治疗IVT mRNA的一个关键特征是它们含有改良的核糖核苷酸，这些核糖核苷酸已显示可降低先天免疫原性，并可以提高mRNA稳定性，这两者都是mRNA疗法的有利特征1,2,3,4,5。例如，经过临床认可的SARS-COV-2 mRNA疫苗掺入N1-甲基丙啶（1-甲基ψ），已证明可以降低IVT mRNA MRNA先天免疫原性3,4,5。一些改性的核糖核苷酸，例如5-甲基胞苷（5-甲基）是真核生物中自然发生的转录后mRNA修饰，而其他则不是1-甲基酯（参考文献6,7,8,9,10）。

　　我们研究了5-甲氧基尿苷（5-甲氧基），5-甲基细胞和1-甲基ψ如何影响IVT mRNA的翻译。在IVT mRNA中使用了5-甲氧基，5-甲基C和1-甲基ψ，试图在体外增加重组蛋白合成，并用于基于IVT mRNA的临床前概念证明基于IVT mRNA的治疗11,12。如前所述，1-甲基ψ是一种核糖核苷酸，在许可IVT mRNA的SARS-COV-2疫苗中掺入核糖核苷酸，也是基于mRNA的人类疫苗和发育中的疗法2,13,14。

　　尽管使用了广泛使用，但令人惊讶的是，核糖核苷酸的修饰如何影响蛋白质的合成知之甚少，特别是对于治疗性IVT mRNA的翻译。我们对修饰的核糖核苷酸如何影响mRNA翻译的保真度感兴趣。某些核糖核苷酸的修饰可以重新编码mRNA序列（例如，inosine15）。先前已显示5-甲基在原核生物中增加了mRNA翻译过程中的误读，但尚未探索其对真核mRNA翻译忠诚度的影响16。尚未研究5-甲氧yu对翻译保真度的影响。已知假胞氨酸（ψ）会增加对真核生物中mRNA终止密码子的误读，并且会影响原核生物mRNA翻译过程中的误读16,17,18。1-甲基ψ似乎不会影响密码子误读，但已证明会影响mRNA上的蛋白质合成速率和核糖体密度，这表明对mRNA翻译有直接影响19,20。

　　目前，尚不清楚哪种修饰的核糖核苷酸会影响mRNA翻译保真度，而现有的研究主要仅限于仅在给定密码子上了解误读频率。误读mRNA密码子也只是一种可以改变多肽序列的转录后机制。到目前为止，尚未研究改良的核糖核苷酸是否会影响合成转录本期间正确阅读框的基本问题。了解这些过程对于增加了我们对经过修饰的mRNA蛋白质合成的了解至关重要，但对于在广泛不同的RNA序列或治疗环境中使用改良的核糖核苷酸的新型基于MRNA的疗法的鲁棒设计和评估也必须进行。

　　为了研究核糖核苷酸的修饰如何影响mRNA翻译过程中的阅读框架维护，我们设计和合成了IVT mRNA（FLUC+1FS），以报告框外蛋白质合成（图1A）。FLUC+1FS mRNA编码萤火虫荧光素酶（NFLUC）的氨基末端段和直接下游的FLUC（CFLUC）的互补羧基末端段。CFLUC在+1阅读框架中编码。FLUC+1FS mRNA被设计为正常翻译时会产生催化性不活性（截短）NFLUC。但是，如果核糖体在翻译过程中从框架中移出，则可以产生含有框内NFLUC和框外CFLUC的残基的细长多肽，这可以增加催化活性。

　　我们合成了包含规范核糖核苷酸的未修饰的FLUC+1FS mRNA，并在体外翻译它们。我们证实FLUC+1FS mRNA会产生催化不活跃的NFLUC（扩展数据图1）。相比之下，包含完整框架内fluc编码序列的未修饰的野生型（WT）FLUC mRNA产生了预期的活性蛋白（扩展数据图1）。然后，我们合成并翻译了每个含有5-甲氧基，5-甲基氧，1-甲基ψ，5-甲氧基+5-甲基+5-甲基+或1-甲基ψ+5-甲基的mRNA。WT FLUC mRNA的翻译不会受到1-甲基ψ或5-甲基修饰的显着影响，而是通过将两个核糖核苷酸掺入单个转录物中来减少（图1B）。单独使用5-甲氧YU，或与5-甲基结合，显着降低了WT FLUC mRNA的翻译（图1B）。在FLUC +1FS mRNA中掺入1-甲基ψ，将核糖体+1框架显着增加至相应的框内蛋白，而其他核糖核苷酸却没有观察到（图1C）。用1-甲基ψFLUC+1FS mRNA转染的HeLa细胞概括了体外翻译的结果（图1D）。根据这些观察结果，我们得出的结论是，含有1-甲基ψ或5-甲基C的IVT mRNA表现出与未修饰的mRNA相似的翻译效率，但是1-甲基ψ显着增加了mRNA翻译过程中mRNA的核糖体+1 frameshifting。

　　我们观察到在1-甲基ψmRNA的翻译过程中核糖体+1帧速率大大增加，并认为对翻译产物的了解可以更好地理解记者分析数据，并有助于解释+1框架的产物如何产生。为了解决这些方面，我们通过蛋白质印迹探测了在IVT mRNA翻译过程中产生的多肽。未修饰的FLUC+1FS mRNA的翻译产生了预期的框架内截短产物，这对于5-甲基mRNA也是如此（图1E）。1-甲基ψmRNA的翻译产生了预期的框内产物，但在较高的分子量下也产生了另外两个频段（图1E）。我们认为这些产品为+1框架多肽。我们还证实，1-甲基ψ+5-甲基c，5-甲氧基和5-甲氧基+5-甲基mRNA的蛋白质合成mRNA模板相对较差（图1E）。

　　1-甲基ψ也用于经过临床认可的SARS-COV-2 mRNA疫苗3,4。随着1-甲基ψ在体外翻译过程中增加+1核糖体框架，我们研究了这是否发生在BNT162B2的体内，这是一种含有1-甲基ψ的SARS-COV-2 mRNA疫苗。我们认为在重组抗原mRNA翻译过程中+1核糖体帧速率可能导致+1框架产物呈现给T细胞，并引起靶向脱靶细胞免疫反应（图2A）。内源性肿瘤mRNA的误解呈抗原表现已显示在体​​内发生（例如，参考文献21）。为了解决这种可能性，我们用BNT162B2疫苗接种了小鼠，并量化了其T细胞对框架内SARS-COV-2尖峰蛋白的反应，并通过Interferon-γ（Infferon-γ（Infferon-fferon-cy）（Ifferon-grofeon-grofon）（Ifferon-grofeon-fifncomcot and Infferon-fifncomcot）EliSpot（Ifferon-fferon-grofon）andifot andifnγ（ifncomcot）Elisot and and Inspot）EliSpOT。不包括由框内N末端残基和C末端+1框架残基组成的连接肽。我们发现，与未经处理的小鼠或以Chadox NCOV-19接种的小鼠相比，接种疫苗的小鼠对+1帧速率的尖峰肽的反应显着增加，该小鼠不会因N1-甲基甲基丙二酰化的mRNA22的翻译而产生抗原（图2B）。BNT162B2和CHADOX1 NCOV-19疫苗接种均对框架内SARS-COV-2尖峰产生ELISPOT反应（图2C）。这些数据表明，在BNT162B2尖峰mRNA中编码的+1框架式产物是近交小鼠的T细胞抗原，疫苗接种后可以检测到脱靶免疫力。

　　然后，我们将IFNγELISPOT对预测的+1框架的SARS-COV-2尖峰蛋白产物的响应进行了比较，在21个用BNT162B2疫苗接种的个体中，并将​​这些反应与20个用Chadox1 NCOV-19疫苗接种的个体的反应进行了比较，没有一个因疫苗而导致的不必要作用。与Chadox1 NCOV-19相比，我们检测到BNT162B2疫苗组中对+1帧六抗原的IFNγ响应明显更高（图2D）。T细胞对+1移码抗原的响应与年龄，性别或HLA亚型之间没有关联（补充表1和扩展数据图2和3）。Chadox1 NCOV-19和BNT162B2疫苗接种均对固定型SARS-COV-2峰值产生ELISPOT反应，但仅在接种BNT162B2疫苗的个体中观察到对+1帧速率的响应（图2E，F）。在SARS-COV-2病毒复制过程中，在开放阅读框（ORF）1A和ORF1B的翻译过程中，编程的-1核糖体偏移自然发生（参考文献23）。这些数据是天然SARS-COV-2感染的结果，这是不可行的，这是无节制的原因。首先，在SARS-COV-2 SPIKE亚基mRNA翻译（这本身就是一个重大发现）中，众所周知，没有验证活性发生。其次，-1框架（而不是+1帧）仅限于ORF1A和ORF1B中的一个编程站点（参考文献23）。第三，从BNT162B2 mRNA序列预测的+1框架肽，而不是野生病毒的S基因序列（扩展数据图4）。取而代之的是，这些数据表明，用1-甲基ψmRNA的疫苗接种可以引起+1核糖体弗拉梅丝（MHC） - 多种人和MHC-均匀小鼠产生的肽抗原的细胞免疫。

　　为了在1-甲基ψmRNA的翻译过程中提供进一步的机械洞察力，并识别潜在的移码位点或序列，我们翻译了1-甲基ψFLUC +1FS mRNA，纯化了主要推定的+1 +1帧速率的多肽，并携带了液态色谱量tandem tandem tandem tandem质量光谱（LC-MSS/mss/mss/msss/msssss/mssss/msssss/mss）。从这个单个多肽中，我们确定了从mRNA +1帧中得出的六个固定肽和九种肽（图3A和扩展数据表1）。将所有框内肽映射到N末端区域，而+1框架肽在下游映射（图3A）。然后，我们使用不同的蛋白酶重复此分析，并鉴定出跨越主帧和+1帧的结肽（图3B）。这些数据表明，细长的多肽确实是由框架内N末端残基和+1框架的C末端残基组成的嵌合多肽。如预期的那样，还通过编码全长FLUC的1-甲基ψmRNA的翻译产生了较短的框架产品（扩展数据图5）。

　　蛋白质合成中的明显误差（包括帧速率）可能是DNA突变或转录误差的结果24。因此，不正确的mRNA序列的忠实翻译会产生不正确的蛋白质。假定体外转录本是模板DNA的精确RNA拷贝，其精度可以通过使用的RNA聚合酶的保真度来估计。然而，替代规范的底物核糖核苷三磷酸化修饰核苷酸可能会增加转录误差。为了解决这种可能性，我们对未修饰的和1-甲基ψFLUC+1FS mRNA进行了高通量RNA测序，并在IVT mRNA的每个群体中进行了定量的核苷酸插入和缺失。每个mRNA的核苷酸缺失曲线非常相似（图3C），核苷酸插入也是如此（图3D），表明很少的位点特异性差异。插入和缺失的总体频率很低，在未修改和1-甲基ψmRNA之间没有显着差异（扩展数据表2），这得到了最近的观察结果支持25。从这些发现中，我们得出的结论是，1-甲基ψmRNA翻译的移架产物不是由于转录误差引起的，而是由于真正的核糖体+1帧速率造成的 - 转录后机制。

　　核糖体帧汇总是一种有据可查的现象，发生在许多天然发生的MRNAS24的翻译过程中。由于核糖体失速与+1帧速率的几种实例有关，因此我们询问了IVT mRNA中1-甲基ψ的存在如何影响翻译延长26,27,28。为此，我们使用共同翻译[35S]蛋氨酸Labelling29分析了未修饰或1-甲基ψWTFLUC mRNA的蛋白质合成29。对于未修饰的mRNA，1-甲基ψmRNA的翻译伸长率慢（图4A），这是由以前的观察结果支持的。所有反应持续30分钟，并且由1-甲基ψ的mRNA的翻译产生的全长蛋白质较少，这表明与未修饰的mRNA相比，伸长率较慢，而多肽产物的比例较大。这些数据表明，在含有1-甲基ψ的mRNA翻译过程中，伸长核糖体的延长。

　　目前尚不清楚1-甲基ψ在伸长过程中是否影响mRNA解码率或其他过程。我们认为，在翻译伸长过程中，1-甲基ψ密码子对较慢的解码可能会导致核糖体停滞，类似于先前在自然发生的mRNA21,28的自然转换过程中+1 frameshifting的“饥饿”密码子的观察结果。我们探测了使用氨基糖苷单霉素在1-甲基ψmRNA翻译过程中核糖体停滞的分子机制。In brief, during mRNA decoding, cognate aminoacyl-tRNA anticodon–codon interaction causes local conformational changes in 18S rRNA (in eukaryotes), after which a new peptide bond is formed, ribosome subunit rotation occurs, and subsequent ribosome conformational changes, elongation factor 2 binding and translocation to the next codon completes the elongation cycle30.在拉长核糖体中，偏霉素与18S rRNA的螺旋44结合，并在解码中心改变其构象，该中心抑制了翻译，但也允许将近似和非共同氨基酰基-TRNA与80年代核糖体A-Site31结合起来。在这样做的过程中，多霉素会增加氨基酸的掺入延长多肽32。我们认为，如果在1-甲基ψmRNA翻译过程中缓慢解码是由于氨基酰基-TRNA结合动力学的改变，则该过程可能会通过偏霉素降低。这是因为结合核糖体的核糖体可以结合其他接近或非同源氨基酰基-TRNA，并有效地增加核糖体摊位位点的底物氨基酰基-TRNA池。1-甲基ψmRNA的翻译比未修饰的mRNA慢，并且早产多肽产物的比例更大（图4A）。然而，在1-甲基ψmRNA翻译过程中，通过添加支霉素来改善多肽的伸长，而多霉素仅抑制了未修饰的mRNA翻译（图4A）。一起， 这些数据表明，1-甲基ψmRNA的缓慢翻译可能是由于核糖体失速引起的，这是由氨基酰基-TRNA结合改变引起的，并且可以通过增加将近或非认知氨基酸掺入拉长多肽来挽救。

　　尽管没有证据表明由BNT162B2疫苗接种产生的人类中的移牌产品与不良结果有关，但对于将来使用mRNA技术，MRNA序列设计经过修改以减少核糖体的frameSHIFTIFT EVENT，这一点很重要，因为这可能会限制其未来对更高剂量或更频繁剂量的应用，例如，诸如Vivo in vivo nof nom nom norm norm norm norm of norm norm of norm of inorm norm norm norm norm norm of inorm norm of inorm norm of inorm norm of inorm ins of inorm ins inorm in orm s of sorm noc s of。重要的是要继续研究治疗性mRNA误导和免疫原性，因为抗体和细胞溶解T细胞对+1移率的尖峰变体的反应和肽的进化尚未在人类和从合并的肽中获得的ELISPOT反应进行系统评估。框架内mRNA编码的产物不太可能引起适应性免疫反应，但是+1移码产物的呈现可以激活靶向宿主细胞的T细胞。我们认为，如果我们能够识别+1核糖体帧移位位点或序列，则可以改变mRNA序列以减少这种影响。作为原则的证明，我们使用了记者IVT mRNA系统。LC – MS/MS分析表明，1-甲基ψmRNA的翻译导致在检测到的框架内残基和下游+1 +1移码残基之间的编码序列区域内合成+1移码的产物（图3A）。We searched the RNA sequence corresponding to this region in the junction peptide coding sequence (Fig. 3b) and determinants of ribosome frameshifting from published mechanisms, from which we identified three potential ribosome slippery sequences (Fig. 4c), with all three sequences having the potential to be decoded by the same aminoacyl-tRNA at an in-frame codon or in the immediate +1 frame codon.值得注意的是，与Fluc+1fs滑位位点B和C相同的六个滑位点也分布在BNT162B2 Spike mRNA编码序列中。这些位点已在FLUC+1FS编码序列中注释 （图4B）和BNT163B2尖峰mRNA编码序列（扩展数据图6）。我们认为这些序列可以用作+1核糖体帧外的位点。我们以1-甲基ψ氟 +1fs mRNA的形式同义于每个位点突变，使得型氨基酸没有变化，但是将直接的+1框架密码子突变为非同源氨基酸，因此破坏了核糖体湿滑序列，并将mRNAS评估为+1 rubosomem freamshal freameSh freameSh freameSh fromessal freameSh freameSsal frameSsal（FirameSh）（frameSh）。+1框架终止密码子在湿站点A的下游存在，并且在该站点上的框架不可能有助于增加荧光素酶活性。正如预期的那样，通过位点的翻译产生的荧光素酶活性与对照水平相同（图4C）。然而，两个湿滑位点B突变体U*187C mRNA和滑移位点C突变体U*208C mRNA强烈降低+1核糖体帧速率（图4C）。值得注意的是，每个mRNA的翻译效率是相等的，这表明没有突变会不利影响mRNA翻译，但仅+1核糖体框架射击活性（图4D）。U*187C/U*208C双突变剂1-甲基ψFLUC +1FS mRNA的翻译未产生可检测的+1核糖体帧速率（图4E）。通过+1在滑落位点C上+1帧构成预测的转帧蛋白产物包含19个氨基酸残基的改变（与WT FLUC相比），而湿滑位点B的+1帧速率则产生了与WT FLUC有效100％同源的转型产品。此外，鉴于湿滑位点B或C（U*187C或U*208C）的突变显着降低了荧光素酶活性，但是相对较高的移交产品是通过U*208C mRNA的翻译而产生的（图4E）（图4E），我们认为，在较低的slipperse c Active c Activation casase casase casase casase casase casse casse cassase cassase cassase cassase的产生较低。 由于+1核糖体帧汇总，在湿滑位点B上的壁画促成了大多数检测到的荧光素酶活性。综上所述，这些数据表明，在定义的mRNA序列处的N1-甲基丙二烯化触发了核糖体+1帧速率。但是，通过适当的mRNA序列设计，可以改善此问题。