HEK（HEK FLP-IN T-REX 293，Invitrogen）细胞在补充的DMEM（Sigma-Aldrich）中培养，并在标准组织培养条件下（37°C，5％CO2）培养了10％胎牛血清（Gibco）。HEK293F（Thermo Fisher Scientific）细胞在37°C，8％CO2和120 rpm的自由泳培养基（Thermo Fisher Scientific）中培养。细胞对支原体污染阴性。

　　For immunoblotting, when HEK cells were at about 80% confluency, they were washed twice with ice-cold PBS and scraped in PBS, pelleted by centrifugation for 5 min at 1,000g, 4 °C and resuspended in modified native lysis buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10% glycerol, 0.1% NP-40,1 mm PMSF，完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒和1 mm DTT）。裂解缓冲液还补充了30 U ML -1苯并酶去除DNA。在冰上进行裂解20分钟，并在4°C下以12,000g离心10分钟来阐明裂解液。使用BCA测定法（Thermo Fisher Scientific）确定蛋白质浓度。将4倍天然份样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific）添加到最终浓度为1倍。然后，将15 µg的每个样品在3–12％的BIS-Tris本地盖尔（Thermo Fisher Scientific）上解析。将天然份浸入0.1％SDS缓冲液中15分钟，然后转移至在甲醇中预留30 s的0.45 µm PVDF膜。将膜用5％的分子生物学级BSA（Millipore Sigma）封闭，在室温下补充了0.1％Tween-20（TBST）的Tris缓冲盐水中，在室温下1小时，然后在4°C的特定初级抗体中探测过一夜。在1％BSA/TBST中稀释一抗：1：10,000兔抗CCT5（ABCAM，AB129016）。二抗在TBST中稀释1：10,000。用恢复总蛋白质染色检测总蛋白。使用Li-Cor Odyssey红外成像仪进行荧光信号检测。

　　将HEK细胞（5×105）播种到六孔板中。然后，在镀金后24小时，将25 pmol siRNA（Thermo Fisher Scientific，s17467）与lipofectamine rnaimax转染试剂（Invitrogen）一起添加。48小时后，用冰冷的PBS收集细胞，然后进行免疫印迹以进行进一步分析。

　　使用位置定向诱变获得PDCD5突变体。将一个6×HIS标签添加到PDCD5的C端。将含有WT和突变体PDCD5的质粒转化为大肠杆菌Rosetta de3竞争细胞的表达。PDCD5表示并纯化为先前报道的33。简而言之，首先通过镍柱通过细胞裂解液，然后在高咪唑缓冲液中洗脱与镍树脂结合的PDCD5，并通过两次通过SuperDex 200尺寸分解柱将洗脱获得了纯PDCD5。通过离心浓缩蛋白质，然后使用BCA比色测定法对蛋白质进行定量。

　　如前所述进行测定48。简而言之，Quinaldine Red的库存溶液为0.05％（w/v），2.32％（w/v）聚乙烯醇，5.72％（w/v）在6 M HCl中四氢铵铵四氢苯二甲酸铵，并在2：1：1：2的quinaldine Red Guengent Fearmiment中混合在2：1：1：2。然后，将300 nm TRIC稀释在ATPase缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、100 mM KCl，5 mM MGCl，MMGCLC2、10％甘油，1 mM TCEP；30μL总反应体积）中，预热至37°C，然后添加到3μL或10 mm的反应中，以启用3μl的反应，或者在反应中均可拟合，或者在反应中均不足，以征服3μLPDCD5。通过在冰上添加5μl的60 mM EDTA来停止反应，在冰上96孔不透明的非紧密聚苯乙烯板（Sigma-Aldrich，CLS3992）在冰上添加了反应。在收集所有时间点的样品后，通过添加80μlQuinaldine Red试剂进行10分钟而产生反应，然后通过添加10μL32％（w/v）柠檬酸钠来淬火。使用ClarioStar读取器（BMG LabTech）测量荧光强度（激发，430 nm；发射，530 nm）。分析是通过将磷酸盐标准曲线与单相衰减函数拟合，我们得出了用于计算从CCT复合物释放的磷酸盐量的参数。

　　为了探测PDCD5对TRIC的结合亲和力，将增加量的重组PDCD5变体与固定浓度的Tric（300 nm）在25°C的ATPase缓冲液中（50 mm Tris-HCl PH 7.4，100 mm Kcl，5 mm Mmgcl2，5 mm mgcl2，10％glycerol n in ATPase Buffer）在25°C下孵育20分钟。如上所述，这些反应以天然凝胶进行，并使用PDCD5或CCT8抗体进行免疫印迹。为了测试PDCD5是否与三分线开放式或闭合构象结合，将3μMWT或突变体PDCD5与300 nm Tric在25°C下在ATPase Buffer中在25°C下孵育20分钟，该ATPase缓冲液含有1 mm的不同核苷酸和ATP类似物。如上所述，这些反应以天然凝胶进行，并使用PDCD5或CCT8抗体进行免疫印迹。为了获得有关PDCD5变体与Tric的结合动力学的见解，将3μMWT或突变体PDCD5与300 nm Tric在25°C的ATPase缓冲液中孵育10、15、20、20和30分钟。反应以天然凝胶进行，并使用PDCD5（ProteIntech，12456-1-AP，1：1,000）和CCT8（Santa Cruz Biotechnology，SC-377261，1：250）抗体进行免疫印迹。

　　对于PDCD5 – Flag co-IP，转染后在HEK293F中暂时表达PDCD5-FLAG构建体（Genscript）。通过离心在收集之前，用PBS洗涤细胞，并在液氮中冷冻。将HEK293F细胞在裂解缓冲液中裂解（PBS pH 7.4、0.1％igepal Ca-630、5 mM MGCL2，新鲜添加0.6 mM苯基甲基磺酰氟氟化物和蛋白酶抑制剂），通过在24型原子针上进行三次孵育，并在冰上孵育10次，并在冰上孵育5分钟。通过离心裂解液清除后，将500μg澄清的蛋白质提取物与20 µL填充的抗flag M2珠（Sigma-Aldrich）混合，并在4°C下孵育1小时。三个用裂解缓冲液洗涤后，通过在LDS样品缓冲液中煮沸（Invitrogen）洗脱结合的蛋白质。对于蛋白质印迹，将输入和洗脱样品（IP）样品加载到4–12％的Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上，然后转移到硝基纤维素膜（Bio-Rad）中。

　　用未转染的HEK293F细胞与在37°C下在37°C下用1.5 mM二硫代（DSP; Thermo Fisher Scientific）进行体内交联的CCT3 Co-IP进行体内交联。通过将TRI（pH 8.0）添加到最终浓度为160 mm的情况下，将交联反应淬灭，并如上所述收集并裂解细胞。然后，将2 mg澄清的蛋白提取物与10μg兔抗CCT3抗体（ProteIntech，10571-1-AP）或兔对照IgG（ProteIntech，30000-0-AP）作为模拟IP在4°C下为1 h，然后在4°C下添加50μl均衡的蛋白质G磁性Beade Beade Beadie ando Inctation and Incration in Incration in Incration and Incration hherersicific and hererersific and hererersific cons and iNcationic c。如上所述，使用SDS -PAGE洗涤，洗脱并评估样品。

　　IP效率的百分比是通过使蛋白质印迹的测量强度和已加载样品的各自稀释因子的标准化（输入样本为1％，IP样本为5％）计算得出的，然后是IP/输入。对于定量，平均值±S.D.values were as follows: PDCD5–flag (42.70 ± 16.16), CCT1 (86.66 ± 41.01), CCT2 (45.54 ± 15.25), CCT3 (45.57 ± 12.47), CCT4 (61.12 ± 15.08), CCT5 (98.98 ± 27.74), CCT6（53.74±21.34），CCT7（65.99±38.51），CCT8（135.49±64.48）和GAPDH（0.03±0.06），n代表生物独立的实验数量（n = 4）。为了定量PDCD5突变实验，平均值±S.D.值如下：WT（100±0），RKK（133.65±59.63）和IL（11.04±9.68），n代表生物独立实验的数量（n = 4）。

　　为了诱导二合一期间的三分线闭合，将与Tric – PDCD5 – Flag结合的珠（从二线，见上文）在ATP/AlFX缓冲液中孵育（裂解缓冲液（裂解缓冲液）在37°C的37°C下，在37°C下用37°C的37°C，用三个瓦斯（Alfx）添加了1 h（no3）3，30 mm naf和1 mm ATP）。作为对照，将与Tric – PDCD5-Flag结合的珠子（来自co-IP，见上文）被孵育并在没有ATP/ALFX的裂解缓冲液中洗涤。对于Western印迹，ATP/ALFX孵育后的1％的输入，释放蛋白的25％和25％的洗脱酸（表示为珠子）被加载。

　　在陷入冻结之前，如果不在三分准样品中添加ATP，则根据单粒子分析13,14,19，约有100％的三分线颗粒处于开放构象。在陷入冻结之前，在三液溶液中的额外ATP/ALFX闭合，尽管不同的论文在不同条件下与ATP/ALFX显示出不同的闭合/开放率。闭合/开放率：〜1.7，缓冲液（1毫米ATP，5 mm MGCL2，5 mm Al（NO3）3和30 mm NAF）。13;〜5.1在缓冲液中（1毫米ATP，1 mm AL3（NO3）3，6 mm NAF，10 mm mgcl2 50 mm KCl），参考文献。21;〜0.6在缓冲液中，带有参考文献的ATP-ALFX。14;〜2.2在缓冲液中（1毫米ATP，5 mm MGCL2和ALFX（5 mm Al（NO3）3和30 mm NAF），参考文献16。在我们的实验环境中（图7扩展数据），我们使用了参考资料13（1 mm ATP ATP，5 mm MGCL2，5 mm MGCL2，5 mm Al（5 mm Al（No3）3和30 mm naf）的条件。

　　对于扩展数据中的定量图7，平均值±S.D.值如下：PDCD5（ATP/ALFX）（0.09±0.05）；PDCD5（对照）（0.10±0.04）;CCT1（ATP/ALFX）（1.53±0.51）;和CCT1（对照）（0.38±0.06）;N表示生物独立实验的数量（n = 4）。

　　WT（ABCAM，AB255449）和PDCD5-KNOCKOUT HEK293T细胞（ABCAM，AB266229）用于心脏震动测定，并在DMEM（Sigma-Aldrich）中培养，在37°C的DMEM（Sigma-Aldrich）中，在37°°C的DMEM（Sigma-Aldrich）中培养。该实验是如前所述进行的49,50。简而言之，收集细胞并重悬于PBS中。制备五个等分试样并分布到PCR管中，每个管子中的每个管子中都有5×105细胞。在各种温度下（37.0、44.1、49.9、55.5和62.0°C；或56.8、58.3、59.5、60.7和62.1°C）在各种温度下孵育3分钟。然后将细胞在含有1.5 mM MGCL2、0.8％NP-40、0.4UμL-1苯并酶和蛋白酶抑制剂的缓冲液中裂解40分钟。去除蛋白质聚集，并将可溶性部分用于蛋白质印迹。为了定量热蛋白分析的蛋白质印迹，平均值±S.D.WT细胞在37.0°C至62.0°C下的肌动蛋白值如下：100.0±0.0，85.3±5.2，73.8±7.7，46.3±2.9和26.3±9.4；平均值±S.D.pDCD5-敲除细胞在37.0°C至62.0°C下的肌动蛋白值如下：100.0±0.0，100.3±7.0，109.0±9.7，83.0±2.0和57.6±9.4;平均值±S.D.在56.8°C至62.1°C下，WT细胞中微管蛋白的值如下：100.0±0.0、78.2±4.2、49.3±5.5、20.0±4.9和5.4±3.8；和平均值±S.D.PDCD5敲除细胞在56.8°C至62.1°C下的微管蛋白的值如下：138.0±22.3，99.7±6.4，63.9±15.9，34.8±0.4和8.3±4.7。

　　将来自蛋白质印迹的膜与一抗（小鼠抗Flag M2（Sigma-Aldrich，F1804，1：2,000），兔抗PDCD5（ABCAM，ABCAM，AB126213，1：1,000），RABBIT ANBI-CCT1（ABCCAM，AB240903，1：1：1：10,000），RABBIT ANBCAM，1：1,000,0003，10,000，RAB126213，1,000）孵育AB92746，1：10,000），兔抗CCT3（ProteIntech，10571-1-AP，1：30,000），兔抗CCT4（ProteIntech，21524-1-AP，1：5,000，1：5,000），兔抗CCT5（ProteIntech，ProteIntech，11603-1-ap，1：3,000），1：3,000），RABBIT ANTI-CCT6（INTERITITICT6）（INTERITITICT6）（INTERITICT6）（INTERITICT6（INTERITICT6）（INTERITICT6）（INTERITICT6）（INTERICT 6（INTERITICT），;1:1,000), rabbit anti-CCT7 (Abcam, ab240566, 1:30,000), rabbit anti-CCT8 (Proteintech, 12263-1-AP, 1:2,000), rabbit anti-GAPDH (Proteintech, 10494-1-AP, 1:15,000), mouse anti-actin (Invitrogen, AM4302, 1:3,000), mouse anti-tubulin（Sigma-Aldrich，T5168，1：3,000）），然后与HRP偶联的二级抗体（抗兔IgG（细胞信号，7074，1：10,000）孵育，抗小鼠IgG + IgM（Jackson Immunoresearch，1155--035-035-044，1：10,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000）。提供无编工的蛋白质印迹作为源数据。

　　基本上如前所述进行了冷冻-ET样品制备，数据收集和断层图重建。简而言之，将R2/2的带有200粒（量子）的金网格发光90 s，并将其放置在3.5 cm的细胞培养皿中（Mattek）。然后，将2 mL HEK FLP-IN T-REX 293细胞悬浮液（每毫升浓度为175,000个细胞）添加到盘中。对于未经处理的样品，在散冰过程中培养细胞5小时。对于HHT处理的样品，将细胞在无HHT的情况下培养3小时，然后以100 µM的最终浓度暴露于HHT（Santa Cruz Biotechnology），持续2小时，然后再进行突击冻结过程。使用Leica EM GP2柱塞在70％的湿度和37°C下，将网格从背面印迹6 s。将网格迅速浸入液态乙烷中，并存储在液氮中。使用Aquilos Fib-Sem（Thermo Fisher Scientific）使用fib-moild网格。使用气体注入系统用有机金属保护性铂层溅射样品15 s。通过同进铣削工艺进行薄片制备，镀至0.5 na的镀膜离子束电流降低到30 pa。

　　数据采集​​区域集中在细胞内的细胞质区域。Tilt series were acquired on a Titan Krios G4 (Thermo Fisher Scientific) operated at 300 kV, and equipped with Selectris X imaging filter and Falcon 4 direct electron detector, at 4,000 × 4,000 pixel dimensions, pixel size of 1.188 Å, a total dose of 120 to 150 e Å−2 per tilt series, 2° tilt increment, tilt range of −60° to使用Serialem Software51，60°和目标散热器为-1.5至-4.5 µm。使用IMOD软件包52自动对倾斜系列进行对齐。由IMOD生成的对齐文件用于Warp53 v.1.0.9中的断层图重建。

　　模板匹配的进行类似于以前的研究22,54。对于这项工作，将参数设置为如下：5°角扫描步骤，低通滤波半径= 20，高通滤波器半径= 1，apply_laplacian = 0，noinger_corelation = 1和calc_ctf = 1。从电子显微镜数据库（EMDB）下载的TRIC的Cryo-Em地图（EMD-32822）14用作球形掩码覆盖的模板。上面优化的设置产生了在Napari55中可视化的区分峰（扩展数据图1B和补充视频1）。为了分析数据集中的所有潜在三合一复合物，我们每个断层图提取了前1,000个峰。选择基于模板匹配中受约束的互相关（CCC）值，随后将这些选择的坐标提取为经纱中的小图。总共提取了360,000个未经处理和352,000个处理的亚图表。3D分类（类= 4，t = 0.5，迭代= 30，没有掩码），并在Relion56 v.3.1中进行了改进（C1对称性）。在未经处理的数据集中，总共有3,353个开放式Tric颗粒和4,054个封闭的Tric颗粒，并且在处理过的数据集中总共有3,785和3,418。将来自未处理和处理的数据集的开放三粒粒子组合在一起，并精制以改善地图分辨率。从未经处理和处理的数据集中合并了封闭的三分线颗粒，并用C1或D8对称性进行了完善。肌动蛋白丝是用十个断层图手动挑选的。总共提取了1,490个亚图表并在BIN4处进行了完善。从PDB（7x3J，7nvn，7nvo，7nvl，7nvl，7nvm和8f8p）获得的原子模型13,16,57被安装在我们的地图中。Chimerax58,59用于可视化EM地图和模型。

　　对于未经处理的数据集中的3,353个开放的三粒颗粒，对一个环的潜在PFD区域（类= 3，t = 3，t = 3，t = 3，T = 3，迭代= 50，C1对称性）进行了分类（表示为ring1）（表示2A），该（扩展的数据2A），该数据与2,874粒子无需PFD和479粒子，该颗粒生成了2,874个颗粒。独立地，用聚焦于另一个环（表示的RING2）的掩模进行了相同的分类，该掩膜产生了2,791个没有PFD的颗粒和562个带有RING2的PFD的颗粒。总共有2,395个没有PFD的颗粒，通过基于上述两种分类对粒子进行排序，确定了具有1个PFD的875个颗粒和83个具有2个PFD的颗粒。将相同的分类策略应用于处理的数据集中的3,785个开放式三颗粒，导致2,334个没有PFD的颗粒，1,287个颗粒，其中1 pfd和164个颗粒和2 pfd。使用PFD将原子模型（PDB：7WU7）14拟合到地图中。为了解决三腔室中的密度，评估了不同的分类参数，但这并没有导致有意义的见解。三腔内部的密度被高斯过滤（SDEV = 2或4），以在图1和图2中可视化。1B和4D和扩展数据图。3和10。对于封闭的TRIC，3D分类（类= 4，T = 3，迭代= 35，C1对称性）在Relion 3.1中独立于未处理和处理的数据集中进行，揭示了几个类别在封闭Tric室内占据不同的类别。以掩模为底物位置的进一步分类不会产生有意义的结果（补充图4和5）。在Relion 3.1中计算傅立叶壳相关（FSC）。

　　使用AlphaFold-Multimer31（V.2.2.0）预测了与人CCT3，CCT1和CCT4复合物中人类PDCD5的结构。使用默认设置和琥珀色放松执行预测，为每个预测生成15个模型。PDCD5与其他CCT组合使用相同的预测设置。PDCD5的全长氨基酸序列（Uniprot：O14737）60和CCT1-CCT8的赤道结构域（序列与PDB 7NVO相同）用于上述预测。从Alphafold蛋白结构数据库中下载了PDCD5（AF-O14737-F1）的单体模型。

　　CCT1 – CCT8的序列比对（UNIPROT：P17987，P78371，P49368，P50991，P48643，P40227，Q99832和P50990）的序列比对。PDCD5（Uniprot：M。Maripaludis，A9A8D7; S. Pombe，O13929; C. C. Elegrans，Q93408; Mouse，p56812; Bovine，Q2HJH9;和Human，O14737）和CCT1（uniprot1：H。plombei o o1：o14441561561561561561561561561561565615656156156565615656561565656556号;秀丽隐杆线，P41988，P11983; Q32L40;使用Consurf Server63计算PDCD5的序列保护分数。

　　与以前的研究一样，进行TRIC的距离和角度检查类似于22,64,65。对于三分线群集跟踪，使用亚图平均确定的三分线的坐标用于将颗粒定位在断层图中。Tric簇（包含≥2个三分线粒子）是由一个三分线的坐标与其最近邻居的坐标之间的距离定义的，该距离使用20 nm的距离切开（中心到中心距离）。由于坐标表示结构的中心，因此颗粒的旋转不会影响距离测量。只要它落在允许的距离阈值之内，就将最接近先前粒子的粒子作为欧几里得距离的距离。研究了各种距离阈值，范围从15 nm（两个三分线之间的最小中心距离）到40 nm（图4B，C）。对于每个特定距离，将阈值限制在±0.5 nm的范围内（例如，对于17 nm，允许距离的范围为16.5 nm至17.5 nm）。在这项研究中，使用20 nm的距离阈值定义三分线是否属于同一群集。

　　对于扩展数据中的Tric对分析的距离图9H，I，数量和平均值±S.D.值为N2（群集长度= 2）= 326（17.35±1.18）;N3 = 218（17.44±1.27），N4 = 74（17.01±1.17），N5 = 35（17.05±1.16），N6 = 16 = 16（16.87±1.01）和N7 = 4（分别为17.33±0.89），分别在未处理的数据中。数量和平均值±S.D.为N2 = 195（17.04±1.28），N3 = 116（17.42±1.18），N4 = 27（16.87±0.96），N5 = 7（分别为17.09±1.25）和N6 = 4（分别为16.65±1.88），在治疗的数据集中。分析了具有15至20 nm之间距离的三分线对。

　　研究了未经处理的数据集中的簇中的粒子，研究了Tric与其最接近的邻近Tric之间的角度（扩展数据图8D）。半球的划分区域包含所有表示圆锥旋转的点，该点由矢量的Euler Anglesθ和ψ描述（0，0，1）。这些旋转投射到北半球上（对于Z坐标大于0的旋转的向量），使用立体图投影（用小于或等于0的向量旋转的矢量）（对于旋转的向量）。北极对应于零旋转，表示矢量（0，0，1）。将邻居三体的旋转乘以各个邻居颗粒的反旋转。

　　用相邻的肌动蛋白丝计算三分线簇的百分比。将三分线和肌动蛋白丝的亚图平均图的颗粒映射回横向图进行分析。相邻距离的阈值（三合一中心到肌动蛋白二聚体的中心）设置为20 nm。

　　研究了核糖体出口隧道附近的Tric的空间分布。通过亚图平均确定的核糖体，60s和40s的坐标用于将颗粒定位在pogram 22中。将核糖体旋转到参考位置（零旋转）通过反旋转，这意味着它是通过（−ψ，−θ，−φ）核糖体旋转的。随后，Tric通过其各自的角（φ，θ，ψ）Tric进行了旋转，然后再进行另一个旋转（-mψ，−θ，−φ）核糖体的另一个旋转，因此在标准旋转框架内（核糖体的零旋转）内对齐核糖体 - 核，同时维持其原始的角膜关系。从核糖体出口隧道坐标（将其设置为零）和Tric坐标中减去核糖出口隧道的坐标。通过（−ψ，−θ，−φ）核糖体旋转新的三分线坐标，以说明其相对于核糖体零旋转的定位。为了进行核糖体和三分线的空间分析，核糖体颗粒比三颗粒更丰富。结果，同一三核可以是几个核糖体的最近邻居。我们的分析集中在充当Tric最近邻居的核糖体上。平均值±S.D.在扩展数据中，图9c，k如下：核糖体ETS中未经处理的开放式Tric（55.1±0.8％）；在ETS中未经处理的封闭式TRIC（55.3±0.3％）；在非ITS中未经处理的开放式Tric（44.9±0.8％）；非ITS中未经处理的封闭Tric（44.7±0.3％）；在ETS中处理了开放式Tric（50.4±0.4％）；在ETS中处理过的封闭式TRIC（49.7±1.0％）；在非ITS中处理的开放式三粒（49.6±0.4％）；并在非ETS中处理过的闭合Tric（50.3±1.0％）。使用GraphPad Prism（V.10，GraphPad软件）进行数据绘图和统计分析。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。