸（溶剂A）和甲醇（溶剂B）的二元梯度进行分离。分析物以0.6 mL min -1的流速洗脱。洗脱程序如下：0-4分钟：0％B，4–7.3分钟：0–10％B。保持10％B的组成持续1分钟，然后在2.7分钟内将有机含量增加到30％。然后将色谱柱重新校准至0％B，持续2分钟。总分析运行时间为13分钟。在配备有电喷雾电离源的Vion IMS-QTOF质谱仪上收集了高分辨率质谱数据，以正电离模式运行。毛细管电压设置为2.5 kV，并在40 V处的锥电压。源温度和脱溶剂温度分别为150°C和600°C。使用氩气作为碰撞气体实现了分析物碎片。使用10 V的碰撞能获得低碰撞能谱。对于高碰撞能谱，将碰撞能量从15 V升至30V。数据采集由UNIFI 1.9.4.0软件（Waters）控制。对于3'2'-cgamp识别，收集了合成3'2'-CGAMP标准（生物学）的保留时间，漂移时间和片段光谱作为参考，并与样品中可疑的3'2'-cgamp的保留时间和片段。

　　为了定量3'2'-cgamp，将色谱条件转移到耦合到Shimadzu HPLC系统（Shimadzu）的API4000质谱仪（SCIEX）中。分析物通过在正模式下进行电喷雾电离，应用3,000 V的离子化电离。进一步的电喷雾电离参数如下：窗帘气（CUR）：30 psi；碰撞气（CAD）：9;源温度：650°C；气体1：60 psi和气体2：45 psi。在SRM模式下进行检测，首先选择3'2'-CGAMP和3'3'-CGAMP的双蛋白酶离子离子（用于校准器系列）。这导致了以下质量转换：3'2'-cgamp和3'3'-cgamp：m/z 338.2→152（量词），m/z 338.2→136（标识符）。Tenefovir是内标（M/Z 288→176）。

　　对于从双翅目CGLR屏幕中的裂解物样品中的3'2'-CGAMP半定量定量，通过将3'3'-CGAMP的峰面积比为校准器的标称浓度来创建校准曲线。使用二次回归和1/x加权计算校准曲线。

　　Synthetic nucleotide standards used for HPLC analysis and mass spectrometry analysis were purchased from Biolog Life Science Institute: 3′3′-cGAMP (cat no. C 117), 2′3′-cGAMP (cat no. C 161), 3′2′-cGAMP (cat no. C 238), 2′3′-c-di-AMP (cat no. C 187) and 2′3′-c-di-GMP (cat no. C 182).

　　如前所述9,19，使用用α-32P-ATP或α-32P-GTP标记的DM-CGLR1反应进行核酸酶P1裂解分析。简而言之，将放射性标记的核苷酸产物与核酸酶P1（80 MU； N8630，Sigma）在缓冲液（30 mm NaOAC pH 5.3、5 mm ZnSO4和50 mm NaCl）中孵育30分钟，在Quick CIP（NEB）的情况下。

　　如前所述22,37，使用纯化的昆虫病毒ACNPV酶进行了毒素裂解反应。为了对毒素裂解的HPLC分析，使用100μM合成2'3'-CGAMP或3'2'-CGAMP，50 nm ACNPV POXIN，50 mM HEPES pH 7.5、10 mM KCl和1 mM TCEP进行了100μl反应。在37°C下孵育反应，并在每个指定的时间反应在95°C的热灭活中终止2分钟，然后HPLC分析如上所述。为了对毒素裂解进行TLC分析，使用Deu-CGLR合成的5-μl反应中合成的McGAS或3'2'-CGAMP合成的α-32P-GTP标记的2'3'-CGAMP进行了反应TCEP。在37°C下孵育反应，并在每个指定的时间反应在80°C的热灭活中终止5分钟，然后如上所述PEI-纤维素TLC分析。

　　在20 mM HEPES-KOH pH 7.5和100 mm kCl中，将最终浓度与3×Sypro橙色染料和100μM合成CDN（生物学）（或40 nm至100μm的浓度梯度）混合。在Bio-RAD CFX热环体中，将样品从20到95°C加热，使用HEX通道荧光测量每0.5°C进行一次。随着时间的推移，每条曲线的衍生物是使用GraphPad Prism计算的，并以荧光最大变化或用于计算熔化温度的最大变化。

　　在25°C的标准玉米面琼脂培养基上饲养飞汤。这项研究中使用的所有飞行线都是不含沃尔巴氏菌的。先前已经描述了W1118，DSTINGCONTROL和DSTINGRXN股票23,26。对Drosdel W1118的同种生成的Resiishe20苍蝇是Teixeira（Instituto GulbenkiandeCiência）的一种礼物46。将包括3'2'-CGAMP（生物学），2'3'-CGAMP（Invivogen）和3'3'-C-DI-GMP（Invivogen）（Invivogen）的环状二核苷酸溶解在10 mM Tris-HCl pH 7.5中，并稀释至指示的浓度。使用Nanoject II设备（Drummond Scientific），将成年苍蝇（3-5天大）注入69 nl环状二核苷酸溶液或10 mM Tris-HCl pH 7.5（阴性对照）（阴性对照）。如所述，在24小时后24小时收集苍蝇，在6个个体（3名男性和3个女性）或10个个体（5名男性和5个女性）的池中，并均质地提取了RNA提取，并通过逆转录（RT – QPCR）分析进行定量PCR，如所述26。使用先前发布的方案26确定所有果蝇实验的样本量。为每个实验组随机选择苍蝇，并且未进行盲目。

　　对于3'2'-CGAMP和病毒共同注射，将果蝇注入69 nL病毒（DCV：5块形形成斑块形成单位（P.F.U.），囊泡气孔病毒病毒（VSV）：2,000 P.F.U.为了比较CGAMP异构体的滴定实验，在蝇的体腔中注入了2'3'-CGAMP或3'2'-CGAMP的连续稀释浓度的69 NL（5 p.f.u.）。每天监测存活率，并在指定的时间点收集在6个个体（3名男性和3个女性）或10个个体（5名男性和5个女性）的池中，以通过RT – QPCR监测病毒RNA负载。

　　所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.0.1进行。每个实验的误差线和样本大小在图传说中定义。通过未配对的参数t检验分析基因表达和病毒载量的组之间的比较，两尾没有校正。通过对数秩检验分析了病毒感染后生存曲线的组之间的比较。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。