士宁宁（Strychnine）是一种复杂的单苯乙烯吲哚生物碱 - 在1818年与Strychnos nux-Vomica（毒Nux-nux-nucs）5（毒Nux-nux-nux-nux-nux-nux）5分离出来，该种子在中国和南亚的传统医学中使用。目前，由于其神经毒性是由高亲和力结合到甘氨酸受体2,3的介导的，因此用作农药1。在隔离后约130年，士苯胺的结构在1946年被鲁滨逊独立阐明（参考文献6,7）和1947年的伍德沃德（参考文献8）。鲁滨逊指出，“对于它的分子大小，它是最复杂的物质9。几个世纪以来，斯特里宁通过其分离，结构阐明和合成在化学领域中发挥了重要作用（补充图1）。它的多环体启发了化学家开发新的合成转换和策略，并最终导致了自1954年第一个开创性合成以来的总合成4（参考文献10）。令人惊讶的是，植物如何创建这种复杂的结构仍然未知。在这里，我们报告了士苯胺，brucine和diaboline的生物合成途径。

　　1948年提出了士苯胺的部分生物合成假说（参考文献11），该假设通过对nux-vomica12,12,13,14,15中的放射性同位素标记的底物的喂养研究来证实。这些标记研究表明，与所有单苯乙吲哚生物碱一样，士宁宁10起源于色氨酸和焦烷基焦磷酸13。这些起始材料被转换为两个中央中间体，第一个Geissoschizine 1，然后通过一系列未知步骤将其转换为Wieland -Gumlich Aldehyde 6（参考文献14,15和图1；参见图2，请参见图2，以获取完整的生物合成假设）。Wieland – Gumlich Aldehyde 6已被提议通过掺入乙酸以形成哌啶酮部分，尽管乙酸盐掺入和环环化的机制仍然不清12,12,13（图1中的环G（请参见图1;补充图3），图3以获取碳和环）。随后的士宁宁10的羟基化和甲基化将产生Brucine 15（参考文献16和图1）。

　　为了鉴定士苯胺生物合成基因，我们选择了Strychnos属（家族：Loganiaceae）的两个成员，这是一个著名的Strychnine 10，S。Nux-Vomica17的著名生产商和一个非生产者Strychnos sp.18，以研究这种生物合成途径。Nux-Vomica链球菌的代谢分析揭示了几种脊柱生物碱的存在，包括士宁宁10，Isostrychnine 11，β-钙蛋白13和Brucine 15，所有这些都积累在根中（补充图4）。尽管在其根和茎中检测到了与生物合成相关的化合物strychnos生物碱8，但这些生物碱不存在，尽管与生物合成相关的化合物strychnos生物碱神经素8（补充图5）。我们从这两种植物中产生了组织特异性的RNA测序数据，以实现基因发现。

　　在多色磷酸和黄烷基焦磷酸的生物合成途径已在系统发育相关的植物Catharanthus roseus（家族：apocynaceae）中已完全阐明（请参见Roseus c. roseus和S. nux-nux-Vomica）。C. roseus会产生与Strychnine19无关的单二烯吲哚生物碱。在Geissoschizine 1途径中的每个生物合成基因的同源物都很容易在S. nux-Vomica转录组中鉴定出来，这表明Geissoschizine 1的生物合成途径在C. roseus和S. nux-Vomica中是保守的。这些基因在Nux-vomica根部优先表达（补充图7），与以前的喂养研究一致，该研究表明士宁宁10生物合成主要发生在根中12,13。根据三个标准选择了后续步骤的候选基因：（1）nux-vomica的根中高表达（每公斤转录本片段每百万映射读数（FPKM）≥20）；（2）与推定上游基因共表达；（3）可以用催化功能编码蛋白质的基因与我们假设的生物合成途径的化学逻辑一致（图2）。

　　地球素1向Wieland -Gumlich醛6转化的化学步骤尚不清楚。然而，鉴于Wieland -Gumlich Aldehyde 6与已知的早期生物碱中间的脱水二甲酸酯2（参考文献19和图3A）之间的结构相似性，化学逻辑表明Wieland -Gumlich Aldeyde 6可以通过脱氢丙酰氨基氨基甲基2形成估计型氧化二氧化氢化氧化物，并重新构造（脱氢化）。2）。如果该假设是正确的，则Nux-vomica应包含地球苷氧化酶的同源物，该同源物也已从玫瑰梭菌（CRGO）中分离出来。在体外，CRGO将吉山苷1转换为akuammicine 3，大概是通过脱氢丙酰氨基氨酸2的自发畸形化（参考文献19，图3A和补充图2）。使用CRGO作为针对Nux-Vomica S. nux-Vomica转录组的爆炸搜索确定了一个命中率（转录群集4032.29856; CYP71AY6）具有46％氨基酸酸性序列认同（补充图8），显示出具有相似的表达曲线，具有相似的表达曲线，具有上游生物合成基因候选者（图2A）。我们通过农杆菌tumefaciens介导的瞬态表达表达了该基因，然后渗透了地球苷1。叶片提取物的液相色谱 - 质谱分析揭示了脱氢丙酸酯，阿库米氨氨氨酸，阿库米氨酸3B和ext Ext Exted Data Data Data Data Data Data Data Data Data。图。因此，群集4032.29856被命名为SNVGO。

　　由于已知甲基酯的脱羧化可以由酯水解20触发，因此我们推测α/β水解酶20,21将水解脱氢丙酸酯2的酯部分2，因此导致脱甲辅助二羧化，从而在自发性畸变前抗akuammicine 3发生。这将导致形成Strychnos生物碱北氟尿尿酸盐4（图3A和补充图2）。根据使用SNVGO作为诱饵的共表达分析，我们最初选择了五个α/β水解酶（r≥0.95，皮尔逊相关系数）进行功能表征（图2B）。每个人都在本奈米亚河（N. benthamiana）和snvgo和吉叶森（Geissoschizine）1作为底物进行了测试。其中两个候选物（簇4032.2064和4032.2781）导致了Norfluorocurarine 4的产生，并大大降低了变形产物Akuammicine 3的水平（图3B和扩展数据图1）。因此，我们命名了这两个α/β水解酶Norfluorocurine合酶1和2（SNVNS1和SNVNS2）。SNVNS1和SNVNS2在蛋白质水平上具有74％的同一性，并在本泰米亚省瞬时表达系统中显示出相同的反应性。我们在所有随后的实验中均使用SNVNS1。

　　为了将Norfluocurarine 4转换为Wieland -Gumlich醛6，需要羟化酶和还原酶安装C18羟基并分别减少2,16双键（图3A）。最初考虑了共表达的五个细胞色素P450蛋白22和四个中链脱氢酶/还原酶/还原酶/还原酶/还原酶/还原酶（MDRS）23（r≥0.95）（图2B）（图2B）（图2B）最初被考虑，因为这两种蛋白质家族通常参与碱生物合成。由于羟基化和还原的顺序尚不清楚，因此采用了本尼亚氏菌24,25,26的组合瞬态表达实验。所有候选细胞色素P450蛋白和MDR的同时表达在本泰米亚叶叶叶叶和SNVGO和SNVNS1中的结合确实导致消耗Norfluorocurarine 4以及Wieland -Gumlich – Gumlich Aldeyde 6的产生（图3A）。在N. Benthamiana叶片中的一个细胞色素P450（群集4032.6332; CYP71A144）以及SNVGO，SNVNS1和GEISSOSCHIZINE 1以及N. BENTHAMIANA叶片中生产的羟基化产物18-OH Norfluorocurare 5与综合标准（图3B和图3B）共同浸入。在将一个候选MDR（群集4032.5004）添加到共透明实验中后，中等5被消耗，并观察到Wieland-Gumlich醛6的积累（图3B和扩展数据图3）。因此，我们命名了该细胞色素P450 Norfluorocurarine氧化酶（SNVNO）和MDR Wieland -Gumlich醛合酶（SNVWS）。值得注意的是，在植物和体外测定中，SNVW可以减少Norfluorocurine 4和18-OH Norfluorocurarine 5的2,16双键（图3A，扩展数据图3和补充图9）。SNVWS的立体选择性还原可能是通过在α面上通过质子化在4和5中的磁氨氨酸部分的互变异来引发的，然后在β脸上减少NADPH。随后的C18-OH和C16醛之间的自发环化， 可能由还原底物的构象柔韧性促进，在6中形成半叶片（补充图10）。体外稳态动力学表明，SNVW的催化效率高于4（kCAT/km = 0.297 min-1μm-1占5的催化效率，而为0.068 min-1μm-1的4分）（补充图11）。与18-OH Norfluocurarine 5停靠的SNVW模型表明，SNVW中的Thr95和Ser309可以在18-OH Norfluorocurarine 5中与C18羟基氢键融合，为Norfluorocurarine 4和18-horfluorarine norfluranar norfluranar norfluorarine提供了一个解释，为催化效应的差异提供了解释。没有包括SnVNO在内的细胞色素P450可以羟基羟基脱氧Wieland-Gumlich醛7，这表明反应的顺序首先是形成18-OH Norfluorocurarine 5的氧化，然后减少。

　　为了完成Wieland -Gumlich Aldehyde 6的士宁10的生物合成，必须安装一个新的含两个含两个碳原子的哌啶酮环（图1中的环G）。但是，该环构建的中间体或反应步骤尚不清楚。唯一的线索是额外的两碳单元（C22和C23）起源于[14C]乙酸12,13。为了促进这些神秘的晚期生物合成步骤的发现，我们比较了士苯胺产生和非生产的strychnos植物。代谢分析表明，非胰岛素生产者strychnos sp。中的主要生物碱。IS是Diaboline 8（补充图5），这种化合物最有可能源自Wieland-Gumlich醛6的N-乙酰化6（图3A）。因此，我们假设S. nux-vomica和strychnos sp。应该共享从地球素1到Wieland -Gumlich Aldehyde 6的相同生物合成途径（图2C）。实际上，对识别的非生产转录组的爆炸搜索SPGO（CYP71AY7，92％氨基酸对SNVGO的身份），SPNS1（92％氨基酸的SNSVNS1），SPNS2，SPNS2，SPNS2，SPNS2（88％氨基含量snvns2），SPNS2），SPID型amino-sinlo-sino-sino-sino-sino to to to to to to to to to to to to to to s spns1。SNVNO）和SPWS（对SNVWS的氨基酸身份93％）。To validate the function of these genes, we expressed them in two combinations (SpGo, SpNS1, SpNO and SpWS; and SpGo, SpNS2, SpNO and SpWS) in N. benthamiana leaves with co-infiltration of geissoschizine 1. Both combinations led to the formation of Wieland–Gumlich aldehyde 6 (Fig. 3b and Extended Data Fig. 4).Diaboline 8的生物合成的唯一剩余步骤是吲哚胺的乙酰化（图3A），在生物碱生物合成中通常会使用乙酰基-COA作为酰基donor27来催化BAHD酰基转移酶。四个BAHD酰基转移酶候选物与所有五个基因共表达（r> 0.6）（图2D）。一个候选者（SPAT）具有上游基因的瞬态表达，在本奈米亚氏菌中产生了Diaboline 8 （图3B和扩展数据图4）。

　　Nux-vomica S. nux-vomica包含SPAT的直系同源物（群集4032.2753; snVAT）（氨基酸与SPAT的85％含量认同），该直系同源物在根中高度表达，并且与先前鉴定的基因显示高表达相关（每个基因r≥0.99）（图2A，B）。然而，nux-vomica不产生毒素8，先前的喂养研究表明，毒死蛋白8不是士宁宁10的生物合成前体（参考文献14）。我们推测，Snvat和Spat可能具有不同的酶活性，并且确实同时表达了SNVAT和SNVGO，SNVNS1，SNVNS1，SNVNO，SNVNO，SNVNO，SNVWS和GEISSOSCHIZIZINE 1在N. Benthamiana中的1个导致了痕量的Diaboline 8。酰基转移酶主要具有丙二酰转移酶活性（图3B和扩展数据图5）。尽管这种酶在本坦乳杆菌中的表达仅导致了Wieland-Gumlich Aldehyde 6的部分消费，但我们假设转化率可能受到Benthamiana N. benthamiana叶片中丙二酰coa的低浓度限制。因此，我们与AAE13（拟南芥）一起表达了这些酶，这是一种胞质酶，可产生可用于胞质SNVAT28的丙酰coA（补充图12）。AAE13的添加和将莫龙共脱钠的共同渗入瞬态表达系统导致误导性产物的产生增长十倍（图3B和扩展数据图5）。在纯化过程中，该产物迅速分解，因此我们用三甲基二甲二甲烷将n. benthamiana叶片的粗甲醇提取物处理，以甲基化羧酸，然后用硼氢化钠还原醛。通过比较合成标准标准（补充图13）证实了衍生产物的确认，表明SNVAT产物是N-丙二酰Wieland-Gumlich醛9（图3A）。所以， 尽管SNVAT和SPAT具有85％的氨基酸身份，但它们具有不同的催化活性。系统发育分析表明，在乙酰转移酶进化酶进化酶中散布的SNVAT簇在进化上与规范的丙二酰转移酶进化酶不同（补充图14）。SNVAT和SPAT29的同源模型（补充图15）用于鉴定一个氨基酸（SNVAT（R424F）和SPAT（F421R）），该模型控制了乙酰基和丙二酰转移酶活性之间的选择性（补充图16和17）。这些模型表明，精氨酸残基是通过与丙二酰氧基-COA30,31的羧酸盐形成双齿盐桥（补充图18）来负责丙二酰-COA选择性的（补充图18），从而提供了直接的机械解释，从而提供了这两种工厂中生物碱积累的差异。值得注意的是，在生理pH值的体外测定中，17-O-酰化产物主要是主要的（补充图19），这可能是由于非细胞环境中蛋白质活性的变化，或者是Wieland-Gumlich Aldehyde substrate的开放和封闭形式的平衡和封闭形式的平衡。

　　值得注意的是，可以在产生误导的Wieland -gumlich醛9的n. benthamiana叶子的甲醇提取物中检测到痕量的士宁10和同苯胺11（图3B并扩展了数据图6）。在室温下储存时，这两个生物碱积聚，随着时间的流逝降低了9个（补充图22）。实际上，在渗透底物4周收获的N. benthamiana叶片中，9个中的大多数被转化为Strychnine 10和Isostrychnine 11。与重组SNVAT或Benthamiana粗蛋白提取物一起孵育9的孵育率没有加速9至10的转化（补充图23）。这些实验表明，将9转换为士宁宁10和同丁宁11的转化可能是在体外和生理条件下自发地发生的。或者，加热n。benthamiana在60°C下离开2小时，基本上加速了转化率（图3B和扩展数据图6）。我们认为，通过β-酮酸部分的脱羧形成9形成10和11，形成α，β-不饱和酰胺。随后由C18羟基添加的Oxa-Michael会产生士宁宁10。α，β-不饱和酰胺也可以互变异到β，γ-不饱和酰胺形成异丁氏蛋白11（补充图24）。

　　以前的放射性分析标记研究表明，可以通过温暖Nux-vomica Roots14,15的酸提取物来将结构未表征的生物合成中间体转化为士宁。该中间14,15的化学特性称为原丙宁（请参阅图2的补充图2，以前提出的结构）与9相似。因此，我们建议将质原蛋白的拟议结构修改为9。在这种饲料中，该饲料的水平高于9倍的Ne倍。使用14c- tryptophan14，这表明prestrychnine向Strychnine 10的转化是S. nux-vomica的缓慢过程。实际上，我们筛选了许多α/β水解酶21,32和聚酮化合物合成酶33，以及这两个家族的成员，这些家族已知会催化β-酮酸酸功能的脱羧化，我们还筛选了许多可以将prestrychnine转移到酸性环境的转运蛋白，这些转运蛋白可能会加速抗酸环境。However, none of these gene candidates accelerated the formation of strychnine 10 and isostrychnine 11. To establish whether conversion of prestrychnine to strychnine is a slow, non-enzymatic process in S. nux-vomica, we performed hydroponic feeding of deuterium-labelled Wieland–Gumlich aldehyde 6 to the roots of S. nux-vomica.3天后可以检测到标记的prestrychnine 9，但是仅在7天后才出现痕量的士苯胺10和Isostrychnine 11（扩展数据图7）。总的来说，这些数据与先前发表的实验14,15以及在异源表达系统中形成的速率一致。在nux-vomica中慢慢地将prestrychnine 9转化为士宁宁10的事实与非酶过程一致，尽管不能确定排除酶的酶涉及仅具有适度速率加速度的酶。

　　布鲁氨酸15是士苯胺10的二甲氧基化衍生物，也高度积累在nux-vomica的根中（图3A和补充图4）。为了鉴定羟化酶，选择了12个全长细胞色素P450蛋白，这些蛋白与SNVGO（Pearson's R> 0.7）具有相对较高的共表达相关性进行后续测试（补充表1）。当一种细胞色素P450（群集4032.17050; CYP82D367）在N. Benthamiana的存在下表达了10-OH STRYCHNINE 12的存在（Strychnine-10-10-10--羟化酶（SNV10H）（SNV10H）（SNV10H））（图3C和扩展数据图8）。Nux-vomica链球菌中的β-钙蛋白13的存在表明，两个甲氧基组是依次安装的（图3A），因此我们接下来鉴定了五个在Nux-Vomica的根中高度表达的五个甲基转移酶34（补充表2）。甲基转移酶之一（簇4032.16453; snvomt）用n. benthamiana中的SNV10H表达，导致形成了与合成β-钙蛋白13相对应的化合物（图3C和扩展数据图8）。None of the aforementioned 12 co-expressed cytochrome P450 proteins catalysed the hydroxylation of β-colubrine 13, but the high accumulation of the final product brucine 15 in roots led us to identify all 13 other cytochrome P450 proteins that were strongly expressed (FPKM ≥ 20) in roots (Supplementary Table 1).在这13种蛋白质中，我们最初以CYP71进化枝内的3个为目标（补充图25）。这些细胞色素P450蛋白之一（群集4032.16581; CYP71AH44，SNV11H） - 与Strychnine，SNV10H和SNVOMT结合结合使用，作为主要产品，以及痕量的Brucine 15作为主要产品，以及痕量的氢氧化产物11 evebrucine 14（图3C）。当我们将合成的β-钙蛋白13浸入烟叶中时，仅形成了仅表达S​​NV11H的烟叶。Brucine 15仅在SNVOMT存在下形成（扩展数据图9）。体外和植物测定法表明，SNVOMT也可以甲基甲基甲酸16至α-甲氨酸17（补充图26）和10-二甲状腺素18至brucine 15（补充图27），尽管效率较低。总体而言，这些结果强调了使用合成生物学方法生产Strychnos型生物碱的希望，尽管需要对异源宿主生产系统进行实质性优化。

　　然后，我们从Geissoschizine的N. Benthamiana中重新安排了Brucine 15的途径。我们从Geissoschizine 1中重新定位了所有酶（SNVGO，SNVNS1，SNVNS1，SNVNO，SNVNO，SNVWS和SNVAT，AAE13，SNV10H，SNV10H，SNVOMT和SNVOMT和SNVOMT和SNVOMT），并遵循TOBACCO roftter ofbacco ofbaccco ofbaccco ofbaccco s in tobacco，丙二酸酯。如果在渗透底物后1周收获烟草，则观察到士宁宁10，异氨酸11，β-钙蛋白13和br素15的积累（图3D和补充图28）。此外，在Nux-vomica的根部可以检测到途径中的所有中间体（图3A和扩展数据图10），这表明Benthamiana N. Benthamiana中的异源重构途径与Strychnos植物中的物理学相关途径匹配。

　　在这里，我们使用化学逻辑，-omics数据集和酶促表征的组合报告了九种酶的发现，这些酶的发现，将岩石丝素1转换为Diaboline 1，Strychnine 10和Brucine 11。士宁宁的结构和合成的开创性研究为发现士苯胺生物合成酶的发现提供了基础。这些发现不仅阐明了植物如何生产这些多样的生物碱，而且还为遗传基础提供了异源生产Strychnos生物碱衍生物，以通过代谢工程方法发现有效的铅化合物，从而为合成生物学提供了新的挑战。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。