对于同等作用RNA-Seq，在七个条件下生长了酿酒酵母菌株，其比例不同，LICL（Sigma-Aldrich，L9650）和环己酰亚胺（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich，37094）生长，确保了50％的生长抑制作用（Yeak yeast y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y1 y12（Sigma-Aldrich 91249）2％w/v，葡萄糖（Sigma-Aldrich D9434）2％w/v）含有无药物（扩展数据表1）。将冷冻的储备稀释到含药物的井中130次，而没有药物的井中100倍。将细胞总共在96孔板上的最终吸光度孵育约17小时，最终吸光度约为0.1，对应于OD600 nm约0.5。然后收集细胞，并使用酵母的Ribopure RNA纯化试剂盒进行RNA提取（Thermo Fisher Scientific，AM1926）。提取的RNA被发送到维也纳生物中心核心设施的下一代测序设施，在该设施中，使用Illumina true Seq适配器多路复用，使用Illumina true Seq适配器，使用Illumina Hiseqv4和Demultiplexed进行了iLlumina recozero酵母试剂盒耗尽了rRNA。

　　从具有单个应力源处理的RNA样品是从每8 h（参考文献7）（参考文献7）（参考文献7）的培养物中获得的，总孵育时间为24小时，以使培养物保持指数相并确保发生药物效应。用药物在YPD中生长菌株，要么以浓度梯度选择最接近生长抑制的50％的样品（LICL，Fenpropimorph和Myriocin），要么以单个浓度（0.4 M NaCl和葡萄糖20％）。Fenpropimorph（Sigma-Aldrich 36772）以0.5–1.5 µm的梯度测试；测序的样品用0.85 µm fenpropimorph处理。Myriocin（Sigma-Aldrich 476300）梯度包括0.25-0.75 µg ml-1;测序0.32 µg mL -1霉菌素样品。对于每个提取的RNA样品，在科隆基因组学中心（CCG）制备了mRNA和核糖耗尽的总RNA测序文库，并使用2×100 bp的配对末端读数进行了测序。

　　使用TopHat51或HISAT252将测序引起的读数与注释的参考S. cerevisiae基因组R64-2对齐。使用从参考.GFF .GFF注释文件中提取的自定义生产的.saf文件，使用farmaturecounts53量化了添加到内含子基因的内含子或cd的映射。内含子保留率计算为归一化的内含子计数比内含子长度的比率，而内含子的长度超过了CDS的归一化为CDS区域的长度。对于包含多个内含子的基因，将内含子共同处理CD内含子，并分别用5'UTR内含子处理。使用集成基因组观察器可视化对齐54。

　　对于扩展数据中显示的分析图1F，首先确定了连续读数的数量（不允许不匹配）重叠单个内含子末端。然后将该计数平均在内含子末端的5'和3'端之间取平均值，然后除以读取长度（50 bp）。然后将内含子保留率计算为所得值与CD的计数的比率标准化为CDS区域的长度。

　　为了进行GO富集分析，与No-drug Control相比，在LICL的内含子保留率的增加（图1C）或增加（扩展数据图1B）的基础上，将含有内含子的基因订购为排名列表。然后，分别使用Gorilla55分析了排名列表，分别用于细胞成分或生物过程。此处报告的调整后的P值对应于大猩猩报告的错误发现率。使用Revigo56可视化基因富集。

　　为了衡量酿酒酵母自然群体中RPS22b 5'UTR内含子的进化保护（扩展数据图3E），使用Clustal Omega58对1,011分离株的先前发表的1,011分离株的测序数据进行了对齐，并使用MSA-BIOJS59可视化。

　　整个酵母蛋白– GFP库8，包含在43 96孔微镀酸盐中，通过在四个条件下培养药物诱导的双峰筛选：YPD培养基不含药物，环己酰亚胺，LICL或LICL和环己酰亚胺的组合。屏幕分为六个实验批次。在每批中，都会处理多达九个板的板，并在同一天和同一微晶板上在四个条件下培养相同的应变，每个实验可产生多达36个微晶的板。在实验之前，将空板和YPD培养基预孵育30°C，以确保基因表达测量的可重复性。将LICL，环己酰亚胺或两者的混合物用YPD稀释至达到40％抑制所需的最终浓度，并确保在混合条件下以等值方式混合LICL和CycloHeximide，这意味着它们本身会引起它们都会引起大致相同（较小的）生长抑制（扩展）数据表1）。将药物溶液的排成方式将其排成一个96孔微量固定板，包括无药物的YPD对照，可以在每微米板的4个条件下培养24个菌株。将存储在-80°C的库板融化，并使用电子多步多渠道移液管，将相应菌株的1.5μl饱和甘油储备接种到每个含药物井中的含量和0.2μl饱和的甘油储备中，将其接种到无用的YPD中。无药物对照的较小的接种物尺寸旨在确保实验结束时的最终细胞密度与含药物井的最终密度可比。将板在保持在30°C的自动孵化器（Liconic Storex）中孵育约14小时，湿度大于95％，以超过1,000 rpm的速度剧烈摇动。在孵化期间， 在Tecan Infinite F500读板读取器中，每45分钟测量OD600 nm。除了在每次测量之前直接在孵化过程中摇动外，板在1,100 rpm的磁振动板（Teleshake; Thermo Fisher Scientific）上摇动20 s。使用Tecan Freedomevo软件对自动设置进行了编程。通过将一条线拟合到OD600 nm测量值的对数线性部分，可以推断出增长率。

　　孵育后，将96孔微滴定板中的酵母细胞以1,050g离心3.5分钟，并通过在钛s振机上以1,000 rpm的速度剧烈摇动30 s，在冰冷的Tris-EDTA缓冲液中重悬于冰冷的Tris-EDTA缓冲液中。在1,050g的另一个离心3.5分钟后，将细胞重悬于80 µL的Tris-EDTA中，并立即存储在-80°C下。在流式细胞仪测量的那天，将板在冰上融化约3小时，并保持冰，直到测量。使用FACS Diva软件，使用配备了高通量采样器的BD FACS CANTO II测量10,000个单元的荧光。将在FITC-H通道中测得的绿色荧光标准化为正向散点FSC-H通道。

　　在表达直方图的目视检查时，可以手动选择表现出双峰性，次要峰或基因表达的显着变化的菌株，以进行更详细的屏幕。将所选菌株从酵母蛋白– GFP库微晶片板上重新染色到YPD-Agar板上，并将每个菌株的单个克隆挑选，并在96孔微滴定板中培养至饱和。将甘油添加到15％的最终浓度中，并将板冷冻。在八个条件下筛选板（扩展数据表1），并使用流式细胞仪分析与上述相似的方式。相关菌株的身份 - RPS22A，RPS22B，ARO9，HSP12，CIT1和TDH1-由PCR和凝胶电泳证实，如前所述8，使用常见的F2CHK反向引物和特定于（从https://yeastgfpp.fpp.fpp.fpp.yeastgengengecent of）进行的f2CHK反向引物和特定于菌株。菌株SMI1在屏幕上出现双峰。但是，无法如上确认其身份。未测试其他菌株的身份。

　　RPS22B（RPS22B-∆I1-∆I2，RPS2BDI_JPY138F4; RPS22B-∆I1，RPS2BD1I_MDY125A4; RPS2BDI_JPY138F4; RPS2B-∆I1- ∆I2，rps2b-∆i1- ∆i2;RPS9ADI_MDY13H8）以及父母单倍体应变WT_JPY10H3（MATAURA3Δ0LYS2Δ0LEU2Δ0HIS3Δ200）是J. Parenteau和S. Abou Elela5的礼物。从匹配的酵母蛋白-GFP库菌株中，将父母和内含子缺失菌株用GFP融合到感兴趣蛋白的GFP标记。为此，使用酵母DNA提取试剂盒提取RPS22B -GFP和RPS9A -GFP菌株的DNA（Thermo Fisher Scientific，78870）。使用相应的F2和R1对的PCR扩增具有40个碱基对侧面序列的GFP标签，以先前的研究8（https://yeastgfp.yeastgenome.org/yeastgfpoligosequence.txt）的相应F2和R1对进行，在接下来的反应条件下：2 ng ml-1 dna中的per nna hign n n g per n n n n g n n g n n g dna。聚合酶（Thermo Fisher Scientific，F530SPM），4μL的5倍phusion HF缓冲液，0.2μMDNTPS和0.5μM引物。将PCR在98°C下孵育3分钟，然后在98°C的34个循环中孵育30 s和72°C 2.5分钟，并在72°C的最终孵育5分钟。如先前的Report60中，将所得的PCR产物转化为父母WT_JPY10H3和∆I菌株，选择了SD -HIS琼脂平板（Takara Bio，630411;对角线GmbH＆Cokg，Y1751）。PCR使用引物的组合证实了单个菌落GFP的正确基因组环境插入，该底漆还允许确认内含子缺失菌株。为了确认RPS22B-∆I和WT_JPY10H3菌株中的RPS22B – GFP融合，我们使用了Primers RPS22B-899F 5'-CCGTTATTCTTCTCGCAACC-3''5'UTRON和RPS22B-CHK（REFS）5'-utron Intron和RPS22B-CHK（REF。CDS内含子序列中的Actagatggtgtgtgatcgggc-3'结合与反向引物F2CHK结合 （参考文献60）5'-AACCCGGGGGATCCGTCGACC-3'，与GFP序列互补。为了确认RPS9A-∆I和WT_JPY10H3菌株中的RPS9A – GFP融合，我们使用了开放阅读框架和F2CHK上游上游的RPS9A-800F 5'-GTTCGATTTCGTGGCGCGC-3'。一旦成功构造了GFP报告基因菌株，将20μl饱和的过夜培养物接种到含有180μlYPD的96孔微滴定板中，具有相应的LICL浓度。将微量定板在30°C下孵育，并在900 rpm上在钛s振机上连续摇动7小时，并在流式细胞仪上收集并测量如上所述。具有基因组集成的GFP的菌株具有不同的5'UTR融合，是G. stormo26实验室的礼物。

　　如前所述，与流式细胞仪测量结果相结合的重新接种设置用于测量LICL和环己酰胺的详细二维（2D）梯度以及LICL和LICL和Myriocin（Sigma-Aldrich，M1177）中的RPS22B表达。简而言之，从ORF-GFP库8中融合到GFP蛋白的RPS22B基因8的酿酒酵母菌株在YPD肉汤中在圆锥烧瓶中生长过夜，然后分布在96孔板中。具有八个液体处理通道和机器人操纵器的定制机器人设置（Tecan Freedom EVO 150）用于在YPD上生产2D离散的两次两次24×24孔梯度，分布在6个96孔的板上，并将酵母在200μl和最终的液体中接种到最终的液态，并在200μl上进行均匀的液体，并在最终的液体中进行均匀的液体，并在最终的0.0英尺上进行均匀的0.03，并将其接种，并在96上，均为0.036，以96-36效果，以均为0.0 fell inserive of Dell sormizy Blister plate in a Ofe a onsermized a plate。OD600 nm为0.15。通过添加从以前从储存化学品（Cycloheximide和Myriocin）中制备的-20°C储存（无需重新冻结）的浓缩DMSO药物来制备工作药物溶液，或者直接在YPD和无菌过滤（Licl）中溶解。将六个板孵育三个迭代，每个迭代持续约8小时。孵育后，按照上述流式细胞仪收集细胞并测量细胞。RPS22b蛋白双峰被定量为RPS22B蛋白单细胞表达直方图上的槽的深度。也就是说，槽与两个峰的下部之间的Y轴距离（图2D）。为此，使用MATLAB函数FindPeaks来确定从槽从槽到直方图值的峰值的突出性。

　　将组成型胞质麦克利表达添加到父母和内含子缺失GFP融合菌株中。为此，通过M. Springer实验室提供的Noti消化的SLVA06质粒61转化后，通过同源重组插入了TDH3 :: MCHERRY构建体。将具有组成型MCHERRY表达的RPS22B -GFP菌株接种到YPD中，并在30°C下孵育16小时。在YPD中将过夜培养物稀释至4.5 mg ml-1 licl，孵育6小时，并用PBS洗涤两次。用Becton Dickinson Influx细胞分类器将阳性MCHERRY细胞分为低GFP和高GFP种群（有关门控策略，请参见补充图1）。大约每种条件的8×106个分类细胞用于RNA提取和测序（请参阅“转录同学分析”）。用PBS制备以最终浓度为4,000个细胞的最终浓度分类细胞的样品，以进行以下实验。分类后，立即将15 µL样品接种到24个重复中的新鲜YPD培养基中。每20分钟每20分钟测量光密度，在30°C孵化的板读取器中，持续摇动。通过减去背景来纠正OD，并通过线性拟合到校正的OD测量值的对数线性部分的线性拟合来推断出生长速率。丢弃了由细菌污染引起的高于0.85 H -1的增长率。进行了两尾t检验，以比较两个分类群体的生长速率（使用MATLAB R2019A中的函数TTEST2）。为了使饥饿后的得分存活，将分选的细胞在30°C下以200 rpm的速度在30°C中孵育。在每个采样时间点，将50 µL的饥饿培养物散布在填充35 mL YPD-Agar的综合板（Thermo Fisher Scientific）上，每个排序的种群进行了两个重复。在30°C下种植琼脂板，在36小时后拍摄照片 并使用ImageJ计数菌落。为了量化低GFP和高GFP种群之间的差异（图3H），我们使用了沿所有时间点沿所有时间点的总低-GFP和高GFP菌落计数之间的差δ。为了测试δ的统计显着性，我们使用了自举。简而言之，我们创建了104个替代物（人工数据集），符合零假设，即种群之间没有差异。为了创建这样的替代物，我们对每个复制和时间点进行了抽样，而均来自泊松分布的菌落计数，速率λ与该时间点的平均菌落数相对应。我们确定了P值作为表现出比原始实验数据集更高的替代物的比例。

　　对于图3中所示的显微照片，使用了ORF-GFP库RPS22B-GFP菌株。for experiments with the intron deletion mutants (Extended Data Fig. 7), we used the 5′ UTR intron-deletion strain and its parental Rps22B–GFP strain, both transformed with a plasmid constitutively expressing mCherry (see ‘FACS of Rps22B–GFP and experiments with GFP-sorted cells’) to allow for easy tracking of cellular integrity, because cells lose the mCherry signal after裂解；此方法先前已用于跟踪细菌细胞的裂解62。将菌株在30°C的YPD中接种，并摇动过夜。使用Cellasic Onix2 System软件，将所得培养物稀释20倍，并在55 kPa压力下以55 kPa压力加载到55 kPa压力下的细胞上酵母微流体板（Merckmillipore）。在10 kPa压力下以时间控制的方式将一系列YPD，LICL-ESPD，饥饿培养基（花费的培养基或PBS）和YPD序列通过微流体室冲洗。通过在YPD培养基中孵育RPS22b -GFP菌株7天，随后无菌过滤产生用过的培养基。在经验上选择饥饿时间，以使中间数量的细胞在长期饥饿状态下死亡或在短饥饿之后发芽。使用NIS Elements软件，在30-°C的笼孵化器中，通过100倍油物镜，使用100倍油物镜在多个位置进行每5分钟的样品，并使用Nikon Eclipse Ti倒置显微镜进行成像。从饥饿应力之前（图3）进行了酵母的显微照片（图3），并使用Cellstar Matlab插件进行分割并荧光定量，并对荧光读数进行了log10转换。然后在视觉上进行延时图像，以确定补充营养成分后哪些细胞发芽或裂解。使用YEAZ64对带有内含子缺失突变体的实验的延时视频进行了分割和跟踪。

　　5'UTR内含子缺失应变及其父母应变，带有RPS22B – GFP融合和组成型MCHERRY表达，在YPD中过夜。对于液体介质中的生长速率测定实验，将5 ml的每种饱和过夜培养物标准化为OD600 nm = 0.1，并在1/10稀释的YPD中接种含有0、2.25、4.5或9 mg ml -1 licl，在每个应变和状况的12个复制中。每5分钟在30°C孵育期间，在板读取器中每5分钟测量OD每5分钟，持续摇动。OD和生长速率如上所述（请参阅“ RPS22B-GFP的FACS，以及GFP分级细胞的实验”）。为了在饥饿下得分生存，将每种过夜培养物的1 ml接种到19 ml的YPD中，用9 mg ml -1 licl接种。将培养物在30°C下孵育200 rpm摇动6小时。将培养物标准化为OD600 nm = 1，并通过在1,050 g处离心5分钟，并在20 mL PBS中重悬于两次。每毫升5,000个细胞的稀释度在30°C下孵育，并持续摇动。如上所述，将其镀在YPD-Agar上，孵育和分析菌落计数如上所述（请参阅“ RPS22B-GFP的FACS以及GFP分类细胞的实验”）。

　　ORF-GFP库RPS22B – GFP培养物被接种到YPD培养基中，YPD含有0.6 M NaCl，2 M KCl（Sigma Aldrich，S3014和P9541）或YPD，或YPD，或YPD培养物或YPD培养物或YPD培养物或YPD培养物，或含有5％，10％或20％或20％或20％或20％（W/V）Glucose（W/V）Glucose（sigma Aldrucma Aldry aldrich，sigma Aldrich，sigma aldrich，sigma peptone培养基）或酵母pept。为了测量来自不同细胞密度和生长阶段的细胞的荧光强度，制备了六个微量定板，每个板都有相同的条件，但具有一定梯度的初始接种物尺寸；这样，每个板都以不同的细胞密度来解释应力阵列，并且可以在不同的时间点孵育和分析。为此，将饱和的过夜培养物用YPD在4/5的连续稀释度中稀释（即，将4 mL转移到最终体积为5 mL的最终体积）中，以获得（4/5）0至（4/5）23稀释液。随后，在185μl培养基中接种15μl细胞稀释液。将板孵育在持牌店中，并保持在30°C，湿度大于95％，并且持续摇动。接种自动机器人系统后，在8、12、16、20和24小时处理板，该机器人系统由ACELL系统（大型生物溶液）组成，该系统与Lynx液体液体处理系统（动态设备）集成，板读取器（Synergy H1，Biotek）和A Antoflex Frowsetser（Beckman coulter）。首先，如上所述摇动并测量板，以获得OD600 nm值。然后将培养物转移到新板上，并在必要时用Tris-EDTA缓冲液稀释至约0.3的吸光度，以避免高细胞密度，并通过流式细胞仪测量。

　　LICL中的RPS22B蛋白双峰性使用两名研究人员独立复制，至少使用两种不同的酵母菌菌株；所有复制尝试都是成功的。NaCl和KCl中的RPS22b蛋白双峰性确定了两次。所有复制尝试都是成功的。RPS22B 5'UTR内含子缺失菌株中双峰性的损失被复制了3次。所有复制尝试都是成功的。观察到LICL中RPS22b 5'UTR内含子– GFP融合的双峰表达两次。所有尝试都是成功的。在高葡萄糖中生长后，RPS22b双峰性在固定阶段的进入两次。观察最大双峰性的确切时机各不相同，因此如“其他渗透应力和高葡萄糖中的RPS22双峰性”中所述测量了多个时间点。使用描述的孵化方法进行复制的所有尝试都是成功的。使用不同的微晶板振动板（Heidolph）进行复制的一种尝试导致异质性不太明显，这可能是由于曝气程度不同或摇动。通过测序确定的内含子保留量被两名研究人员独立确认，一次由每个研究人员独立确认。所有复制尝试都是成功的。RPS22B-HIGH和RPS22b-low细胞的延时显微镜表型在稍微修改的设置中被复制两次，并且具有独立的菌株，如图3所述，扩展数据图7；所有复制尝试都是成功的。对于扩展数据图7中显示的实验，对两个饥饿条件进行了不同的测试，其中饥饿期的长度变化了，以在实验的时间范围内实现中间数量的细胞死亡，并在视觉上进行评估，然后对所选条件进行量化。由于实验努力的规模，进行了整个酵母 - GFP库同流扫描。 在表达直方图的目视检查时，约有10％的菌株被限制为排除污染的可能性，并在手稿中详细介绍了一次更详细的反平行梯度上的测量可能性。RPS9A和ARO9的双峰性又以详细的离散的2D药物浓度梯度与RPS22B中手稿中所示的相似。为了确定RPS22b表达水平的表型效应，对细胞进行了一次分选，并分别在2和24个重复中进行生存和生长测定。通过其他方法（使用扩展数据8中的内含子缺失突变体的延时显微镜和表型测定）独立证实了表型效应。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。