动物实验是在Scripps研究所，La Jolla或Beth Israel Deaconess Medical Center进行的。实验得到了Scripps研究所或贝丝以色列执事医疗中心的机构动物护理和使用委员会的批准。对2-6个月的小鼠进行了实验。野生型C57BL/J6小鼠在6-8周龄之间注射病毒，并在实验或与实验相关的习惯之前至少恢复至少1周。基于统计能力法，不是根据先前发表的研究预先确定小组规模。在病毒注射之前，将动物随机分配给不同的实验组。男性和女性均用于组织学和C-FOS标记。雄性小鼠被用于自由移动的行为研究。

　　AAV8-HSYN-DIO-GQ – MCHERRY（Addgene，No.44361-AAV8），AAV8-HSYN-DIO-GI-MCHERRY（Addgene，No。44362-AAV8），AAV8-HSHSHN-MCHERRY（Addgene，addgene，addgene，no.114472-aav8）和aav9-syn-nogenn no andg9-syn-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-wp recredpredpre（从addgene获得100841-AAV9）。

　　AAV5-ESARE-CRE-CRE-er-pest是从UNC获得的，AAV8-EF1A-DIO HCHR2（H134R）-p2ascarlett和AAV8-CAMKIIA-HCHR2-P2A-OSSCARLET是从斯坦福大学获得的。C-FOS抗体是商业购买的（Cell Signaling，第2250号）和CNO（Hello，no。HB1807）。

　　在感应室中用3.0％的异氟烷​​麻醉小鼠，5分钟后，使用耳杆将动物的头固定在立体定位器械（KOPF）上。手术期间，在温暖的加热垫上（将体温保持在36°C），将小鼠保持在0.8–1.2％的异氟烷​​下。剃光头以脱下头发，使用手术刀刀片，进行中线切口以暴露头骨。用序式前台上的bregma和lambda系统平衡了头部。使用牙科训练，在注射部位上方制造了小颅骨。使用连接到10μl汉密尔顿注射器的注射器以75 nl min -1注入病毒。在撤离之前，将针头在注射部位保留10分钟。在实验或与实验相关的习惯之前，允许小鼠恢复1-2周。

　　为了进行化学发生刺激，将125-150 nl的AAV8-HSYN-DIO-GQ-MCHERRY或AAV8-HSYN-MCHERRY和AAV5-ESARE-CRE-CRE-CEST送到VMT/XI区域（Bregma，bregma，-1.0 mm; midline，0 mm; Midline，0 mm; Dorsal suppers surface surface，−4.4.4MMMMMMMMMMMMMMMMM。鸡尾酒中ESARE病毒的最终浓度为7×1012基因组拷贝ML – 1。手术两周后，将小鼠习惯于他莫昔芬注射（Xiciec相关神经元的Vcapture标记）。

　　For optogenetics experiments with non-selective activation of the whole vMT/Xi region (bregma, −1.0 mm; midline, 0 mm; dorsal surface, −4.4 mm), 150 nl of AAV8-CaMKIIa-hChR2-p2A-oScarlet (5 × 1012 genomic copies ml–1) was injected in the vMT/Xi region.去除针后，将光纤插管（直径为200μm，0.22数值孔径（Na），RWD寿命科学）在VMT/XI100-200μm背侧植入了注射部位（bregma，-1.0 mm，-1.0 mm; midline，0 mm; Midline，0 mm; Dorsal表面，−4.4.4.2; -4.2;光学套管用牙齿水泥固定在头骨上。对于活动依赖性的光遗传学标记队列，AAV8-EF1A-DIO HCHR2（H134R）的鸡尾酒200 nl被注入VMT/XI区域。

　　对于纤维光度法实验，使用VMT/XI区域的刻度性手术注入150-180 nL的AAV9-Syn-GCAMP6M-WPRE-SV40（7×1012基因组拷贝ML – 1）病毒ML – 1）病毒（Bregma，bregma，-1.0 mM; Midline and Lineelline and ins and Line and ins and Line and ins and ins and ins and ins; clinl and ins and im; cann and ins; dors and imm; dors and imm; dors; dors; dos;（直径为400μm，0.5 Na，RWD Life Science）植入（Bregma，-0.9 mm；中线，0 mm；背面，-4.2 mm）。对于光遗传学和纤维光度法，仅植入了单纤维光学套管，因为XI是中线结构。

　　使用温度控制的啮齿动物孵化器（No。IS28SSD，Powers Scientific）保持在4°C，用于冷暴露。对于热控制条件，使用温度控制的温暖房间设置为30°C。对于所有温度暴露实验，所有小鼠均采用少量的床上用品材料，以确保每个人都接受相同的温度暴露。为了冷暴露，将动物直接转移到无盖笼中的4°C孵化器中，以促进温度平衡。除了在CIEC+条件下以及在抑制性化学发生实验中，在大多数冷和温暖的暴露实验中，为小鼠免费获得了食物和水，在这些实验中，它们被限制在各个图中所示的各种时间。

　　用于非选择性光遗传学实验后，或在他莫昔芬注射后14天内，允许小鼠恢复7天，以进行小鼠的VCAPTURE队列。训练了光遗传学小鼠，并习惯于颗粒（20毫克颗粒，编号F0071，Bioserv），并在他们的家笼中使用fed2（参考文献39），然后在他们的家用笼中进行5天，然后免费提供食物丸4天，以避免产生食品泡沫的杂种价值。在第一个实验之前，将小鼠进一步习惯了行为室，用食物颗粒和Fed2习惯5天。所有食物启动实验均在08:00至15:00之间进行，以避免自然的昼夜节律对喂养行为的影响。

　　对于光遗传学实验，将实验小鼠连接到具有光纤直径为200μm，0.22 Na，RWD Life Science）的蓝光激光器（473 nm）。在20 Hz的10毫秒脉冲中递送光，3 s ON/2 s左右，持续10分钟。光纤尖端的轻型为10兆瓦。对于化学遗传学实验，使用常规的食物颗粒来测量体重的食物摄入以增加吞吐量。通过溶解在DMSO中，将CNO的储备溶液煮熟，然后在盐水中稀释。将小鼠注入3 mg kg – 1 cnO，用于激活GQ队列，5 mg kg – 1用于抑制性GI队列。对照小鼠的CNO与实验队列相同。

　　记录了将24只单独饲养的小鼠记录在Promethion间接量热计（黑貂系统）中，并带有温度控制的橱柜（POL-EKO），并配备了额外的食物（Labdiet 5008，3.56 kcal G – 1），并通过反向渗透净化水。在12/12 h的光/深色光周期（06：00–18：00）下，将小鼠保持在23±0.2°C的环境温度下。从06:00开始，在3小时内进行了从23到4°C的温度过渡。在CALR v.1.3（参考文献40）中分析之前，用宏解释器，宏13（可见系统）导出数据。使用堰方程计算能量消耗的速率41。分析了两个数据集。数据集1：24小鼠在23°C保持2.5天（62小时）。在返回至23°C 16小时之前，将4°C的环境温度持续9小时。将数据集2：11小鼠保持在23°C 5天（115 h），然后再保持4°C 5天（118 h）（扩展数据图1C – E）。

　　为了用激活的GQ-DreadD在VMT/XI区域标记与CIEC相关的神经元，小鼠接受了用ESARE-CRE-CRE-CRE-CRE-ER+DIO-GQ进行立体定位注射病毒鸡尾酒的注射，并每天习惯于2-3小时的设置1周。将Esare-er-Cre-er-er/GQ小鼠随机分为Xiciec和Xinon-ciec组。在标签当天，将Xiciec小鼠组放在寒冷的条件下，并随意食物和水。在寒冷条件下6小时后，给出了20 mg kg – 1 4-TM（Sigma，No。H6278）。当这些小鼠进入CIEC时，在CIEC期间活跃的VMT/XI神经元会诱导FOS和CREERT2。注射4-TM后，CREERT2将有选择地重组AAV8-HSYN-DIO-GQ-MCHERRY编码的CRE依赖性GQ-Dreadd，该细胞中表达FOS的gQ-dreadd。这种重组会导致在这些细胞中GQ-DreadD的永久表达，然后通过施用Dreadd Agonist CNO在稍后的时间进行选择性激活。注射4-TM后，将这些小鼠在寒冷的条件下再保留2小时，然后返回其家笼并保持在23°C。作为对照，我们产生了进一步的小鼠队列，该小鼠接受了与Xiciec相同病毒鸡尾酒的立体定位注射，并使用相同的方案进行了习惯，除了在标签当天， 在30°C保持6小时后，他们接受了20 mg-kg-1 4-TM注射，而不是在寒冷条件下保持。图1中的C-FOS数据表明，与寒冷条件下的情况相比，小鼠在炎热条件下持续6小时，很少有细胞在VMT/XI区域中活跃。我们称这组小鼠Xinon-ciec。两组在一天中的同一时间都注射，以避免标记与昼夜节律相关的变异性。对于接受AAV5-ESARE-CRE-CRE-PEST和AAV8-EF1A-DIO-HCHR2（H134R）-p2ascarlett的AAV5-ESARE-CRE-CRE-PEST（H134R）-P2ascarlett的病毒鸡尾酒的立体定位注射的光遗传学小鼠，也遵循了类似的方案。

　　在用冰冷的PBS心心灌注之前，用异氟烷麻醉小鼠，然后是冷4％多聚甲醛（PFA）。在4°C下用4％PFA去除大脑并将其固定过夜。第二天，将固定的大脑浸入3％琼脂糖中，并在冷条件下保持2小时以嵌入。将大脑切成振动型（Leica VT1000）将其切成80μm的冠状切片，并在装满PBS的六孔板中收集为两个相等的组。为了进行免疫组织化学染色，将脑部切片与含有PBS的阻塞缓冲液，0.3％Tritonx-100（PBST）和5％驴血清一起在室温下孵育1小时，并轻轻发抖。透化后，将脑切片与4°C的原代抗体在阻塞缓冲液中孵育16小时。接下来，将脑切片用PBST洗涤3次，每次洗涤20分钟，以洗涤未结合的初级抗体，然后在室温下用二级抗体在阻塞缓冲液中稀释时将其孵育1小时。最后，将大脑切片再次用PBST洗涤3次，每个20分钟，以洗涤未结合的二级抗体，然后安装在超弗罗斯特加上玻璃载玻片（VWR）上。使用Olympus FV3000共聚焦显微镜对脑切片进行成像。每个大脑切片以10μmZ堆栈成像。对单个平原进行C-FOS定量（数字MM – 2）。对于双标签C-FOS VCAPTURE定量，将细胞计数在感兴趣的区域中，在解剖学地标之后手动定义。用于组织学的抗体为：C-FOS抗体（细胞信号，第2250号，稀释1：400），抗兔-488（杰克逊免疫研究，第711-546-152号，第1：400）。

　　在实际实验之前，将野生型C57BL/J6小鼠习惯于行为设置5天。在实验当天，在寒冷（4°C）或热中性（30°C）的条件下保持单独饲养的小鼠6小时，并在灌注前自由获取食物和水。收获大脑并在4％PFA中固定过夜。LifeCanvas Technologies通过合同服务对全脑清除，成像和自动分析进行了分析。简而言之，用盾牌（通过分子内环氧化物连接在恶劣的条件下稳定以防止降解）制备固定的全脑，以保留蛋白质抗原性，然后使用SmartBatch+积极清除并用C-FOS抗体进行免疫标记。标记的大脑与EasyIndex相匹配，并通过体积灯表显微镜（SMARTSPIM）成像，然后进行图像后处理，细胞定量，地图集注册和区域图形。每个区域中平均数量的C-FOS+细胞数量根据ABA注释进行数据可视化分为七个“桶”。点大小表示每个区域中30和4°C条件之间的平均差异。

　　将小鼠连接到连接到470和410 nm光源的斑块纤维（400μm，Na 0.5，RWD）上。先前已经描述了纤维光度法和采集设置25。470 nm激发灯用于测量Ca2+信号，并将410 nm激发灯作为参考信号。将Ca2+荧光（470 nm）信号的变化与背景CA2+荧光（410 nm）进行了比较，从而为运动和信号漂白提供了内部控制。使用科学互补的金属氧化物半导体摄像头（Hamamatsu，Orca Flash 4.0 V.2）来捕获PatchCord的末端图像，并使用先前描述的MATLAB代码处理这些图像。数据收购硬件（国家仪器，NI PCIE-6343-X）用于数字化5 kHz的图像。信号在DF/F中表示，其中F代表基线荧光。行为的视频记录用于手动注释和时间戳喂食和其他行为。从定义的事件（分别用于喂食和HMM状态）计算-20/-10至10 s的AUC和峰值。

　　对于禁食 - 取消实验，将小鼠禁食16小时。将小鼠放置在高大的腔室中，并将其套管连接到纤维光度法设置上。允许小鼠习惯30分钟，并将喂食装置（Fed3）放在腔室的一个角落。将FED3编程为在将设备放入腔室后15分钟开始分散颗粒，以避免在实验中引入噪声。如上所述进行数据采集，分析和处理。

　　将二只小鼠分为五组：1（2 h，冷），2（4 h，冷），3（2 h，hysthoneNotral），4（4 h，hysthoneponeal）和5（家用笼，0小时）。根据制造商的建议进行血浆测量的量化：小鼠瘦素ELISA试剂盒（Crystal Chem，No。90030），游离脂肪酸定量试剂盒（ABCAM，no。AB65341）和游离甘油醇Assay Kit（ABCAM，abcam，no。AB65337）。

　　在4°C记录其行为之前，将野生型C57BL/6小鼠习惯于设置（使用Fed2）4天。对于每个鼠标，使用两个单独的Logitech C270网络摄像机记录了两个视频，一个从顶视图中，一个从侧面录制。我们手动注释了每种行为的开始和结束。分析仪对小鼠的实验组视而不见。行为包括坐着，发抖，头部修饰，转弯，下半身修饰，外出，进食，向后移动，推着床，站起来，床上用品检索，饮水，挖掘，修饰尾巴和步行。每1 s注释行为。HMM需要一个输入序列，估计的过渡矩阵和估计的发射矩阵。输入序列是通过先前手动分析的180分钟视频中的数据生成的，该数据暴露于寒冷条件下4-6小时，并免费获得食物和水。将每只鼠标的输入序列放入向量。我们定义了三态HMM：（1）能源持续的状态，（2）食物消耗的探索以及（3）探索而无需食物。我们通过假设所有过渡的概率相等，为估计的过渡矩阵生成了初始猜测，因为我们没有先验信息。我们通过预测每个状态的行为概率来生成估计发射矩阵的初始猜测。我们使用Baum -Welch算法使用自定义MATLAB代码来获取过渡和发射矩阵。为了根据一系列行为计算基本行为状态，我们使用了MATLAB内置函数HMMVITERBI。

　　对于活性依赖性光遗传小鼠的基础优先测量，将Chr2-毒性或RFP毒性小鼠放在两个腔室的丙烯酸盒中（60×25×30 cm3），在室温下（23°C），腔室的每一侧都有30×25 cm2）的尺寸。每个腔室在墙上都有不同的上下文图案提示：一侧有黑白条纹的图案，另一侧是虚拟的图案。在整个30分钟会话中，用高架上视图Logitech网络相机记录了鼠标的运动。每天将小鼠习惯几个小时，在基础位置偏好之前，将纤维电缆连接到头部植入物中1周。视频是在每个房间中花费的时间手动量化的。为了在室温下测量RTPP，将小鼠放在位置优先室的中心，并在小鼠所有四个爪子都在刺激室中时打开激光器。激光被手动打开（10 MW，10 ms，20 Hz），并由坐在隔壁房间的操作员关闭，同时监视鼠标的实时高架视频。当小鼠留在刺激室中，并在离开时关闭时，激光被保留在刺激室中。为了测试小鼠经历CIEC时价变化，在寒冷条件下进行RTPP之前，将它们保持在4°C 5-6小时，并获得随意的食物和水。在23和4°C时，给小鼠在RTPP之间有1周的差距。

　　为了测量光遗传学队列中的焦虑般的行为，将小鼠放置在白壁，丙烯酸​​，开放式竞技场（60×60 cm2）的外部区域，并使用顶级观看Logitech网络摄像头记录运动20分钟。坐在隔壁房间里的操作员在监视现场视频供稿的同时，一位坐在隔壁房间里的操作员间歇性地打开和关闭了3分钟。使用自定义自动跟踪软件分析了中央40％的总时间和距离。每只鼠标仅对一次开放测试。会议结束后，小鼠被送回他们的家笼。

　　双向方差分析用于评估行为如何受其他因素的影响（例如，通过光遗传操作和温度测试的RTPP）。未配对的t检测用于两组之间的比较。整个过程都使用了两尾测试，其中α= 0.05。每个图传奇中都包含多重比较调整，生物学重复和显着性定义。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。