我们使用先前描述的正常IPS细胞系N-2.12-D-1-1作为父母线，以生成本研究中描述的所有CRISPR-CAS9编辑线，除非另有说明36。对于扩展数据中描述的编辑线，我们将带有杂合的Runx1突变（NM_00100189：c.533-1g> t）的患者衍生的Runx1-FPD线作为父母线50,51。以前描述了用于生成ASXL1C末端截断，SRSF2P95L突变，NRASG12D突变和FLT3-ITD的基因编辑策略。先前被描述为27,28,52。在每个基因编辑步骤之后，分离了每个突变的几个独立克隆，然后在遗传和初步表型表征以排除潜在异常值之后，为每个随后的编辑步骤选择一个克隆。

　　我们使用CRISPR-CAS9介导的同源指导修复（HDR），使用突变体和WT供体模板的共传递（如前所述的数据2A）引入DNMT3AR882H突变（如前所述2A）。如先前所述27进行了限制性片段长度多态性分析，通过限制片段长度多态性分析对表达GRNA和CAS9的质粒的核反射。简而言之，将N-2.12-D-1-1 IPS细胞系培养在含有10 mM Y-27632的hESC培养基前至少1小时。将细胞分解为具有ACCUTASE的单个细胞，并使用核对象II（LONZA）使用5 µg GRNA/CAS9质粒和5 µg每个供体质粒（WT和G12D）的细胞进行核对核。转染后48小时对麦田氨酸+细胞进行麦替氏菌+细胞，并以克隆密度铺板。通过PCR和DDEI限制性酶筛选单个菌落和限制片段长度多态性分析。

　　如所述，如所述，如所述，如所述5333。

　　以前已经描述了AML-9.9，AML-4.10，AML-4.24，N-2.12，AML-37.16和AML-47.1 IPS细胞系的推导。如先前所述，在有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养人IPS细胞。52。如前所述，造血分化使用了自旋EB方案52。对于单核细胞分化，将第11-16天的HSPC转移到具有1％非必需氨基酸的STEMPRO-34 SFM培养基中，1 mM-谷氨酰胺和0.1 mMβ-cercapto乙醇，并补充了100 ng ml-1巨噬细胞刺激因子和25 ng-1 nday days in day days in nd days in Inter-1 ireft-nd Days-3-3-3-3-3。在分化培养的结尾，收集细胞并将其与ACCUTASE分离为单个细胞，用于流式细胞仪，细胞学分析，VEN治疗或移植到免疫缺陷的小鼠中。

　　将大约200,000个来自液态造血分化培养物的细胞用含有2％FBS的PBS洗涤两次，并重悬于PBS中。使用Shandon Cytospin III Cytecentrifuge（Thermo Electron）在载玻片上制备细胞纺丝。然后将载玻片风干30分钟，并用Hema 3染色套件（Fisher Scientific）染色。在尼康Eclipse CI显微镜上读取幻灯片，并使用尼康DS-RI2摄像头和NIS元素D4.40.00软件拍摄数字图像。

　　The following antibodies were used: CD34-PE (clone 563, catalogue no. 550761, BD Pharmingen, 1:100 dilution), CD34-BV711 (clone 563, catalogue no. 740803, BD Biosciences, 1:100 dilution), CD45-APC (clone HI30; catalogue no. 555485, BD Pharmingen, 1:100稀释），MCD45-PE-CY7（克隆30-F11，目录No。552848，BD Pharmingen，1：100稀释），CD33-BV421（克隆WM53，CatalogNo。562854，BD Biosciences，BD Biosciences，BD Biosciences，1：100 Dilution，1：100 Dilution，1：100 Dilution），CD19-PE NON（CLONE HIB19，CATLONE HIB19，CATCAT cATCALOG19，CATCALOG og cATCONGOG19，cATCAT cATCANGOG19，cATCATOG19，cATCATOG19，BD. CATCAN。Biosciences，1：100稀释），CD19-BV650（克隆HIB19，目录号编号740568，BD Biosciences，1：100稀释），CD38-PE-CY7（克隆HIT2，Catalogno。980312，Biolegend，Biolegend，Biolegend，1：1：1：1：1：1：1：1：CD12-BV421（CD123-BV421），CLonES 7G 3，CLonES 7G，CLonES 7G，CLonONE 7G，CLonONE 7G。563362, BD Biosciences, 1:20 dilution), CD45RA-APC (clone MEM-56, catalogue no. MHCD45RA05, ThermoFisher Scientific, 1:100 dilution), CD68-PE-Cy7 (clone Y1/82 A, catalogue no. 565595, BD Pharmingen, 1:100 dilution), CD11b-BB515（克隆ICRF44，目录编号564517，BD Biosciences，1：100稀释），CD11B-BV650（克隆ICRF44，目录301336，Biolegend，Biolegend，1：100稀释），1：100稀释），CD14-APC（CLONE M5E2，CATALOG NO.100 DIRITIonCE NO.555539，BD B. 555539，BD B. 555539，BD）CD14-BV421（克隆M5E2，目录号565283，BD Biosciences，1：100稀释）和CD271（LNGFR） - APC-CY7（克隆ME20.4; Clone ME20.4;目录号345125，Biolegend，biolegend，biolegend，1：2,000稀释）。用4,6-Diamidino-2-苯基吲哚（DAPI； Life Technologies）评估细胞活力。在BD Fortessa或BD Symphony A5 SE上测定细胞，并使用FlowJo软件（Tree Star）分析数据。将细胞分类在BD FACS ARIA II。

　　CB CD34+细胞购自Allcells，并在X-Vivo 15培养基中培养，其中1％非必需氨基酸，1 mM-谷氨酰胺，0.1 mMβ-凝集乙醇和20％BIT 9500血清替代品（干细胞技术）（干细胞技术），并补充100 ng ml-1 ng ml-lig-n-1 flig −1 flig-ML-ML-ML-ML-1 100 ng MLLT333331血小板蛋白和20 ng ml-1白细胞介素-3持续1-4天。如先前所述，在4 µg mL -1聚甲烯存在下，在存在4 µg mL -1聚甲烯的情况下用病毒上清液进行慢病毒载体包装和细胞转导。

　　所有小鼠研究均根据西奈山实验室动物护理法规的伊坎医学院进行，并得到机构动物护理和使用委员会的批准。NSG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) and NSGS (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjlTg(CMV IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ) mice were purchased from Jackson Laboratories and housed at the Center for Comparative Medicine and Surgery at Icahn School of西奈山的药物。使用了6-8周龄时的雌性小鼠，并将其随机分配到治疗组和对照组。根据历史观察确定每组小鼠的数量。使用的最小样本量估计提供了超过80％的功率来检测白血病潜力的差异。调查人员没有蒙蔽。在移植前的1天，将小鼠用30 mg kg -1 busulfan溶液注入腹膜内。基因编辑的IPS细胞衍生的HSPC从造血分化的第12-14天，AML-IPS-CELL衍生的LSC从造血分化或培养的CB HSPC的第14-16天开始，在STEMPRO-34中恢复，并使用25G的针刺（Ipper-c）（iper）（均为1×106），每只小鼠在100 µL中2–3×105（用于CB细胞）。对于DOX给药，将小鼠用Dox Chow喂食。对于VEN给药，在60％Phosal 50丙二醇，30％聚乙烯甘油400和10％乙醇的60％Phosal 50丙二醇中为口服剂量制定了VEN；每天给100 mg kg -1施用3周。根据机构动物护理和使用委员会的指南，所有小鼠一旦表现出疾病的迹象，就会迅速对其进行安乐死。骨髓是从股骨和胫骨中收集的。用ACK裂解缓冲液血化骨髓和脾细胞。通过使用HCD45-APC（克隆HI30，BD Pharmingen）和MCD45-PE-CY7（克隆30-F11，BD Biosciences）抗体进行流式细胞术评估，通过流式细胞仪评估进行了人类植入。使用磁激活的细胞分选（MAC）分离人类细胞， using CD45 microBeads (catalogue no. 130-045-801, Miltenyi Biotec) or mouse cell depletion kit (catalogue no. 130-104-694, Miltenyi Biotec), and cryopreserved for subsequent scRNA-seq analyses.对于继发性移植，在转移后第6周（由于致死性疾病引起的终点），从原发性NSGS受体的骨髓中获得细胞。通过MAC进行小鼠细胞耗竭后，将2×105细胞静脉注射在次生NSGS小鼠中，该小鼠在7周后对其进行了安乐死。

　　对四组（R+SA，R+CTRL，SA+R，SA+CTRL;图2D）的IPS-HSPC进行了三个独立的转移。当所有细胞均为CD34+时，CD34+ CD45+ HSPC在CD45+细胞进行MAC分类后获得CD34+ CD34+，以获得双阳性CD34+ CD45+ HSPC，使用MACS细胞分离微粒和试剂（Miltenyi Biotec）获得了双阳性。总共使用了200,000个排序的细胞用于RNA萃取，用于RNeasy Mini Kit（Qiagen），并将50,000个细胞用于ATAC-SEQ。使用NEBNEXT POLY（A）mRNA磁性隔离模块（新英格兰Biolabs），用1μg总RNA的珠子选择Polya-Tail-Tailed mRNA。使用随机的六聚体生成​​cDNA，并与带有NextFlex快速定向RNA-Seq库Prep Kit（BiOO Scientific）的条形码光泽适配器连接；在NextSeq-500（Illumina）中对75个核苷酸长的单端读数进行了测序。

　　从相同的IPS-HSPC样品中总共处理了50,000个Mac选择的CD34+ CD45+细胞，如下所示：通过用50 µL的ATAC裂解缓冲液裂解细胞核：分离核（10 mM Tris Tris pH 7.4，10 mm NaCl，10 mm NaCl，3 mm MMMGCL2，0.1％NP4和0.1％NP40和0.1％-1％-1％-1％-1％-1％-1％---1％---1％ - 0％---1％---1％---1％---1％ - 0％---1％ - 0％，0.1％---0％---0％，0.1％，pH值1毫升ATAC洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MGCL2，0.1％Tween-20）。细胞裂解物旋转以获得核弹，并根据制造商的说明使用Illumina Nextera DNA样品制备试剂盒进行转座酶反应。使用安捷伦生物分析仪对最终文库进行定量；在NextSeq-500（Illumina）中对75个核苷酸长的配对末端读数进行了测序。

　　FastQC（V.0.11.8，RRID：SCR_014583）用于质量控制。装饰！（V.0.6.6，RRID：SCR_011847）用于修剪适配器序列，质量阈值为20。人参考基因组GRCH38和GENCODE REAKIE 36用作转录组参考（RRID：SCR_014966）。对齐使用的星对准器（v.2.7.5b，rrid：scr_004463）。使用鲑鱼（V.1.2.1，RRID：SCR_017036）获得基因级读数计数。使用DESEQ2 R软件包（V.1.30.1，RRID：SCR_015687）的中位数比率方法进行样品归一化，并且使用DESEQ2的差分表达分析。在所有样品中总共读取少于五个读取的基因被过滤了。如果Benjamini – Hochberg调整后的P值小于0.05，并且绝对Log2FC大于1。使用pheatmap（V.1.0.12）和层级聚类制备热图。用GGPLOT2（v.3.4.3）制备小花。使用ClusterProfiler R软件包（v.3.16.0）分析了“ Ras-late基因”的过分占代表。

　　FastQC（V.0.11.8，RRID：SCR_014583）用于质量控制。装饰！（v.0.6.6，RRID：SCR_011847）用默认参数修剪适配器序列。对于每个样本，使用Bowtie2（v.2.1.1.0，rrid：scr_016368）对人类参考基因组（GRCH38/GENCODE版本36，RRID：SCR_014966）对齐配对的75个基本对读数（grch38/gencode版本36，rrid：scr_014966）。并去除线粒体和伪染色体比对。Picard（v2.2.4，rrid：scr_006525）用于删除重复项（Picard Toolkit 2019）。要生成一个区域宇宙，使用SamTools合并功能合并了所有样品，然后使用Mac（v.2.1.0，RRID：SCR_013291）使用参数 - NOMODEL - NOMODEL - NOLAMBDA –NOLAMBDA –SLOBDA –SSSLOCAL 10000。使用区域的每个样品进行量化2量化。RRID：SCR_006646）。使用DESEQ2 R软件包（V.1.30.1，RRID：SCR_015687）的中位数比率方法进行样品归一化。在所有样品中总共读取量少于750个归一化读数的区域被过滤，并使用DESEQ2进行差异分析（调整后的P值< 0.05 and absolute log2FC ≥ 2. Coverage tracks (Bigwig files) were generated from filtered BAM files for individual replicates using deepTools (v.3.2.1, RRID:SCR_016366) bamCoverage with parameters –normalizeUsing RPKM –binsize 1.

　　Cell-type-specific regulatory elements were obtained from ref. 29 The liftOver function from rtracklayer package (v.1.60.1) was used to convert hg19 coordinates to hg38. Distal elements specific to cell types of interest were plotted in heatmap format using deepTools (v.3.2.1) computeMatrix and plotHeatmap functions. Transcription factor motifs were analysed with the Homer (v.4.10) findMotifsGenome function. Data were visualized with ggplot2 (v.3.4.3) and dcCompareCurves function from deepStats (v.0.4). The CI threshold for bootstraps was set to 0.95.

　　GSEA was carried out on all 6,495 C2 curated gene sets from the Molecular Signatures Database (MSigDB, http://www.broadinstitute.org/msigdb) using the ‘fgsea’ R package (v.1.22 RRID:SCR_020938). Genes were ranked on the basis of log2FC multiplied by −log10FDR (false discovery rate). GSEA P values were adjusted to control for FDR using the Benjamini–Hochberg method. Gene sets with FDR < 0.05 were considered to show significant enrichment.

　　GSEA was also applied to gene sets derived from ref. 14, corresponding to the populations LSPC-Quiescent, LSPC-Primed, LSPC-Cycle, GMP-like, ProMono-like, Mono-like and cDC-like.

　　Chromium 10x Genomics 3′ protocol (v.3.0) was used for scRNA-seq in cells from MACS-sorted iPS-cell-derived xenografts and on FACS-sorted CB HSPCs.

　　The FASTQ files were aligned, filtered, barcoded and unique molecular identifier (UMI) counted using CellRanger Chromium Single Cell RNA-seq by 10x Genomics (v.7.1.0 or v.5.0.1), with GRCh38 database (v.2020-A) as the human genome reference. Each dataset was filtered to retain cells with at least 1,000 UMIs, at least 1,000 genes expressed and less than 15% of the reads mapping to the mitochondrial genome. UMI counts were then normalized so that each cell had a total of 10,000 UMIs across all genes, and these normalized counts were log-transformed with a pseudocount of 1 using the ‘LogNormalize’ function in the Seurat package. The top 2,000 most highly variable genes were identified using the ‘vst’ selection method of ‘FindVariableFeatures’ function and counts were scaled using the ‘ScaleData’ function. Datasets were processed using the Seurat package (v.4.0.3)54.

　　Principal component analysis was carried out using the top 2,000 highly variable features (‘RunPCA’ function) and the top 30 principal components were used in the downstream analysis. Diffusion maps were generated as implemented in the destiny (v.3.4.0) R package55 with default parameters and using 10,000 subsampled cells from each integrated dataset. Datasets for each patient were integrated separately by using the ‘RunHarmony’ function in the harmony package (v.0.1.0). K-nearest neighbour graphs were obtained by using the ‘FindNeighbors’ function, whereas the UMAPs were obtained by the ‘RunUMAP’ function56. The Louvain algorithm was used to cluster cells on the basis of expression similarity. Cell density estimations were performed using the stat_density_2d function of the ggplot2 (v.3.3.5) package.

　　Differential markers for each cluster were identified using the Wilcox test (‘FindAllMarkers’ function) with adjusted P value < 0.01, absolute log2FC >在两个比较组中，使用1,000个随机细胞代表每个簇，在两个比较组中表达基因的细胞中有0.25和大于10％。来自文献的顶级上调基因和策划的基因用于将细胞类型分配给簇。通过将手动注释的细胞类型合并为组来获得元簇。使用逻辑回归（GLM R函数，STAT软件包v.4.3.1）比较样品之间的细胞类型频率。

　　根据纪念斯隆 - 凯特林癌症中心的当地机构审查委员会批准的方案，从AML的患者那里获得了骨髓骨髓单核细胞样品。将样品分组为耗尽淋巴样细胞，并富集爆炸群（DAPI-CD45+CD3-CD20-CD19-CD19-CD34+CD117+），并使用10X Genomics 5'V1基因表达方案进行处理。将FASTQ文件对齐，并使用cellranger v.5.0.1以Grch38作为使用默认参数作为人类基因组参考生成单元格计数矩阵。将数据过滤以保留少于20％的读取映射到线粒体基因组，至少200个基因和至少4,000 UMI的细胞。使用r 4.0中的Seurat v.4进行下游分析。

　　从10倍图书馆准备的全长cDNA搁置了。生成了NRAS G12D的扩增子库，并在147：8：8：16：147配置中在Illumina Miniseq 300 Cycle中输出套件上进行了测序。如上所述，对基因表达式库进行了处理。通过执行基因表达的堆积并在NRASG12基因组位置获得数据来确定单细胞的突变状态。如果检测到一个或多个突变的UMI，则将细胞分配为NRAS MT，如果检测到两个或多个WT等位基因的UMIS，则将细胞分配为WT。WT细胞的严格性增加用于解释等位基因辍学。基因分型效率为8.3％，576个细胞基因分型为NRAS-MT，423个细胞为NRAS-WT。

　　还使用了来自599名AML成年患者的大量RNA-SEQ数据，来自联盟同胞33，也可用于FAB亚型临床注释和批量靶向DNA测序数据，用于分析细胞类型组成。使用源自SCRNA-SEQ AML数据集（GSE230559）的细胞类型特异性基因表达曲线确定细胞类型级分。

　　本手稿中提供的分析包括AML患者，他们在德克萨斯州休斯顿市安德森癌症中心（NCT03404193）的德克萨斯大学MD安德森癌症中心进行了前瞻性临床试验接受前线治疗。如果患者年仅60岁或以上，或者不适合接受强化化疗。排除了欧洲白血病（ELN）有利风险细胞遗传学和先前BCL2抑制剂暴露的患者。DEC以20 mg M -2的剂量加入10天，以进行诱导，然后在响应实现后5天。每天以400毫克的剂量或与Azole抗真菌抗体一起服用VEN。根据ELN 2017或ELN 2022（扩展队列）指南评估终点和结果58。完整的协议先前已描述19。单核细胞分化是通过流式细胞术评估，酯酶阳性，骨髓细胞（FAB M4）或单细胞/单核细胞（Fab M5）形态学确定的35。使用多参数流式细胞术评估可测量的残留疾病，灵敏度为0.1％（参考文献59）。所有研究均根据赫尔辛基道德准则的宣言，按照知情同意。

　　IPS细胞衍生的HSPC，IPS细胞衍生的单核细胞和CB衍生的HSPC在96孔组织培养的经过培养的透明平底板（分别为3903或3603号目录）上，以20,000的密度为20,000。VEN购自SelleckChem并溶解在DMSO中，以浓度为10 mm，然后在STEMPRO培养基中稀释，并在最终浓度为6μm的一式三份井中添加到总量100μl培养基。RASI是从化学（CatalogNo。C-1418）中获得的，并以一式三份井中的最终浓度添加到培养物中。3天后，根据制造商建议的条件，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法（Promega，CatalogNo。G7570）测量细胞活力。将每个化合物浓度的百分比生存力计算为：（信号）/（DMSO对照）×100。半极性抑制浓度值计算计算和使用Prism v.8软件（GraphPad，rrid，rrid：scr_002798）进行半极性抑制浓度曲线的产生。

　　总共将1-2×105 IPS衍生的HSPC与补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的SDS样品缓冲液（Thermofisher Scientific）裂解。通过二氨酸酸测定（Pierce Biotechnology Inc.）确定蛋白质浓度，并在Laemmli SDS样品缓冲液中稀释每种提取物中的1-2μg蛋白质，并通过螺栓上的电泳在10％BIS-BIS-TRIS预制凝胶（Invogen）上通过电泳分辨出来，并在nitrocellosembransesses上溶解。The membranes were blocked with PVDF blocking reagent (TOYOBO) and incubated with primary antibodies: P-p44/42 MAPK (ERK1/2, clone D13.14.4E, catalogue no. 4370S, Cell Signaling Technologies, 1:5,000 dilution), p44/42 MAPK (ERK1/2, clone L34F12, catalogue no.4696S，细胞信号技术，1：5,000稀释），BCl2（克隆124，目录号号码M0887，Dako，Dako，1：5,000稀释），MCL1（克隆D35A5，Clone d35a5，目录号5453S，5453S，细胞信号技术，1：1,000稀释），1：1,000 plilt no no no clill no cell of Signn n no call-bcl-x l clone 54 hef-clone 54h。技术，1：5,000稀释），β-肌动蛋白（克隆13E5，目录编号5125，细胞信号技术，1：10,000稀释）。洗涤后，将印迹与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育，并使用蛋白质印迹检测试剂（Western HRP底物，Millipore）进行开发。对于每种抗体，从同一细胞裂解物中使用具有相同负载条件的独立印迹。

　　统计分析使用GraphPad Prism软件。除非另有说明，否则使用双面未配对的不相等方差t检验进行对不同组之间的成对比较（Stats R package v.4.3.1）。对于所有分析，P <0.05被认为具有统计学意义。调查人员并未对不同的群体视而不见。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。