NUP96 :: NEON-AID DLD-1细胞23在标准组织培养条件下（37°C，5％CO2）使用DMEM培养基补充了4.5 g L-1葡萄糖和4.5 g L-1丙酮酸钠（corning），10％FBS（Gemini bio）（Gemini Bio）和2 mm Glutamax（Glutamax（Gibco））。接下来，将细胞在新鲜发光的碳涂层EM金网格（200元，R1.2/1.3或R2/1; Quantifoil Micro Tools）上培养18-24小时。对于NUP96耗竭，将250毫米的生长素（3-乙酸，Sigma-Aldrich）溶液添加到细胞中，以最终浓度为1 mm，然后在37°C下孵育4-8小时，然后再进行冻结。HELA来源（TOR1A/TOR1B/TOR3A-KNOCKOUT）细胞43在相同的条件下培养，但从未接受生长素治疗。

　　为了制备薄片，我们使用类似的方法使用了类似的方法，它同时使用了Aquilos Fib-Sem系统（Thermo Fisher Scientific）和一个具有冷冻阶段（Leica）的Crossbeam 540（Zeiss）（Zeiss）。在Aquilos系统上，将网格加载到样品室中，并用初始铂层（15 s）溅射，然后使用气体注入系统（GIS，15 s）进行第二个有机金属保护层。将样品倾斜至15°角，并通过将30 kV的凝胶束在平行的矩形图案上聚焦在30 kV的平行矩形图案上，以上和下倾斜到所需的厚度，以下是以下的厚度：（1）15°，15°，500 pa，gap = 3 µm;（2）16°，300 pa，间隙= 2.2 µm;（3）14°，300 pa，间隙= 1.5 µm;（4）15.5°，100 pa，间隙= 0.8 µm;（5）14.5°，100 PA，间隙= 0.5 µm;（6）15°，50 pa，间隙= 300 nm;（7）15°，30 pa，间隙= 150 nm。薄片的初始宽度设置为13 µm，但在每次降低电流下，我们的宽度降低了0.25 µm，最终宽度为11-12 µm。膨胀/浮雕接头以降低Lamella处的张力，在步骤1的距离板的侧面3 µm，宽1 µm宽。在Crossbeam 540 Fib-Sem上使用了类似的程序。首先将网格用2 nm的铂量在ACE 900系统（Leica）中涂覆，然后将带有VCT 500（Leica）真空传输系统加载到交叉样品室中，以进行有机金属铂涂层。仅使用四个逐步电流进行FIB消融，而无需过度倾斜，如下所示：（1）700 PA，GAP = 3 µm；（2）300 pa，间隙= 1 µm;（3）100 PA，差距= 400 nm;（4）50 PA，差距= 150 nm。总共，我们从未经陶服处理的NUP96 :: NEON-AID DLD-1细胞中制备了37个薄片，并从生长素处理的细胞中制备了115个薄片，以获取我们的数据。

　　在配备有生物化后柱状能过滤器和Gatan K3 Direct Electron检测器的300 KEV操作的Titan Krios G3I上获得了冷冻数据集。倾斜系列以×26,000的放大倍率获取，使用Tomo V.5.3.0（Thermo Fisher Scientific）在样品水平的像素大小为3.4Å。我们使用的是-52°至 +68°的倾斜范围，从 +8°开始，双向方案45，总剂量约为每个Angstrom平方的145个电子。倾斜系列HeLa细胞（TOR1A/TOR1B/TOR3A-KNOCKOUT）43获取，每个Angstrom平方的累积剂量约为120个电子。通过整个数据采集过程，散焦值在-5.0 µm至-2.5 µm之间变化。包括代表性的断层图（补充视频1和2）。

　　使用IMOD软件包46中的补丁跟踪将倾斜系列与4×BINNED投影对齐。如果有的话，FIB工艺产生的污染物用作基准标记。如前所述确定并校正对比传递函数（CTF）26，并在此处汇总。平均散焦是通过每个倾斜系列的基于带状的周期图平均估计的。使用平均散焦，倾斜角和轴向取向，确定每个投影的散端梯度。然后，使用defocus梯度进行CTF校正，然后通过对每个投影图像进行相位铺面进行校正。接下来使用IMOD MTFFILTER函数进行剂量过滤的下一个剂量过滤46。使用IMOD手动选择NPC坐标。在NPC粒子拾取过程中，确定NPC与NE的相对取向进行预先定位NPC。接下来，使用IMOD重建了NPC的小图。详细的成像参数总结在扩展数据表1中。

　　对于野生型DLD-1结构，使用迭代缺失的WEDDEDGEGEGENGEGEGENTION加权的子图表对齐和与TOM Toolbox（TOM_CORR3D）47的迭代缺失的wedge加权子图对齐和平均。每次迭代后，将半程平均值合并，并用作下一次迭代的模板。首先，使用8×BINNED子Volumes对齐全NPC并施加8倍对称性。使用4×BINNED子Volumes重复此步骤。随后，这些比对根据先前所述的八倍对称性来提取每个NPC的八个不对称单元（1,552个原始物）。将两次二键的完整原始物对齐，并通过在单个环（CR，IR和NR）上施加口罩来进一步完善。接下来，根据先前的对齐步骤提取子启动器。在此阶段，将单个原始人手动检查并缺少来自不完整的NPC，未对准的原始物体和较低信噪比的毒剂。在此步骤之后，随后的步骤保留了1,252个原型。新提取的子蛋白酶进一步对齐。使用0.5标准和软面膜测量分辨率，以使用电子显微镜数据库（EMDB）验证服务器（https://wwwwwwwwwww.ebi.ac.ac.uk/pdbe/pdbe/emdb/emdb/emdb/emdb/validation/fsc/）来排除对测量分辨率的人为贡献。使用RISION49与B因子与-2,000Å2的B因素锐化了子启动量。最终的完整NPC模型是通过使用UCSF Chimera50将子启动量拟合到完整NPC平均值中生成的。

　　类似地执行了由生长素处理的（NUP96消耗）数据的平均数据。首先，使用8×BINNED子启动器对齐163个完整的NPC并施加8倍对称性。接下来，通过手动检查子Volumes分为包含CR，IR和NR（27 NPC），IR和NR（53 NPC）或IR仅IR（83 NPC）的三个类，将NPC分类。使用8倍的NPC水平使用8倍对称性的对称性，将这三个类进一步对齐。

　　对于HELA（TOR1A/TOR1B/TOR3A-KNOCKOUT）的平均值，将27个NPC对准与野生型数据集相似，但没有堆栈的剂量过滤。额定物提取后，排除了36个原始物，并对齐量子。最终的地图（180个原始物体）是通过使用嵌合体将frotomer平均值放回完整的NPC地图中来生成的。

　　为了为CR和NR中的Y络合物创建模型，我们使用先前报道的人类NPC结构衍生出的结构模型进行了公正的全局拟合。9,15。对于这些复合物，我们从先前报道的模型开始，并进行了UCSF Chimera50中实施的全局拟合分析。使用三个蛋白酶分段模型对CR和NR进行拟合，因为我们的单个原始物质不一定包含八倍对称NPC的完整原始人（也就是说，单个原始物可能包含来自邻近原始物体的Y复合物的一半）。对于IR，使用单个杂种，因为它包含整个复合物。使用Chimera和1,000,000个随机初始放置以及局部互相关（Chimera在平均值（CAM）上的相关性（CAM+OVR）的组合时，使用局部交叉相关（当局部交叉相关时）使用统计学意义（如其他人所经过的）20。我们使用每个模型的两个指标计算了拟合得分，但是对于IR而言，局部互相关（CAM）为我们的模型提供了统计学意义，而对于Y复合物，组合度量（CAM+OVR）提供了统计学意义。我们注意到每个评分度量标准的分数和调整后的P值（如下所述）。对于每次拟合运行，将统计显着性评估为从归一化拟合分数计算得出的P值。为了计算P值，我们将CAM或组合的CAM+OVR分数转换为Z分数，得出了每个拟合的双面P值，然后使用保守的Benjamini-Hochberg程序纠正了多次测试的P值。使用运行scipy.stats（用于p值和z得分分析）51的python脚本进行此工作流程51，STATSMODELS模块（用于Benjamini – Hochberg分析）52和Matplotlib（图块）53。

　　对于IR复合物，我们确定了在最新人类结构（蛋白质数据库（PDB）：5IJN）9中所述的预期位置的显着拟合，尽管很明显，该模型中的某些NUP可以转移以更好地拟合我们的密度图。因此，我们遵循了先前描述的方法20，并通过对单个亚基或域的局部改装进行了优化的拟合。为了进行这种改进，我们使用嵌合体中的选项使用以25Å分辨率模拟原子模拟的地图，并优化了拟合以进行相关。使用这种方法，我们拟合由链条F，G，H，X，Y和Z制成的子复合物（Nup54，Nup58和NUP62的两份副本），L，M，M，N，R，S和T（NUP54，NUP58和NUP62的另外两个副本），NUP205的副本（NUP205的副本）和u）。为了拟合NUP155链，我们从确定的NPC映射中以上面的拟合模型的半径为10Å减去密度。在此差异图中，我们使用上述过程（链E，Q，K，W）将单个NUP155副本拟合到图中。5IJN的NUP155链A和B不能可靠地适合我们的地图。接下来，我们使用此模型作为完整性的输入进行了新的无偏全局搜索。

　　对于Y络合物，我们使用双Y复合物作为参考分子确定了与最新的人NPC结构CR和NR（PDB：5A9Q）15相同的位置的显着拟合。由于5A9Q模型包含Y复合物的异位核心元素中的差距，称为“轮毂”（NUP160，NUP85，NUP96和SEC13），我们决定用我们创建的新复合模型的HUB替换5A9Q模型的HUB，使用公开的水晶结构和螺纹模型创建。我们首先生成了一个酿酒酵母复合模型，该模型结合了Y复合枢纽的先前结构（NUP120 – NUP145N – SEC13 – NUP85）14（PDB：4XMM）和NUP84 – NUP133 Subplex24（PDB：PDB：6X02）。然后，使用已发表的结构和螺纹模型，将这种酿酒酵母Y复合物复合材料用于模板。然后使用该更新模型的枢纽将刚性码头固定到我们地图的cr/nr中，与5A9Q集线器所占用的位置相同，NUP107 – NUP133子复合物从5A9Q保持原样，创建了一个新的完整的Y-Complex组件。通过将残基933和934（参考文献11）之间的NUP160和NUP160（NUP160-N）与NUP37一起拟合的N末端部分，将NUP160与NUP37一起拟合，从而进一步完善了拟合。NUP160的C末端部分作为集线器的一部分。然后将CR模型放置在内部Y环，而没有进一步修改。对NR Y复合物的拟合也类似。对于外部Y环，仅将轮毂和NUP107 – NUP133子复合物分开并拟合为单个刚体。对于NR Y复合物的IR，没有NUP160-N和NUP37的模型拟合到地图中。为了拟合NUP160-N-NUP37子复合物，我们从地图中减去了先前拟合模型的密度，并将子复合物拟合到其余密度中。在CR和NR中创建了Y复合物的最终模型之后， 我们进行了另一轮无偏的全局拟合，并确定了一个相似的位置，在该位置，5A9Q的Y配合物被停靠。最终的本地优化运行最大化密度重叠。我们强烈敦促在原子分辨率上没有解释最终拟合。取而代之的是，我们的拟合只是有助于分配我们的密度，以了解每个子复合物的定位方式。

　　上述的IR模型手动放置在由生长素处理（NUP96耗尽）细胞产生的亚图映射的IR原子图中心。

　　使用UCSF Chimera50进行可视化。在IMOD46中，将DLD-1细胞的代表性断层图重建在8倍的，12×SIRT样过滤的断层图中。在IMOD切片机中手动对齐NPC后，记录了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）NPC的快照。使用TOM_VOLXYZ拍摄了全NPC平均值，野生型地图和生长素地图的正斜线视图。脚本是在MATLAB（MATHWORKS）和TOM_Toolbox54中实现的。

　　局部分辨率分析是作为先前报道的26进行的，但此处也总结了。为了计算子启发剂的局部分辨率，将完整的子启动体积（100×100×100素体）分为较小的子Volumes（盒子大小，40×40×40），沿4×4×4的常规间距。使用0.5 thersheslion的两个半杂质之间测量分辨率的分辨率。在FSC计算之前，用球形遮罩掩盖了亚体积。使用Chimera的表面颜色函数对测量值之间的数据点进行了插值和可视化。

　　对于直径测量，使用孔隙膜水平的正固体测量单个NPC。对于DLD1和HELA数据集，使用了将在本研究中进行全NPC平均的对齐NPC。对于MEF DataSets29，在IMOD切片机中手动对齐NPC并测量。在每个NPC的最窄点之间测量NE之间的距离。在可能的情况下，在两个正交方向上进行测量，并计算平均值。否则，每个NPC仅进行一次测量。当由于强烈的未对准或信噪比较差而无法进行测量时，未测量直径。使用Prism 9（GraphPad）创建了用于NPC直径分析的散点图。

　　代表性显微照片如图1a和扩展数据提供了图6a，f。图1A中的显微照片突出了直接在Cryo-Et中可视化的三环NPC架构，并从54个野生型DLD-1细胞中图的数据集中选择，所有这些构建都可重复显示三环体系结构。扩展数据中的显微照片图6a是从耗尽的DLD-1细胞数据集（71个断层图）中选择的，并且该图像是专门选择的，因为它突出了我们在本文中描述的单圈NPC。最后，专门选择了扩展数据中的显微照片图6F，以向读者提供轶事观察结果，即我们在数据集中仅确定了两次（在73个断层图中的2个），并且这些断层图被排除在随后的处理中（71个断层图用于子图的亚图）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。