从患者的下呼吸道（痰液或气管抽吸物），上呼吸道（喉咙和鼻拭子）和凳子从患者定期从患者那里收集连续样品。根据制造商的说明，使用EASYMAG平台（BioMerieux）从500μl样品中进行核酸提取，并用MS2噬菌体稀释作为内部对照。对所有样品进行了测试，以与经过验证的一步RT-QPCR测定法与公共卫生英格兰临床微生物学共同开发的SARS-COV-2。放大反应全部在rotorgene PCR仪器上进行。CT值≤36的样品被认为是正的。

　　Covidx研究23中回收患者的血清用于测试SARS-COV-2突变体中和活性。

　　重组SARS-COV-2核素，尖峰和RBD蛋白共价耦合到不同的羧化珠套件（Luminex），形成三胞胎并如前所述进行分析24。据报道特异性结合是平均荧光强度。

　　将全血1：5在RPMI中稀释到96孔F板（康木）中，并通过单次刺激植物炎谷丁素（10μgml-1; Sigma-Aldrich），脂多糖，1μgml-1（1μgml-1，列出生物化学）或Costimimigimicals或MEM-CD3（Mem57）（Mem57）（1μgml-1）（1μgml-1），1：1,000）和IL-2（Immunotools，1,430 U ML-1，1：1,000）抗体。24小时后取上中清液。为IFNγ，IL-17，IL-2，TNF，IL-6，IL-1B和IL-10显示了水平（PG ML-1）。使用R＆D系统自定义试剂盒（R＆D Systems）上的Luminex Analyzer（Bio-Plex，Bio-Rad）上的多重粒子流式细胞仪（Bio-Plex，Bio-Rad）上测量细胞因子。

　　对于病毒基因组测序，如前所述从样品中提取总RNA25。使用ARATICNETWORK v.3协议26和使用ARTICNETWORK组装管道组装的BAM文件，使用Minion Flow Tell v.9.4.1（牛津纳米孔技术）对样品进行测序。选择了10个序列的代表性集，并使用Illumina Miseq平台进行了测序。将扩增子稀释至2ngμl -1，将25μL（50 ng）用作每个库制备反应的输入。图书馆准备根据制造商的说明使用了Kapa Hyper Prep套件（Roche）。简而言之，扩增子被终止修复，并添加了A-Overhang；然后将它们用15 mM的NextFlex DNA条形码（BIO Scientific）连接。使用Ampure珠清洁辅助产物，并在25μl中洗脱。然后，通过5个循环的PCR使用20μL进行库放大。对于负面对照，使用1 ng进行基于连接的库制备。使用贴纸（安捷伦技术）测定所有图书馆，以评估碎片尺寸并通过qpcr量化。然后将所有库以等摩尔比相应地汇总。将库以15 nm加载，并在5％Phix（Illumina）中加入，并使用Miseq Nano v.2进行了2×250 bp配对的测序的Miseq Nano v.2进行测序。对于变体呼叫，至少需要十次读取。

　　对于长阅读测序，将基因组与基于参考的组装和整个基因组的策划生物信息学管道组装在一起，最小覆盖率为20倍。对于简读测序，下载了FASTQ文件，确定和删除了质量较差的读取，并使用Trimgalore v.0.6.628删除Illumina和Phix适配器。修剪成对的末端读数映射到国家生物技术信息中心SARS-COV-2参考序列MN908947.3，使用MiniMAP2-2.17带有参数-AX和SR29。然后将BAM文件分类并用Samtools v.1.11进行分类并索引，并使用PICARD（http://broadinstitute.github.io/picard）删除PCR光学重复项。使用0％多数阈值，用BCFTOOOL产生的具有最小全基因组覆盖率的核酸的共识序列。

　　使用自定义代码作为ANCOVMULTI软件包（https://github.com/pollocklaboratory/ancovmulti）的一部分对变体频率进行了验证。这种验证背后的主要思想是在Illumina读取结束后识别并消除一致的潜在扩增错误和可突变性。此外，应用严格的滤波以消除早期实验室诱导的突变或非常低拷贝变化的偏置扩增。

　　过滤包括需要在读取开始的2 bp之内的底漆上的精确启动，至少247 bp的长度读取，少于四个良好的分离位点与参考序列不同，最大插入大小为三个核苷酸，最大缺失尺寸为11 bp，以及来自不同引物的矛盾信号的分辨率。

　　病毒RNA提取物与每个样品进行反向转录，以充分捕获病毒种群的多样性，而无需引入重新采样偏差。上标IV（Thermo Fisher Scientific）和基因特异性引物用于逆转录。用RNase H（Thermo Fisher Scientific）降解模板RNA。使用的所有引物都是使用下一代测序获得的患者共识序列的多个序列比对设计的“内部”引物。嵌套的PCR的一个连续的DNA（尖峰基因约为1.8 kb），将峰值的部分基因序列（编码氨基酸编码）扩增为一个连续的DNA（尖峰基因约为1.8 kb）。使用Platinum Taq DNA聚合酶高保真度（Invitrogen）通过PCR通过PCR扩增终末稀释的cDNA，以便30％的反应为阳性30。根据泊松统计，序列被认为≥80％可能来自HIV-1单个基因组。我们在每个样本时间点获得了20至60个单个基因组，以达到90％的置信度，以检测≥8％的病毒群体中的变体31,32。从终端稀释PCR扩增获得的部分尖峰扩增子被sanger-sewsever-Sequewe-sequeed，使用另一组八个内部引物形成连续序列。Sanger测序由Genewiz提供，并使用DNA Dynamo软件（蓝色拖拉机软件）进行手动序列编辑。

　　所有可用的全基因组SARS-COV-2序列均从2020年12月16日的Gisaid数据库（http://gisaid.org/)33下载。删除了重复和低质量序列（> 5％nucleocapsid egions），剩下212,297序列的数据集，其中212,297个序列具有212,297个序列。所有序列都是按名称排序的，只保留了用英国/英格兰标识符对序列进行排序。从该数据集中，序列被重复地进行了重复，在需要背景序列的数字中，使用seqtk（https://github.com/lh3/seqtk）随机取样。使用MAFFT v.7.475，将所有序列与SARS-COV-2参考应变MN908947.3对齐34。使用NextClade Server v.0.9（https://clades.nextstrain.org/）和命名Global Bure Bure-Bure-breat Sineages（Pangolin）的系统发育分配35。

　　使用上述策展数据集使用IQ-Tree v.2.1.236生产最大的样系统发育树。使用Modelfinder37推断了树木的进化模型选择，并使用1,000 Ultrafast Bootstrap Replicates38使用GTR+F+I模型估算了树。用figtree v.1.4.4（http://tree.bio.ed.ac.ac.uk/software/figtree/）可视化所有树，植根于SARS-COV-2参考序列和以降序排列的节点。使用内部脚本折叠的具有少于50的引导值的节点。

　　SAMFIRE软件包v.1.0639用于从BAM文件数据调用等位基因频率轨迹。如果读取的中位数为中位数至少为30，则包括读取的读数，并在必要时修剪读取末端以实现这一目标。然后将核苷酸过滤至至少30个PHRD分数；删除了少于30个此类读取的读物。还使用Samfire获得了序列之间的距离，考虑到低频变体信息。序列距离度量标准在上一篇论文40中描述，结合了整个基因组中的等位基因频率。其中L是基因组的长度，我们将Q（t）定义为4×L元素矢量，描述了在时间t采样的病毒基因组中每个基因座的每个核苷酸A，C，G和T的频率。对于基因组中的任何给定基因座I

　　其中垂直线表示差异的绝对值。然后将这些统计数据合并到整个基因组中，以生成成对序列距离度量

　　Mathematica软件包用于对时间进行成对序列距离进行回归分析，从而估算了宿主内序演化的平均速率。与系统发育分析相反，该方法假设在第93天和95天收集的样品是由于宿主内空间分离的亚群而通过随机发射而产生的，从而导致大部分病毒种群的病毒演化速率较低。

　　用自定义代码在Ancovmulti软件包（https://github.com/pollocklaboratory/ancovmulti）的一部分中，使用自定义代码in自定义验证了所有变体。

　　用指定的质粒制剂转染细胞，转染后48小时收集培养上清液并通过0.45μm孔尺寸的过滤器，以去除细胞碎片。将滤液以15,000 rpm离心120分钟，以使颗粒病毒体离心。将沉淀的病毒体裂解在Laemmli还原缓冲液（1 M Tris-HCl（pH 6.8），SDS，100％甘油，β-羟基乙醇和溴苯酚蓝色）中裂解。在还原条件下，将沉淀的病毒体对4–12％BIS-Tris蛋白凝胶（Thermo Fisher Scientific）进行SDS进行电泳。接下来是电印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用抗Spike S2（Invitrogen; 1：1,000稀释）和抗P24 GAG（NIH AIDS REAGENTS; 1：1,000稀释）抗体，使用Chemidoc MP成像系统（Biorad）可视化SARS-COV-2尖峰蛋白。

　　所有序列均已测试是否有潜在的重组，因为这将影响进化估计。使用9个算法（RDP，Maxchi，Sisscan，Geneconv，Bootscan，PhylPro，Phylpro，Chimera，Lard和3seq）探索了潜在的重组事件，并在RDP5中实现了默认设置41。为了证实任何发现，Clonalframeml V.1.1242也用于推断重组断点。这些程序都没有在我们的数据中找到重组的证据。

　　Pymol分子图形系统V.2.4.0（https：//github.com/schrodinger/pymol-open-source/Releases）用于将感兴趣的四个尖峰突变突变映射到先前发表的SARS-COV-2 SPIKE-2峰值结构（PDB：6ZGE）43中。

　　用于测试抗体滴度疗程的抗SARS-COV-2 ELISA（IgG）测定是euroimmmun medizinische labordiastika。这种基于ELISA的间接测定使用人类细胞系HEK293中表达的SARS-COV-2的重组结构尖峰1（S1）蛋白，以检测SARS-COV-2 IgG。

　　按照制造商的说明（Agilent Technologies），使用Quikchange Lightening位置定向的诱变试剂盒将氨基酸取代引入D614G PCDNA_SARS-COV-2_SPIKE质粒中，如前所述44。

　　通过使用Fugene HD转染试剂（Promega）转染HEK293T细胞来制备病毒载体。将HEK293T细胞用11μl的Fugene HD，1μgPcDNAΔ19Spike-HA，1μgP8.91HIV-1 GAG-1 GAG-POL表达vector45,46和1.5μgPCSFLW转染HEK293T细胞（表达Firefly luciferase reporter Gene the Hiv-1 nivage）。转染后48和72小时收集病毒上清液，通过0.45-μm滤光片过滤，并存储在-80°C下。SARS-COV-2假病毒的50％组织培养感染剂量（TCID50）使用稳定的GLO荧光素酶测定系统（Promega）确定。

　　如前所述47，使用基于SYBR的产品增强PCR测定法确定病毒制剂的逆转录酶活性。简而言之，在2×裂解溶液中以1：1的比例（由40％甘油（V/V），0.25％TRITON X-100（V/V），100 mM KCl，RNase抑制剂0.8 U ML-ML-ML-ML-ML-ML-MM 100 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmbubered pherepers，将十倍的病毒上场稀释液（由40％甘油（V/V）组成1：1）。

　　然后，将每种样品裂解物添加到13μl的SYBR绿色主混合物中（包含0.5μm的MS2 RNA前进和反向引物，3.5 pmol ML -1的MS2 RNA和0.125Uμl -1 0.125UμL -1的RIBOLOCK RNase RNase抑制剂，并在量化的相对量度中均为compase。RNA，具有绝对逆转录酶活性，通过将逆转录的相对量与已知活性的逆转录酶标准进行比较。

　　峰值假型测定法具有与使用完全感染性野生型SARS-COV-28相似的中和测试的特征。使用表达荧光素酶的SARS-COV-2尖峰型病毒48，对用ACE2和TMPRSS2瞬时转染的HEK293T细胞进行病毒中和测定。将假病毒与热灭活的人血清样品的连续稀释液或在37°C的复制中孵育1小时。还包括病毒和仅细胞对照。然后，将新鲜胰蛋白酶的HEK293T ACE2-和表达TMPRSS2的细胞添加到每个井中。在37°C下在5％CO2环境中孵育48小时后，使用稳定的GLO荧光素酶测定系统（Promega）测量发光。

　　使用稳定表达ACE2的HeLa细胞进行了病毒中和测定，并使用以前描述的49的SARS-COV-2尖峰伪型病毒表达荧光素酶。将伪型病毒与纯化的单克隆抗体的连续稀释液在37°C的重复中孵育1小时。然后，将新鲜胰蛋白酶的HELA ACE2表达细胞添加到每个井中。在37°C下在5％CO2环境中孵育48 h后，使用明亮的Glo荧光素酶测定系统（Promega）测量发光，并相对于仅病毒对照来计算中和。IC50值是在GraphPad Prism中计算的。

　　该研究得到了英格兰东部 - 卡姆布里奇中央研究伦理委员会（17/ee/0025）的批准。从患者和他的家人那里获得了书面知情同意。在道德审查委员会的批准下，将额外的对照患者纳入了NIHR生物库中心剑桥（17/ee/0025）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。