所有涉及小鼠的程序均根据斯坦福大学IACUC和APLAC（第8661号议定书）和VA Palo Alto动物研究ACORP委员会（LUO1736）批准进行。对于衰老队列和运动队列，雄性C57BL/6JN小鼠是从国家老化研究所（NIA）老化啮齿动物菌落获得的。对于全身部分重编程队列，男性全身诱导OSKM（ioskm）小鼠（Rosa26（RTTA-M2）； Col1a1（Teto-Oskm））（在以下菌株的混合背景下：C57BL/6，B6D2F1，129S4和B6114和B61129sf1/ja ways and ja ways and ja ways and ja and ja ways and ja wase wase 0来自杰克逊实验室（JAX 011004）。在Chem-H/Neuro Vivarium（衰老和部分重编程）或退伍军人事务帕洛阿尔托阿尔托州医疗保健系统（锻炼）下，将小鼠组成的3-5只小鼠组成的3-5只小鼠，或者在12 h光周期下，在3周之前，在3周的湿度和大约50％的湿度中，在3周以前，在3周以前，在收集大约50％的湿度或对任何实验中进行了预测。

　　我们使用了两种独立的雄性C57BL/6JN小鼠（称为老化队列1和老化队列2）的独立老化队列。老化队列1包括冠状区数据集以下年龄的小鼠：3.8、5.4、9.8、12.9、15.5、21.4、21.4、23.5、26.7、30.9和33.2个月。老化队列1还包括矢状部分数据集以下年龄的小鼠：3.8和26.7个月。老化队列2包括冠状区数据集以下年龄的小鼠：3.4、4.3、6.6、15.8、18.8、19.8、19.8、24.6、28.5、32.6和34.5个月。老化队列2包括矢状部分数据集以下年龄的小鼠：6.6、8.6、19.8和23.5个月。补充表4中提供了有关老化队列中所有小鼠的信息。

　　运动实验包括3组雄性C57BL/6JN小鼠：4名年轻（3个月）久坐的小鼠，4名（19个月）久坐的小鼠和4只（19个月）运动小鼠。补充表4中提供了有关运动实验中所有小鼠的信息。选择样品量，以允许使用非参数的两侧Mann-Whitney U检验来测试小组统计上的统计学上显着差异（例如，细胞类型的比例）。窝窝是随机的，以进行运动和久坐的条件。向旧运动组的小鼠提供了在单个外壳中奔跑5周的自愿车轮，在聚碳酸酯笼中，直径为12.7厘米的跑步车轮（Lafayette仪器，80820），并每周进行监控以进行足够的跑步。自愿运动的五周持续时间是根据效力的已发表方案进行的32,81。久坐的小鼠单独地居住在相同的年龄，而无需跑步车轮。

　　全身部分重编程实验包括3组雄性IOSKM小鼠（在以下菌株的混合背景下：C57BL/6，B6D2F1、129S4和B6129SF1/J）：4年（4.8-4.9个月）对照小鼠，4岁（25.6-29.2个月）（25.6-29.2个月）对照（25.6-29.2个月）对照小鼠（25.6-29.2个月）。补充表4中提供了部分重编程实验中所有小鼠的信息。选择样品量，以允许使用非参数的Mann-Whitney U-Test进行统计学上的统计学上的统计学上显着差异（例如，细胞类型比例）。老鼠按年龄和体重匹配，然后随机分配到对照和OSKM条件。在实验过程中，所有小鼠（对照和OSKM）均分别容纳。The mice in the old OSKM group underwent three periods of cyclic induction of OSKM by doxycycline treatment, which consisted of doxycycline administration in the drinking water for two days (ON), followed by five days without doxycycline administration (OFF) and repeated for 3 weeks (ON–OFF–ON–OFF–ON) with mice euthanized at the end of the last doxycycline administration treatment.将强力霉素（Fisher ICN19895505）溶解在饮用水中（1 mg ml -1），放在琥珀色水瓶中，以保护溶液免受光线的影响，并在Olskm组的小鼠中为小鼠提供了易于余地。

　　将小鼠安乐死以收集新鲜的冷冻全脑样品进行Merfish实验。将小鼠在二氧化碳室内接触5分钟，将小鼠置于冰2中，并将大脑除去，并将其放在冰上的冷冻质量中，并充满预冰的最佳切割温度（OCT）化合物（Fisher Healthcare Tissue Plus，4585），然后将其放在干冰上。OCT固化后，将样品移至-80°C的长期存储。RNASEZAP（Invitrogen，AM9780）用于在每只小鼠之前和之后对所有解剖工具进行消毒。老化队列1的样本收集发生在2022年11月4日的14：00–15：30 PM太平洋标准时间（PST），而老化队列2的样本收集发生在2023年6月28日，从14：30-16：15 PST发生。样本收集在年轻小鼠和年龄较大的小鼠之间交替。在运动实验中，在样品收集之前，用肝素钠盐（50 U ml-1）（Sigma-Aldrich，H3149-50KU）灌注15 mL PBS的小鼠。运动实验的样本收集发生在2022年6月6日，部分重编程实验的样本收集发生在2023年6月28日。样品收集来自不同实验条件的小鼠之间的样本收集。

　　我们选择了300个基因进行Merfish实验。我们选定的300个基因面板由129个细胞类型和亚型标记（81个细胞类型标记物组成，范围从每种细胞类型的1到8个标记范围从1到8个标记； 48个亚型或功能相关的标记）以及181个兴趣基因，以及在与以前链接的重要过程中均与egse sneces snecte snecte snecte sneces segens相关的egse segess的含义，并在衰老中均与agiss的分析相关，并且鼠大脑衰老的地图酶，在细胞类型和亚型标记和感兴趣的基因上共有10个基因（补充表1）。

　　细胞类型和亚型标记基因包括Vizgen建议的面板中的所有标记。根据文献综述确定的标记，重点是脑血管细胞5,82,83，NSC和神经细胞3,5,84,85和免疫细胞3,5,86,87。对于这129个细胞类型或亚型标记，我们还包括了几个NSC和神经细胞标记物，这些标记是从成年小鼠亚室脑室区域的多个单细胞RNA-seq数据集中获得的综合差异基因表达分析获得的。We included markers for the following cell types: excitatory neurons, inhibitory neurons, medium spiny neurons, astrocytes, microglia, oligodendrocytes, OPCs, endothelial cells, pericytes, VSMCs, VLMCs, ependymal cells, neuroblasts, NSCs, macrophages, neutrophils, T cells, B cells, natural killer（NK）细胞，肥大细胞和树突状细胞。

　　对于与年龄相关的基因，我们包括了一组与从Genage Model有机体数据库中选择的鼠老化有关的33个基因（2022年9月7日访问）（补充表1），以丰富已知在衰老中具有因果作用的基因，这有助于建立更多的因果衰老时钟88,89。我们进一步包括了与T细胞活性3，室内NSC异质性的基因90，内皮异质性91，脑膜淋巴功能83,92,93，细胞衰老，免疫反应，干细胞，干细胞，Neuroeneness94和血管生成95。我们还包括了与有趣的细胞和生物体功能有关的一组专家策划的基因，其中一些基因在衰老的调节中具有出现的作用，但尚未进行精心研究，包括T细胞信号传导，重编程，细胞粘附和迁移，脂质代谢代谢和神经肽信号传导。最后，对于更公正的基因集，我们在三个单细胞转录组数据集3,4和两个多区域脑单细胞转录组数据集的三个单细胞转录组数据集中，在三个单细胞转录组数据集中包括了几个差异表达的基因（DEG），用于细胞类型5,7。

　　我们确保Merfish面板中的所有选定基因均在现有的单细胞或单核RNA-seq脑大脑4,5,7中表达，并满足技术约束，以最大程度地减少光云。这包括使用Vizgen基因面板设计门户限制总估计基因表达，至每千千次映射的读取（FPKM）（以7,691 fpkm为fpkm的总估计值）每千倍量的9,000个片段，并使用VIZGEN基因设计门户到700 fpkme estatimate at At 452 fpke estatimate at 4552 fpke estimations in to vizgen基因设计门户，限制了每个基因的最大估计表达。补充表1中包括完整的基因面板，标记分类和包含的基本原理。

　　Merfish实验是通过Vizgen Merscope技术实验室服务进行的。与其他空间分辨的单细胞转录组学相比，即使在较大的基因面板尺寸96的情况下，Vizgen Merscope技术也可提供高特异性和敏感性。将新鲜的冷冻小鼠脑样品切成10μmThick的截面，在-20°C下的低温恒温器上，并将其放在Merscope载玻片上（Vizgen 20400001）。我们获得了包含CTX，Str，CC/ACO和VEN的冠状切片，包括脑室中神经源性小裂。我们获得了包含上述大脑区域以及其他大脑区域的矢状切片（嗅球，颈迁移流，脑干和小脑）。将两个冠状切片放在每个载玻片上，并配对以平衡年龄，同时将矢状切片放在自己的幻灯片上。将组织切片与4％多聚甲醛在1×PBS中固定15分钟，用5 mL 1×PBS洗涤3次，并在4°C下与70％乙醇一起孵育过夜，过夜以进行透化。然后，使用细胞边界试剂盒（Vizgen，10400009）对样品进行染色，然后与定制设计的Merscope基因面板混合物在37°C启动器中杂交300个基因（Vizgen 20300008）36-48 h。Following incubation, the tissues were washed with 5 ml formamide wash buffer at 47 °C for 30 min, twice and embedded into a hydrogel using the Gel Embedding Premix (Vizgen 20300004), ammonium persulfate (Sigma, 09913-100 G) and TEMED (N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine) (Sigma,T7024-25ML）来自Merscope样品准备套件（10400012）。凝胶混合溶液固化后，用由50μl蛋白酶K（NEB，P8107S）和5 mL的清除溶液和37°C下的清除溶液（Vizgen 20300003）组成的清除溶液清除样品。除去清除溶液后，将样品用DAPI和Poly T试剂（Vizgen 20300021）染色15分钟， 用5 mL甲酰胺洗涤缓冲液洗涤10分钟，然后在Merscope系统（Vizgen 10000001）上成像。有关Merfish样本准备的完整详细的，分步的说明完整协议，请访问https://vizgen.com/resources/fresh-and-fresh-and-frozen-frozen-tissue-sample-preparation/。完整的仪器协议可从https://vizgen.com/resources/merscope-in​​strument/获得。Merfish数据是在两个单独的批次上收集的（请参阅补充表4中的“ slide_id”）。第一批，A包括老化队列1（冠状和矢状）和一半的运动实验样本，均匀地表示。第二批次B，包括老化队列2（冠状动脉和矢状），其余一半的运动实验样品以及部分重编程实验样本。

　　通过Vizgen的实验室服务，使用细胞（1.0.2）进行细胞分割。使用核染色（DAPI）和胞质染色（Poly T）在图像上实施细胞分割。使用这些细胞分割分配了转录本，通过跨七个Z堆栈进行概括，这是核和胞质（SOMA）转录物的解释。使用Vizgen后处理工具（VPT）（1.2.2）计算质量控制统计量（补充表2）。

　　为了进行预处理，我们针对每个Merfish实验分别进行了初始细胞过滤（由同一载玻片上的两个冠状切片或一个矢状部分组成）。对于每个实验，我们使用SCRUBLET97删除了推定的双线，双重分数截止值为0.18。然后，我们将分割体积小于或等于100μm3或大于或等于中位细胞体积的3倍的分割体积的所有细胞过滤。我们还滤除了所有少于或等于20个计数和/或少于或等于5个具有非零表达的基因的细胞。为了纠正潜在的不同分割尺寸，我们将Merfish数据集中每个单元格获得的原始转录计数除以相应分割的体积。将所有实验组合到一个集成的数据集中后，然后我们将所有最高2％和最低总表达中最高2％的细胞滤除了所有细胞。在补充表3中可以找到与上述细胞滤波步骤以及聚类后的其他步骤相关的统计数据。为了获得对数n量符号的基因表达值，我们将每个细胞的总基因表达归一化为250，并用添加的伪量将表达式转换为对数。该程序是针对老化队列（冠状），老化队列（矢状），运动实验和部分重编程实验的分别执行的。

　　为了进行聚类，我们使用scanpy.pp.scale将每个对数符号的基因表达值转换为z得分，而scanpy package98中的max_value = 10。我们使用scanpy.tl.leiden进行了Leiden聚类，否则对初始聚类和默认设置进行了分辨率= 0.5。我们使用BBKNN（scanpy.external.pp.bbknn）获得了批量平衡的最近邻居图，然后使用此邻居图生成所有单元格（scanpy.tl.umap）的UMAP可视化。对于仅涉及一批Merfish数据的部分重编程实验，我们使用了scanpy.pp.neighbors n_pcs = 20，而n_neighbors = 15而不是bbknn。要注释细胞类型，我们根据细胞类型的表达模式手动标记每个簇，如两种正交数据可视化模式（UMAP可视化和细胞类型标记的热图）所观察到的，以减少细胞类型注释中尺寸降低降低导致细胞类型注释的误差99,100 99,100。对于从多种细胞类型表达标记的簇，我们在这些簇上进行了连续的莱顿聚类，直到可以注释唯一的细胞类型（请参阅补充表5）。该程序是针对老化队列（冠状），老化队列（矢状），运动实验和部分重编程实验的分别执行的。可以在补充表5中找到对每个数据集和细胞类型的细胞类型标记和莱顿聚类分辨率的详细描述。尽管某些罕见的免疫细胞类型（NK细胞，肥大细胞，树突状细胞）的一小部分标记包括在我们的Merfish面板中包括在我们的MERFISH面板中（补充表1），但可能会在这些细胞面板中（补充表1）（补充）（补充）（补充）（补充）（补充）（补充）（补充）中的（补充）中的（供应），但在这些数据集中（补充）（补充表）（中）（丰富。NK细胞，肥大细胞和树突状细胞也未在几项现有的成年小鼠脑部空间转录组学研究中鉴定出17,21,22,23，24. NK细胞和树突状细胞在整个成年小鼠Brain25的大规模和高分辨率空间转录组中鉴定，尽管比我们数据集（T细胞和B细胞）中识别出的最稀有的免疫细胞类型低3-4倍，这可能解释了为什么我们无法在数据集合中识别这些细胞。此外，在部分重编程数据集中，我们无法鉴定其他罕见的免疫细胞类型（T细胞，B细胞和中性粒细胞），这与我们先前发表的分离的单细胞RNA-SEQ Datasets35一致，并且可能是由于这种部分重编程模型的这些细胞类型的较低丰度。

　　为了确定跨Merfish数据集的解剖区域，并将区域和子区域标签分配给每个细胞，我们改编了一种半监督的方法，用于从每个细胞周围局部邻域的细胞类型组成中聚类和注释区域标签。对于给定的细胞，我们计算了距给定细胞100μm距离内每个细胞的细胞类型丰度。然后，我们对每个细胞的细胞类型丰富度谱，应用K-均值聚类（k = 25），手动可视化和合并群集进行七个子区域注释（CC/ACO，CTX_L1/MEN，CTX_L2/3，CTX_L2/3，CTX_L4/ACB，ctx_l1/ctx_l4/ac，），我们对矩阵进行了主成分分析，并进行了k均值群集（k = 25），并获得了七个子区域注释（CC/ACO，CTX_L1/MEN）str_ls/ndb和ven），最后合并了子区域注释以获得四个区域注释（CC/ACO，CTX，STR和VEN）。虽然我们观察到样品之间的子区域注释有所变化，但四个区域注释的一般一致性。我们验证了CTX的三个子区域中皮质层标记的表达（扩展数据图3C，D），但是我们无法通过聚类过程分别注释六个已知的皮层层中的每个层，也许是由于皮质层标记数量较低。该区域和子区域聚类和注释程序是针对老化队列（冠状），老化队列（矢状），运动实验和部分重编程实验的分别进行的。

　　我们通过将每种细胞类型的细胞数量除以样品中的细胞总数来计算给定样品的细胞类型比例。对于区域细胞类型比例，我们将该区域中每个细胞类型的细胞数量除以该区域的总细胞总数。Pearson相关性的相关性为95％的置信区间，使用Scipy.stats.pearsonr计算细胞类型比例和样本年龄之间关联的P值。我们以年龄为单位类型的细胞类型比例的强烈变化，与95％置信区间的相关性不与间隔不重叠的相关性[-0.25，0.25]。随着年龄的年龄（彩色红色）的细胞类型比例的强劲增加具有95％的置信区间，其下限大于0.25，并且与年龄相关的细胞类型比例的强大降低为95％的置信区间，与上限小于-0.25的相关性相关性。使用SeaBorn.Regplot计算出95％置信区间样品年龄的细胞类型比例的线性回归。为了计算跨分类条件的细胞类型比例差异的统计显着性，我们使用了两侧Mann-Whitney U检验。

　　对于给定的细胞类型，为了确定随着年龄的增长而变化的表达的基因，我们计算了冠状段数据中样品中年龄和伪库尔克基因表达之间的长矛人相关性。伪库基因表达被计算为样品中同一细胞类型的所有细胞中所有细胞中的平均对数非差异基因表达。对于每个基因，我们获得了Spearman相关性，相关的P值以及相关性95％置信区间的上限和上限。如果Spearman相关性大于0.3，并且95％置信区间的下限大于0.0，我们将其归类为“增加”。如果它们具有小于-0.3的长矛人相关性，并且与95％置信区间的上限小于0.0，我们将其归类为“减少”。为了减少由于分割引起的转录溢出而导致的假阳性，我们将分析限制为基于内部Vizgen度量的220个基因，使用局部细胞组成影响的基因表达变化，估计的溢出率少于5％（有关基因列表，请参见补充表7）。

　　我们进行了GO富集分析，以确定在不同基因集中富集的生物学过程。对于随着年龄的增长而增加或减少表达的基因，这些基因在“随着年龄分析的增加和降低基因表达”中鉴定出来，我们对每组基因和每种细胞类型分别进行了GO生物过程富集分析。对于不同时空基因表达轨迹中的基因，用于CC/ACO区域中的少突胶质细胞的基因（请参阅“时空基因表达轨迹分析”），我们对使用更大的轨迹基于跨基因的跨基因中的每个基因进行了分别进行跨度估算的所有基因进行生物学过程富集分析。受局部细胞组成影响的变化。为了对空间老化时钟使用的基因进行富集分析，我们选择了阳性系数时钟基因（最多50个具有最大正系数的基因）和负系数的基因（最多50个具有最大阴性系数的基因），并分别对每组基因进行了生物学过程分析。For GO enrichment analysis on DEGs in endothelial cells in response to exercise in old mice, we selected genes that significantly increased with exercise (increased in old exercise compared with old sedentary with P < 0.05 from two-sided Mann–Whitney U-test) and genes that significantly decreased with exercise (decreased in old exercise compared with old sedentary with P < 0.05 from two-sided Mann–Whitney U-test) and performed GO biological process enrichment analysis分别适用于每组基因。

　　我们通过为每个分析（如上所述）选择基因以及使用Merfish测量的所有其他基因作为背景来进行GO生物过程富集分析。使用Fisher的所有生物过程项的精确测试，使用TopGo101（R包2.54.0版）进行GO富集。

　　为了通过基因表达的大小随着年龄的变化来比较不同的解剖区域和子区域，我们在数据中选择了五只最年轻和五只最古老的小鼠。对于每种细胞类型，我们确定了每个小鼠和区域中存在的最小细胞数量，由于其低细胞数量，不包括VEN。然后，我们将每个小鼠和区域的细胞降低，而无需替换，以至于最小数量，以便在采样后，小鼠和区域的所有组合都具有相同数量的细胞。然后，我们排除了每个小鼠和区域小于20个细胞数量的细胞类型。我们通过从该区域中该区域的所有小鼠的所有细胞的体积均衡表达进行平均，计算了每个小鼠和区域的转录曲线，并将其归一化为250，并以添加的假计数进行对数转换。为了确定特定区域中的老鼠和年轻小鼠之间的变化，我们从5个旧小鼠的平均特征中减去了5只年轻小鼠的平均谱，并平均所有基因过滤基因估计溢出的基因在溢出大于5％的基因后，基于内部vizgen指标，使用局部蜂窝状表达影响了溢出的基因，使所有基因的绝对值平均值减少了这种差异的绝对值。我们每次对不同的细胞进行采样20次重复了此过程。

　　对于每个单元格，我们将原始转录物计数除以单元的分割体积，然后使用Scanpy.pp.normalize_total的默认设置通过总数进行标准化。对于细胞类型，解剖下区域和基因的每种组合；我们计算了一个长度为20（轨迹）的矢量，该向量包含该基因在每个年龄段的基因的平均表达，以指定的子区域和细胞类型为条件。如果至少在70％的剖面年龄中不存在给定的细胞类型和子区域组合，我们将该轨迹分类为“缺失”。我们执行了最后一个婚姻的前向插补，以填充通过此阈值的轨迹中的缺失值。每个轨迹通过以sklearn.preprocessing.standardscaler102为中心和缩放为单位方差进行标准化。然后，我们使用sklearn.cluster.kmeans进行k-均值群集，n_clusters = 9，andural_state = 444，n_init ='auto'和矩阵，每一行对应于缩放基因表达式轨迹作为输入。选择聚类的参数以最大化簇的数量，同时还保持每个群集的质量不同趋势（扩展数据图4A，B）。对于每个基因表达轨迹的簇，我们可视化了缩放表达值的平滑中值和四分位间范围。使用scipy.interpaly.bspline用s = 20进行插值B-Spline进行平滑。我们根据定性表达模式手动注释每个群集。这些轨迹簇包括具有表达后期（“较晚”增长）的基因，在整个生命中逐渐增加（“渐进式”），在中年生活（“中年槽”）的表达最低（“中年槽”），早期生活（“早期峰值”的峰值（“早期峰”），中年峰（“中年峰”的高峰（“后期”峰值'峰值'峰值（下降），下降了（下降），降低了（下降''），降低了（降低），降低了（下降），这是降低的，''生命的早期减少（“早期减少”），并在生活中逐渐减少（“减少渐进”）。为了可视化每种细胞类型的代表性基因表达轨迹，我们针对簇的每个细胞类型特异性子集分别执行了相同的平滑过程。我们开发了这种轨迹聚类方法，而不是使用参数方法（例如，多项式拟合）来提供对不同轨迹的更加偏见的表征。

　　对于每种单元格类型，我们构建了通过欧几里得距离和相同的单元格类型103将每个单元与其20个近邻居连接的空间图。空间老化时钟性能通常是构建此图中最近的邻居数（k）的选择（扩展数据图5a）的鲁棒。我们计算了代表空间图的L1归一化邻接矩阵。然后，空间光滑算法通过迭代更新方程直至收敛（即，）：

　　初始基因表达矩阵（细胞为行，基因作为列）是标准化的邻接矩阵，是平滑参数。我们设置为0.8。我们将收敛性设置为30次迭代，公差为0.01，如果少于公差或经过30次迭代，则可以达到收敛性。对于罕见的细胞类型（例如，T细胞，B细胞，中性粒细胞），空间平滑通常在30次迭代之前收敛。对于常见的细胞类型（例如，少突胶质细胞，小胶质细胞，星形胶质细胞），通常在30次迭代中进行空间光滑。在逐步收敛之后，我们使用平滑的空间基因表达矩阵作为训练老化时钟的输入。

　　对于训练空间老化时钟，我们在对数拟态化基因表达上进行了空间平滑过程，以独立地为每种细胞类型获得平滑的空间基因表达矩阵。然后，对于每种细胞类型，我们安装了一条由基因特征的标准化的管道，然后是套索回归模型，以预测细胞基因表达谱的样本年龄，并使用sklearn.linear_model.lassocv选择具有CV = 5的最佳超参示剂，n_alphase = 20，n_alphase = 20，max_iter = 10000。我们将整个从空间平滑度到年龄预测的管道称为“空间老化时钟”。为了避免对空间信息的年龄预测明确调理，空间老化时钟只利用空间上下文来通过空间滑动处理输入数据。

　　为了对空间老化时钟进行交叉验证评估，我们将单个样本/年龄作为测试集，并将其余样品/年龄保留为火车集。为火车和测试组分别执行空间滑动。我们拟合了Lasso回归管道以预测火车组上的年龄，并使用该模型在测试集上获得预测的年龄。我们在所有样品/年龄中重复了此过程，以获得研究中所有细胞的预测年龄。通过Pearson的相关性（R）以及从交叉验证获得的单个细胞的年龄和预测年龄之间的平均绝对误差来评估性能。我们还计算了皮尔逊（Pearson）的相关性（r）在年龄和中位数中预测的单个小鼠的年龄之间的相关性。对于特定于小区域的老化时钟，我们使用相同的设置对模型进行了训练和评估，除非有五个最近的邻居进行空间光滑的邻居，又限制了每个子区域中仅用于训练的单元。为了将空间老化时钟与经过分离的单细胞RNA-seq数据训练的细胞型老化时钟，我们使用了与这些时钟和数据相关的预测年龄的中位数。

　　我们使用了两种方法来可视化从空间老化时钟应用获得的预测年龄，这是通过冠状区数据集的交叉验证或直接通过对外部数据集的验证。

　　For datasets with relatively uniform distribution of many ages across lifespan (that is, the coronal section dataset), we used a correlation plot visualization consisting of a two-dimensional histogram of cell frequencies across bins defined by predicted age and actual age that is visualized as a heat map, a scatter plot of the median predicted age of cells across each sample as a function of the actual age, and a line of best fit for the median predicted ages as a function实际年龄以黑色显示并使用numpy.polyfit进行DEG = 1。这种类型的可视化强调了许多实际的年龄值在样本水平上预测年龄的中位数质量。通常，在这种可视化中，由于预测年龄的异质性，预测年龄的范围将大于实际年龄的范围，而在同一小鼠的细胞实际年龄中则不大。对于兴奋性神经元等高度丰富的细胞类型，这可能特别明显。由于使用留下的小鼠的预测年龄将显示出对平均年龄的回归（也就是说，来自年龄较小的老鼠的细胞，预计年轻小鼠的细胞会年龄较大），因为每个交叉验证训练数据集中的平均实际年龄都不同。

　　对于具有年龄分布的数据集（即矢状部分数据集）或三个或更少不同的年龄组（即所有外部数据集），我们使用了不同年龄组或不同实验条件的细胞预测年龄的密度图可视化。使用Seaborn.kdeplot构建了每组预测年龄的内核密度估计值。这种类型的可视化强调了预测年龄在细胞水平的少数组中的分布。对于冠状部分数据集和矢状部分数据集，我们使用了两种类型的表示。

　　为了比较时钟性能，我们比较了相对于主要空间老化时钟或不同数据子集或时钟之间的预测年龄与实际年龄之间的平均绝对误差和皮尔逊相关性，以得出我们的结论。

　　为了应用空间老化时钟来预测外部空间转录组学数据集中细胞基因表达谱的年龄，我们应用了以下一般程序。首先，我们将外部数据集过滤为仅包括300个基因的Merfish面板中存在的基因，并且在空间老化时钟之间也仅表示细胞类型。然后，我们使用与我们的Merfish数据相同的方法对原始表达值进行了归一化和log转换，并将空间分形式（）应用于每个单元格类型的对数符号化值。对于外部数据集中不存在的时钟基因，我们将时钟的训练数据用作SPAGE算法中的参考数据（N_PV = 15）中的参考数据，以归为缺失基因的表达。负估算值剪辑至零。We performed imputation for genes from our MERFISH panel that were missing from these datasets (228 genes in the 140-gene MERFISH coronal section dataset, 5 genes in the single-nuclei RNA-seq dataset, 36 genes in the single-cell RNA-seq dataset, 225 genes in the LPS dataset, 128 genes in the Alzheimer’s mouse model dataset, 240 genes in the global通过EAE数据集脱髓鞘，局部脱髓鞘损伤数据集中的236个基因）。最后，对于每种细胞类型，我们应用了相应的空间老化时钟来从平滑的空间基因表达值中产生预测的年龄。对于缺乏空间信息的单核RNA-seq数据集，我们使用了先前的Model4的伪库尔克方法，其中20个细胞有助于每个伪细胞，而不是空间平滑。

　　对于所有评估，我们还量化了预测年龄的中位年龄差异的幅度（以月份为单位）和该差异的95％置信区间，这是根据每种条件下单个小鼠的1,000个自举样本的中位数差异的经验分布进行计算的。这些统计数据在补充表12中报道。在某些情况下，插补产生了偏见的年龄预测，但是年龄和条件的预测年龄差异通常是牢固的。在将空间老化时钟应用于插补时，我们建议将预测的年龄与数据集中的已知年龄进行比较，以校准解释。通常，我们观察到具有较低转录组变化的细胞类型的较低空间老化时钟性能，如神经元（见图1E）或外部数据集中标记基因有限的神经元（例如神经细胞）的细胞类型（见图2D）。对于没有弹药的空间老化时钟的所有应用以及使用220个基因训练的空间老化时钟（请参阅列表，请参见补充表7），基于内部vizgen公制的溢出量少于5％（请参阅补充表7，请参见补充表7），结果也通常是一致的。

　　我们计算了每个细胞预测年龄的年龄加速度，以测量与预期年龄的偏差（即，从给定的细胞类型和小鼠中所有细胞的预测年龄平均值）。对于每种样品和细胞类型，我们将属于样品和细胞类型的细胞集定义为AS，每个细胞的年龄加速度定义为：

　　我们将空间老化时钟应用于少年（0.93个月）和旧（20.93个月）女性C57BL/6 J MICE17的CTX和STR上的公开可用的单核RNA-seq数据。我们从https://cellxgene.cziscience.com/collections/31937775-0602-4E52-A799-B6ACDD2BAC2E下载了包含缩放日志基因表达式的处理后的数据对象，这些基因表达式表达式。我们修改了“在外部数据集上应用空间老化时钟”中概述的预处理和插图步骤，以说明用作输入的缩放对数nofalsization表达式。当使用缩放的对数差异冠状段数据集进行插补时，预测的年龄是高度一致的。

　　我们将空间老化时钟应用于全脑组织（没有后脑区域）的公开可用的单细胞RNA-seq数据（2-3个月）和旧（21-22个月）的雄性C57BL/6 J小鼠5。我们从https://portals.broadinstitute.org/single_cell/study/aging-mouse-brain下载了处理的数据集，并将几个单元格映射到我们的单元格类型分类。

　　我们将空间老化时钟应用于先前发表的有关年轻人（0.93个月），中年（5.58个月）和旧（20.93个月）男性C57BL/6 JN MICE29的年轻人（0.93个月），中年（5.58个月）和老年（20.93个月）的年轻人（0.93个月），中年（5.58个月）和老年（5.58个月）和旧的冠状动脉剖面数据。我们将几种细胞类型映射到我们的细胞类型分类中。

　　我们将空间老化时钟应用于少年（0.93个月），Young（5.58个月），老年（20.93个月）和lippolysacachield（LPS）注射的条件的雌性C57BL/6 J小鼠的CTX和STR上的公共空间空间转录组学数据。我们从https://cellxgene.cziscience.com/collections/31937775-0602-4E52-A799-A799-B6ACDD2BAC2E下载了包含缩放日志基因表达式表达的加工数据对象。我们修改了“在外部数据集上应用空间老化时钟”中概述的预处理步骤，以说明用作输入的缩放对数符号表达式。当使用缩放的对数差异冠状段数据集进行插补时，预测的年龄是高度一致的。我们在分析中包括了所有控制（衰老）和LPS注射小鼠。

　　我们将空间老化时钟应用于公共可用的流离失所，以及关于男性taups2app（阿尔茨海默氏病模型）和两个年龄段（8个月和13个月）22的男性taups2App（阿尔茨海默氏病模型）的CTX和海马数据的空间转录组数据。我们从https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell/study/scp1375下载了处理的数据，并将几个单元格映射到我们的单元格类型分类并使用了现有的区域注释。我们在分析中包括了所有控制和阿尔茨海默氏病小鼠。该数据集中的零计数百分比高（94％）高于用于训练空间老化时钟（70％）的冠状段数据集中的百分比。

　　我们将空间老化时钟应用于在全球脱髓鞘和控制条件的男性和女性C57BL/6J小鼠（2.5个月）的全脑冠状动脉剖面（2.5个月）的全脑冠状切片上的空间转录组数据23。全球脱髓鞘模型包括通过注射髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白来诱导EAE。我们从https://zenodo.org/records/8037425下载了处理的数据，并仅选择了Whole-Brain Coronal部分。我们将几种细胞类型映射到我们的细胞类型分类中，并使用了现有的区域注释。该数据集中的零计数百分比（76％）与用于训练空间老化时钟（70％）的冠状部分数据集相似。

　　We applied our spatial ageing clocks to publicly available MERFISH spatial transcriptomics data of three whole-brain coronal sections at different depths collected from young (3–4 months) male C57BL/6J mice that were subjected to demyelination injury via stereotactic injection of lysophosphatidylcholine at coordinates (from bregma): (X, ±1.0 mm; Y,-0.1 mm）21。我们从Gene表达式综合（GSE202638）下载了处理的数据和元数据，并将几个单元格类型映射到了我们的细胞类型分类。由于该数据集的脱髓鞘损伤的空间局部性质以及缺乏控制条件，我们通过通过空间来可视化所有细胞（负值（负值地浮在零）中，分析了该数据集中的细胞的预测年龄，以确定各个细胞类型的空间模式，以确定各个细胞类型和各种细胞类型的型号。该数据集中的零计数百分比高（94％）高于用于训练空间老化时钟（70％）的冠状段数据集中的百分比。

　　对于给定的细胞类型和实验，为了量化两个实验条件之间的预测年龄差异，我们计算了两个条件细胞之间预测年龄的中位年龄的差异。特别是针对干预措施，我们减去了在对照条件下（久坐的，久坐，对照）中属于小鼠的细胞年龄的中位数预测的中位数预测在干预条件下属于小鼠的细胞年龄（运动，OSKM，LPS或阿尔茨海默氏病）。正值表明干预措施具有加速的衰老效应，负值表明干预对小鼠细胞具有恢复活力。对于全身部分重编程实验，由于对照和OSKM条件为0.3个月，小鼠的平均年龄存在差异，因此我们通过在计算效果之前向预测的年龄添加截距来纠正这种差异。我们在全局水平（细胞类型的所有细胞）和区域级（定义的解剖区域内的所有细胞类型的所有细胞）上计算了这种效果。对于不良干预数据集（LPS和阿尔茨海默氏病），我们使用了现有的解剖区域注释，并将其映射到我们研究中最接近的区域标签。对于所有全球比较，我们量化了预测年龄的中位数差异（以月份为单位）和该差异的95％置信区间，这是根据每种条件下单个小鼠的1,000个自举年龄段的差异的经验分布计算出的。这些统计数据在补充表12中报道。

　　干预措施对预测年龄的影响的空间可视化涉及计算干预条件下样品中每个细胞的效应值。具体而言，对于在干预条件下的每个细胞，我们从该细胞的预测年龄匹配的对照条件（久坐的，久坐，控制）中减去了属于小鼠的细胞的中位数，然后通过其空间坐标和计算值以其空间坐标来形象。

　　细胞接近性效应通过将效应细胞附近的靶细胞与远离效应细胞的靶细胞进行比较，可以测量效应细胞类型对靶细胞类型的转录组老化的作用。To compute the distribution of nearest neighbour distances, we constructed a triangulation mesh graph connecting neighbouring cells on a given sample using squidpy.gr.spatial_neighbors with delaunay=True103.我们使用每个细胞的质心来计算细胞之间的距离。我们计算了次区域特异性距离截止，以将附近的细胞称为邻里邻居纽布距离的平均值。衰老（冠状）研究的距离截止（微米）为：CC/ACO：24.89，CTX_L1/MEN：25.91，CTX_L2/3：24.05，CTX_L4/5/5/6：27.24，STR_CP/ACB：21.65，str_65，str__ls/ndb：20.36 6db：20.36 6db：20.36，36。36，36。36.36，36。36.36，36。36.36，20.36，36。36.36，20.36，20.36，20.36，20.36，ven.66，ven.66，ven.66，20.36，ven.66，20.36，ver。锻炼研究的距离切口（以微米为单位）为：CC/ACO：23.58，CTX_L1/MEN：22.13，CTX_L2/3：21.80，CTX_L4/5/5/6：24.81，Str_CP/ACB：20.75，STR_LS/NDB：19.82，VIN：16.23，VEN：16.23，VEN：16.23，VEN：16.23，VIN：16.23。使用这些亚区域特异性距离截止，我们确定了效应细胞附近的靶细胞（“接近”），并将其与给定靶细胞类型和效应细胞类型的任何效应细胞（“ FAR”）相匹配。首先，我们为每个细胞计算了每个效应细胞类型中与同一样品中任何效应细胞中最短的欧几里得距离。然后，对于每个样品以及目标细胞类型和效应细胞类型的组合，我们将所有目标细胞标记为最短的欧几里得距离与效应细胞类型的标签，该靶细胞小于相应的距离截止，将它们匹配为“接近”，并与它们在同一子区域和样品中的“远”目标细胞匹配，与效果细胞类型最短的距离远距离距离较短的距离，该距离较短。在所有样品中获得了匹配的“接近”和“远”目标细胞之后， 我们将它们组合成一个组，以估计效应细胞类型对目标细胞类型的接近性效应。与“远”靶细胞的年龄加速相比，将接近效应计算为Cohen D量度的效果大小量度。年龄加速度的差异在“接近”和“远”靶细胞组之间相似（扩展数据图9a）。我们过滤了比较少于50个“接近”细胞或小于50个“远”细胞的比较。正接近效应值表明效应细胞类型对目标细胞类型施加的促成效应，负接近效应值表明效应细胞类型对目标细胞类型施加的促耐振兴效果。我们还计算了邻近相互作用的归一化频率，因为“接近”目标细胞的数量除以研究中目标细胞的总数，以及从相关的双向学生的t检验中的统计数据和p值分开，在“接近”和“远”目标细胞的年龄加速度之间。

　　我们对标准接近效应分析实施了几种变体。对于特定区域的接近效应，我们将接近效应分析限制为每个解剖区域内的细胞。对于使用“ FAR”细胞的替代定义的细胞接近效应，我们使用了两种正交方法。第一种方法包括对所有目标细胞的“远”细胞的随机采样，其最短距离大于相同子区域和样品中“近”细胞的临界值。第二种方法包括选择一组“远”细胞，其总原始转录物数量最接近，最接近同一子区域和样品中“接近”细胞的平均原始转录计数。For cell proximity effects based on predicted ages obtained from non-spatial ageing clocks such as spatial ageing clocks that did not use the SpatialSmooth step for prediction (SingleCell (SS)) or single-cell ageing clocks using cell-type-specific pseudobulking of gene expression (1,000 bootstrap samples of 30 cells following prescribed procedures4) during training and prediction (SingleCell（pb）），我们使用了这些上述时钟的预测年龄，以代替空间老化时钟的预测年龄，并在原始设置后进行了细胞接近分析。对于“溢出过滤”的细胞接近效应，我们使用了在220个基因上训练的空间老化时钟的预测年龄，其基于内部Vizgen度量的溢出率少于5％，使用局部细胞组成影响的基因表达变化。对于除冠状区数据集以外的数据集对细胞接近性的影响， 我们使用原始设置为所有映射到我们的细胞类型分类的细胞类型计算了子区域和区域的数据集特定距离截止。我们计算了整个外部数据集中细胞的单独接近性效应以及仅限于控制条件的单元。为了评估干预措施对细胞接近效应的影响，我们针对每个实验条件分别计算了细胞接近效应。我们从接近效应分析中排除了140个基因的Merfish数据集，因为该数据集在空间上稀疏，距离截止值比其他数据集大几倍，这可能是由于较低的细胞检测/分割频率。

　　每种效应细胞类型的平均接近效应被计算为过滤后所有目标细胞类型的平均接近度效应。为了评估影响最大的靶细胞类型，通过在过滤后所有效应细胞类型中平均接近度效应的绝对值来计算每种目标细胞类型的平均绝对接近效应。

　　由于细胞类型比例的区域差异，空间排列可用于评估偶然发生的细胞 - 细胞相互作用的频率。我们对细胞进行了次区域空间排列，作为针对效应细胞测量的空间接近效应的负对照。在每个置换量中，对于衰老（冠状）研究中的每个样品，我们使用numpy.random.permunt随机置入了每个细胞的空间坐标。为每个子区域分别进行该排列，以维持区域异质性。然后，我们测量了对置换的数据集的接近性影响。我们使用均匀绘制的随机种子从0到50,000，生成444的随机种子重复了这些排列。我们计算了中位数和95％的置信区间，以在这些二十个排列中每种效应细胞类型的接近效应。

　　我们通过选择一个效应细胞，绘制一个以200μm的边缘长度为中心的正方形边界盒，然后将所有细胞在边界盒内部的中心坐标中可视化所有细胞，从而产生通过围绕关键效应细胞类型（例如T细胞和NSC）的年龄加速（例如T细胞和NSC）染色的细胞的可视化。我们从中年（18.8个月）的T细胞和NSC中手动选择可视化。

　　我们验证了细胞接近性效应不太可能被附近效应子与分割误差产生的靶细胞之间的转录物溢出而混淆，这对于密集包装的Ven区域的NSC附近的细胞尤为突出（补充图7a）。在测试这一测试的第一种方法中，我们根据从基因子集中训练的空间老化时钟获得的预测年龄计算了接近度效应，该效果是在滤除了高估计溢出率的基因后（参见方法）（补充图7b）。在第二种测试方法中，我们进行了面积限制的接近效应分析，该分析在效应细胞的一个小半径内排除了细胞（请参阅“空间老化时钟”和两个非空间老化时钟（补充图8a，b）。我们验证了该区域限制的方法在T细胞和NSC附近的所有靶细胞类型中都大大减弱了转录物溢出效应（补充图8C）。两种方法都证实了T细胞具有最高年龄的接近效应，而NSC具有最佳培养的接近效应（补充图7b和8b）。

　　为了消除细胞分割对细胞接近度效应分析的潜在影响，我们开发了一种替代方法来计算面积限制的细胞接近效应，其中使用两个临界距离标记了“近近”细胞，而不是在标准接近性效应分析的单个临界距离中标记（请参见补充图8a）。我们将两个截止距离中的较大的距离等于“衰老和复兴的细胞接近效应”的次区域特异性距离截止。我们将较小的截止距离设置为比较大的截止距离小15μm。我们将目标细胞标记为最短的欧几里得距离与效应细胞类型的距离大于距离较小的距离，但距离距离较小，但距离较大的距离截止距离较大，将其标记为“接近”，并将其与“远”靶细胞与同一区域和样品中的“远”目标细胞匹配，这些靶细胞距离效应细胞类型最远，其最短距离距离较短的距离距离距离较短。然后，使用与“衰老和恢复活力的细胞接近效应”中所述的相同方法计算区域限制的细胞接近效应，除了这些修饰的“接近”和“ FAR”细胞标签。

　　我们计算了细胞接近度效应，这是效应子和目标细胞之间单位距离的函数，在效应子和目标细胞之间，单位距离被定义为标量值，该标量乘以从“衰老和恢复的细胞接近效应”的次区域特异性距离截止。这些单位距离用作计算细胞接近效应的新截止距离。我们还通过将两个截至单位距离的较大距离的较大的较大的较大的较大的距离和较小的截止距离设置为比较大的截止距离小于15μm，从而分析了面积限制细胞接近性效应的空间渐变，这确保了在截止距离的整数多数之间定义为“接近”的细胞的重叠。

　　我们通过将所有共享基因的对数非正式表达求和从几个已发表的集合17,106,107和Merfish数据集中的300个基因之间策划的基因签名集之间的对数n词表达来计算小胶质细胞激活评分和少突胶质细胞/OPC炎症评分。小胶质细胞活化评分包括来自APOE，B2M，C1QA，CD69，CD9，IL1A，IL1B，IL1B，IL6和LYZ2的基因表达。少突胶质细胞/OPC炎症评分包括来自C4B，CDKN1A，H2-D1，IFIT1和STAT1的基因表达。

　　为了控制T细胞接近性效应中的激活/炎症状态，我们选择了分类的小胶质细胞（激活）和少突胶质细胞（发炎）亚型的截止值为最高0.2％的最高分数，因为这是最高百分比临界值的最高百分比临界值，因为该临界值在激活/炎症分布中没有统计的激活/激活量分布或在激活量表之间的统计学差异，而在激活/发炎之间无统计。我们使用小胶质细胞和少突胶质细胞的正常和激活/发炎的亚型标签进行了所有相关的接近效应分析。

　　可以利用诸如GNN之类的深度学习方法来预测硅扰动中的影响。For each section in the coronal section dataset, we constructed a global graph connecting neighbouring cells on a given sample using squidpy.gr.spatial_neighbors with delaunay=True103 and pruned edges connecting neighbouring cells with distance greater than 200 μm.为了定义局部细胞图，我们通过在T细胞和NSC的每个细胞类型的每个细胞类型中随机采样最多100个中心细胞，从而提取了全局图的诱导的2个单调子图。为了增加这些局部细胞图的异质性，我们通过在第一组局部子图中诱导以所有细胞为中心的两跳亚图来进一步增强这些局部细胞图。对于每个局部细胞图，我们将邻域老化定义为图中所有细胞的平均年龄加速度。我们使用18个细胞类型注释将单元格特征定义为单次矢量。我们使用Pytorch几何108训练了GNN模型，以从本地细胞图的特征中预测邻域老化。GNN模型由三层图同构网络（GIN）组成，每个层的节点嵌入更新是由线性转换建模的，其隐藏尺寸为16，然后进行批次归一化，relu归一化，最终线性变换，并具有16个隐藏层面的固定范围。衰老。我们使用平衡的于点误差损失109，学习率为0.0001的ADAM Optimizer110培训了GNN模型，对于50个时代，批次大小为64。

　　为了模拟给定局部细胞图的“功能丧失”扰动，我们将图形的中心细胞突变为从数据集中所有单元格类型的均匀分布中绘制的随机单元格类型，不包括原始单元格类型。我们对将T细胞和NSC作为中心细胞的局部细胞图进行了“功能丧失”扰动。为了模拟给定的本地单元格图的“功能获得”扰动，我们通过修改其节点特征将图形的中心单元格替换为指定的单元格类型。我们对所有局部细胞图进行了“功能获得”扰动，并将中心细胞突变为T细胞或NSC。我们排除了“功能收益”的扰动，导致我们的分析中未受扰动的本地细胞图（例如，用T细胞图形为中心细胞被T细胞代替）。对于“功能丧失”和“功能获得”实验，我们使用内皮细胞作为阴性对照设置。使用GNN模型，我们通过预测未扰动的本地细胞图的邻域老化以及扰动的本地细胞图的邻域老化，评估了“功能丧失”和“功能获得”扰动的影响。然后测量对邻域老化的影响是从扰动的邻域老化中减去的不受干扰的邻域老化（表明促进摄动的正值和负值表示振动的扰动）。

　　为了将通过Merfish测量的300个基因扩大到12,000多个基因，我们使用了我们最近开发的一种方法，即Tissue29，作为Spage104和Tangram111插定算法，进行了不确定性吸引的空间基因表达插补。组织是一种算法，它提供了一种不确定性感知的框架，用于对估计的空间基因表达进行差异基因表达和签名分析，与其他方法相比，错误发现率显着降低，而有明显的降低。This imputation approach consists of jointly mapping transcriptomes from our MERFISH study with single-cell RNA-seq datasets collected from mice across multiple ages and containing the brain regions of interest (for example, VEN, CC or STR)3,4, followed by prediction of new gene expression profiles using the single-cell RNA-seq dataset as reference and differential analysis of gene expression and gene signatures (Extended Data Fig. 12a).The log-normalized gene expression data from the first dissociated single-cell RNA-seq dataset3 were used for imputation of gene expression for T cells (8,170 genes imputed in total), and log-normalized gene expression data from the second dissociated single-cell RNA-seq dataset4 were used for imputation of gene expression for all other cell types (12,719 genes imputed in total).我们将组织算法应用于冠状区数据集的一个子集（有关详细信息，请参见下文）。我们使用通过细胞分割量标准化的原始Merfish计数作为插补的输入。我们在默认设置（例如10倍的交叉验证，4个分层基因组，1个分层细胞组和100个多重归因（用于假设测试目的）下，我们使用了带有SPAGE归合算法和TangRAM归合算法的组织的组织。使用组织软件包和相关代码进行了组织校准质量和SPAGE/Tangram插入性能的评估29。使用交叉验证， 我们验证了估计的基因表达值与实际基因表达值正相关，并且通常具有较小的绝对预测误差（扩展数据图12b）。

　　我们对冠状区数据集中的细胞进行了过滤，以包括NSC和T细胞，并且在接近效应框架下，所有针对NSC或T细胞标记为“接近”或“远”的目标细胞。我们将每个样品重新置于网格晶格点，以使得没有样品在空间上重叠。除了“接近”和“远”标签外，我们还通过其接近效应的强度标记了每个T细胞和NSC。首先，我们将邻域年龄加速度计算为每个T细胞或NSC最大次区域距离内所有细胞的平均年龄加速度。然后，我们将所有T细胞标记为50％的最高邻居年龄加速度为“更加繁殖”，其余的T细胞将其标记为“较少的抚养费”，并且我们将所有NSC标记为所有NSC，其最低邻居年龄加速度为50％的NSC为“更高的养育率”，其余的NSC较低的NSC为“较少的PRO-PRO-PRE-PRE-PREJUSINGINE JUPENCEJUDINCEJUDING”。

　　为了发现T细胞和NSC接近效应的潜在介体，我们使用了两步方法。首先，我们在12,000多个估算基因上使用Tissue29进行了公正的差异基因表达分析，其目的是鉴定在关键效应细胞类型附近的细胞（T细胞或NSC）上上调的常见基因（T细胞或NSC）与远非相同的效应细胞类型相比，并且通过细胞类型和子区域匹配（也就是说，与相同的步骤相匹配，是为了计算的效果）。我们验证了T细胞或NSC附近的细胞不包括比所有其他细胞类型都更大的细胞类型，并且所有14种具有空间老化时钟的细胞类型都存在（补充表16），并且我们检查了比较组中估算基因表达中的方差相似（扩展数据图12C）。在第二步中，为了更好地理解动作的潜在机制，我们使用组织和基因表达在Merfish数据集中进行了针对基因特征的有针对性的统计比较，以从两种效应细胞类型（T细胞或NSC）（T细胞或NSC）和靶细胞（附近）（附近）（附近的细胞）中的两种无偏分析中的最丰富术语相关的过程。

　　我们使用组织对估算的基因表达进行不确定性感知的差异基因表达分析。组织依赖于一个具有统计保证的多个插补框架，仅t检验可扩展（非参数组织测试依赖于较少定义的P值转化）29。鉴于插补质量的差异，我们选择了组织框架，尽管t检验有一些局限性，该框架非常适合该任务。我们使用组织的双面t检验进行了两组比较，以实现基因特征的假设检验。首先，我们比较了与T细胞或NSC相对于“接近”和“远”靶细胞之间的基因特征评分。其次，我们比较了更多的年龄和较少的老龄化T细胞之间的基因特征分数，或者比较较固化的NSC和更少培养的NSC之间的基因分数。我们确定了显着的DEG作为基因，其基因具有允许性的p <0.05的p <0.05，用于SPAGE和Tangram估算的表达，以减少因估算质量的可变性或偏见而导致的错误发现。我们进一步过滤了这些基因，以使相关的组织T统计量在Spage和Tangram弹药的测试中具有相同的符号。我们没有通过跨条件的估算基因表达的对数折叠变化对基因进行任何过滤，因为与组织P值不同，对于空间基因插补的不确定性，并未校准对数折叠的变化。

　　使用GSEAPY113（1.0.4版）访问的富集框架112进行GO生物过程（2023）基因集富集。我们将每次比较的DEG分离为上调的DEG（阳性组织T统计）和下调的DEG（负组织T统计量），并将这些基因列表用作富集的输入，以获得不同基因组的富集统计。我们为每个比较选择了前五名基因集，这些基因集通常代表了所有显着富集基因集的基因集。

　　我们使用scipy.stats.levene实施进行了莱文的测试，并具有默认设置（中间=中位数，比例tocut = 0.05），以依靠Cohen的D或学生t检验的变化。莱文的测试用于测试每个细胞接近效应的“接近”和“远”细胞组的年龄加速度的均等差异。Levene的测试还用于测试与T细胞和NSC相对于“接近”和“ FAR”细胞组的组织（SPAGE）估算基因表达的相等方差。在这两种情况下，比较组之间的样本数量均等，在这种情况下，科恩的D和学生的t检验通常与整个组的不平等差异相当。

　　我们进一步修改了组织中的假设检验框架，以对基因特征评分进行测试（GO基因集中所有基因中估算的基因表达值的总和）。我们已将此修改在组织软件包29中公开可用。对于估算的基因特征评分，我们进行了与“组织差异基因表达分析和富集途径”相同的两组比较。对于涉及单个基因表达（例如BST2，STAT1，CD9和VEGFA）的类似比较，而不是基因特征，我们使用了Merfish数据集中测得的（差异化）基因表达值而不是估算值。

　　所有免疫抑制剂均在指定年龄的雄性C57BL/6JN小鼠上进行。用PBS（Corning，21-040-CV）用0.8 ml 2.5％2.5％Vol/vol Avertin（Sigma-Aldrich，T48402-25G）镇静小鼠，并通过心脏的左心室灌注5 ml PBS（Corning，21-040-CV）的心脏左心室（21-040-CV），Heparin soddrich salt（50 u MiMl-sig-sig-sig-sig-sig-sig-1，sigma-1，sigma-sma s，sigma-sma s，sigma-sma s，为了去除循环血细胞，然后在PBS中进行4％多聚甲醛（电子显微镜科学，15714）。在4％多聚甲醛（电子显微镜科学，15714）中将大脑固定过夜，然后在30％蔗糖（Sigma-Aldrich，S3929）中脱水72 h。将大脑嵌入OCT化合物（Fisher Healthcare Tissue Plus，4585）中，使用低温器（Leica，CM3050S）在20μm的冠状切片中剖切开，然后安装在静电载玻片上（Fisher Scientific，12-550-15）。收集了与Merfish冠状切片相似的冠状切片。在以下步骤中，在每个实验中同时处理所有大脑部分。对于免疫荧光染色，将脑切片用PBS洗涤5分钟，用0.1％Triton X-100（Fisher Scientific，BP151）在冰冷的甲醇中透化15分钟，然后用PBS洗涤3次。我们通过将脑切片放入10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0; 2.94 g三含柠檬酸三水合物（Sigma-Aldrich，s1804）中，进行了抗原检测在水浴中85°C 2小时。将缓冲液中的脑部切片冷却至室温20分钟，然后用PBS两次洗涤3分钟。将切片在室温下阻塞30分钟，块缓冲液由5％正常驴血清（免疫接种，SP-072-VX10）和1％BSA（Sigma，A7979）组成。在阻塞缓冲液中稀释初级抗体，并在4°C下过夜进行原代抗体染色。使用的主要抗体如下：抗GFAP（1：1,000稀释， Abcam, ab53554), anti-Ki67 (1:500 dilution, Thermo Fisher Scientific, 14-5698-82), anti-DCX (1:500 dilution, Millipore Sigma, AB2253), anti-EGFR (1:200 dilution, Millipore Sigma, 06-847), anti-STAT1 (1:500 dilution, Cell Signaling Technology,14994），抗CD3（1：500，ABCAM，AB11089），抗S100A6（1：500，ABCAM，AB181975），抗CD9（1：100，Thermo Fisher，EbioKMC8（KMC8）），Anti-CPT1A（Anti-CPT1A（1：200，ABCCAM，ABCAM，AB12856）。将切片用PBS洗涤3次，在室温下用0.2％Tween-20洗涤10分钟，然后用PBS两次用PBS洗涤15分钟。在阻塞缓冲液中稀释二抗，并在室温下进行二抗染色2小时。Secondary antibodies used were as follows: Donkey anti-Goat 647 (1:500 dilution, Invitrogen, A21447), Donkey anti-Rabbit 488 (1:500 dilution, Invitrogen, A-21206), Donkey anti-Guinea pig 594 (1:500 dilution, Jackson ImmunoResearch, 706-585-148), Donkey anti-Rat647（1：500稀释，Invitrogen，A48272），驴抗鼠488（1：500，Invitrogen，A21208），驴抗小鼠647（1：500，Invitrogen，A31571），A31571，A31571，A31571，驴抗Rabbit 568（1：1：1：1：1：500，Invitrogen，A10042）。在继发抗体染色期间，添加了DAPI（1：500，Thermo Fisher，62248）。将切片用PBS洗涤3次和0.2％Tween-20，持续10分钟，然后用PBS 3次用PBS洗涤5分钟。将切片用延长的金抗铁式安装式安装，其中DAPI（Thermo Fisher，p36931）和盖玻片。

　　为了进行与时空标记表达相对应的免疫荧光实验，使用10×Zeiss Zen Blue 3.3软件的Zeiss Zen Blue 3.0软件或Zeiss LSM 980共聚焦显微镜在Zeiss LSM 900上获取图像。相同的设备和显微镜采集设置用于具有相同抗体面板的不同脑部。使用Zeiss Zen Blue软件缝制瓷砖图像。图像亮度和对比度在ImageJ（1.53N）中进行了调整，以增强可视化，并使用适用于每个抗体染色面板显示的所有图像的相同设置。

　　对于对应于T细胞和NSC接近效应的免疫荧光实验，在配备有Zyla SCMOS摄像头（Andor）和NIS元素软件（AR 4.30.02，64-Bit）的Nikon Eclipse Ti共聚焦显微镜上获得了60倍物镜的图像。对于与T细胞接近效应相对应的免疫荧光实验，我们获得了至少两个包含T细胞的图像和一个图像，其中至少有一个来自四个解剖区域（CC，CC，CTX，纹状体和邻近区域和邻近区域（Str）和VEN）的T细胞，每个脑部和VEN的每个脑部）。在本实验中，所有大脑部分都使用了相同的图像采集设置。对于与NSC接近效应相对应的免疫荧光实验，我们获取了每个大脑截面整个左右VEN的单个图像。在本实验中，所有大脑部分都使用了相同的图像采集设置。

　　对旧（28个月）小鼠的脑切片进行免疫荧光成像。所有细胞分割和细胞类型注释均使用Qupath 0.5.1中的自动管道进行。对于所有图像，根据DAPI强度自动分割细胞核，然后将核分割掩模扩展为2μM，以定义细胞分割。使用手动确定的平均细胞CD3强度的阈值将细胞标记为CD3+。在所有图像中使用相同的阈值，CD3+细胞被注释为T细胞。对于所有CD3细胞，我们将细胞定义为“接近”，如果它们基于细胞分割的质心50μm，则将其定义为“不接近”。对于每个解剖区域（CC，CTX，STR和VEN）以及每个细胞接近度定义（“接近”或“不接近”），我们通过平均每个截面的平均细胞STAT1强度，然后在每个小鼠之间平均这些值来量化平均STAT1强度（每只小鼠3-5个冠状切片，每只小鼠8鼠）。由于其脑部的CD3强度较低，因此我们无法发现八只小鼠之一的Str区域中的任何T细胞。每个独立实验的平均STAT1强度值通过将相应平均值“不接近” STAT1强度划分为标准化。

　　对年轻（3.5个月）小鼠的脑切片进行免疫荧光成像。所有细胞分割和细胞类型注释均使用Qupath 0.5.1中的自动管道进行。对于所有图像，沿VEN的衬里定义了感兴趣的区域。在这些感兴趣的区域内，根据DAPI强度进行了细胞核，然后将核分割掩模扩展为2μM以定义细胞分割。使用平均核S100A6强度的手动确定阈值将细胞标记为S100A6+。在所有图像中使用相同的阈值，并将S100A6+细胞注释为NSC，并将其他细胞作为非NSC。为了比较S100A6+和S100A6-细胞之间的CD9强度，我们通过平均每个部分的平均细胞CD9强度，然后在每只小鼠跨每个小鼠（每只小鼠的三个冠状切片，五只小鼠）中平均来量化平均CD9强度。通过将平均CD9强度值除以S100A6-细胞中的CD9强度，将平均CD9强度值归一化。对于所有细胞，我们将细胞定义为“接近”，如果它们位于NSC的20μm（不包括本身）之内，则基于细胞分割的质心，并将其定义为“不接近”。为了比较“接近”和“不接近”细胞之间的CPT1A强度，我们通过平均每个部分的平均细胞CPT1A强度，然后平均每个小鼠的平均CPT1A强度来量化平均CPT1A强度（每只小鼠的三个冠状截面，每个条件为五只小鼠）。每个独立实验的平均CPT1A强度值通过将相应平均值“不接近” CPT1A强度划分为标准化。检查所有“接近”细胞的CPT1A强度与最近NSC的CD9强度之间的相关性， 我们将所有“近”细胞与它们最接近的NSC匹配，这些NSC由质心之间的最小非零欧几里得距离定义，并计算出配对的CPT1A和CD9强度之间的Pearson和Spearman相关性。为了检查相关分析与技术变异性的鲁棒性，我们还使用Zeiss LSM 900使用Zeiss Zen Blue 3.0软件重新成像所有部分，并进行了相同的图像分析。结果与报告的发现高度一致。

　　对于Pearson和Spearman相关性的度量及其相关的测试统计（P值和95％置信区间），我们使用了Scipy.stats.pearsonr和Scipy.stats.spearmanr的实现。对于大多数比较，我们根据Scipy.stats.mannwhitneyu的实现使用了双面Mann-Whitney测试。我们使用Cohen的D进行了细胞接近效应分析，其中通常在“接近”和“ FAR”细胞组之间观察到年龄加速的相似方差（扩展数据图9A）。使用Fisher的所有生物过程项的精确测试，并使用Merfish测量的所有其他基因作为背景，使用Fisher的精确测试，使用Fisher的精确测试，使用Fisher的精确测试对GO生物过程富集分析进行。对于其他数据分析和绘制任务，我们使用Python（3.8.13），Pandas（1.4.2），Matplotlib（3.5.1），Seaborn（0.12.2），Numpy（1.21.6），Scipy（1.8.0），Sklearn（1.8.2），Sklearn（1.0.2），Anndata（Anndata（0.8.0.0），Scanpy（1.1.1）（0.0.2），Tangram-SC（1.0.3），Spage（2022年9月1日访问），GSEAPY（1.0.4），UMAP-LEARN（0.5.3）和StatsModels（0.13.2）。

　　对于带有空间基因表达的基因特征和差异基因表达分析，我们使用了两样本的两侧组织t检验，其中包括“组织插补”部分中概述的规格。组织t检验是唯一考虑估算基因表达不确定性并进一步降低错误发现的统计检验，我们选择了在两种归合方法（SPAGE104和Tangram111）中具有一致差异表达的基因。对于使用组织t检验的大多数比较，估算基因表达的方差在各组之间相似（扩展数据图12c）。由于手动选择了基因标志，我们没有对靶基因特征分析对P值进行多个假设校正。报告的P值来自SPAGE估算的基因表达。对于用组织和估计基因表达鉴定的DEG的途径富集，我们将gseapy.enrichr与“ go_biological_process_2023”基因集，“小鼠”作为生物体，所有这些基因都是背景。

　　Merfish测量值的技术可重复性通过在140-Gene Merfish DataSet29中的连续分析来证实（扩展数据图1A）。对于Merfish（300个基因）老化数据集，我们合并了两个队列（每个队列的n = 10只小鼠），并确认了空间老化时钟性能的可重复性以及每个队列中关键发现的概括（扩展数据图5B，C，C和补充图6d，e）。所有实验验证均在独立小鼠上进行。免疫荧光图像分析通过外泌体和脂肪酸氧化对NSC接近效应介导的技术可重复性通过不同显微镜的不同实验师重新成像评估了相同部分。进行了两个单独的免疫荧光染色和成像实验，用于通过干扰素反应介导的T细胞接近效应并进行组合进行分析，并且对每个实验的强度都归一化。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。