我们研究了来自9种神经病理学证实的FTLD-TDP C型，三例FTLD-TDP A型和三例FTLD-TDP B型B型FTLD-TDP病例的新鲜冷冻，验尸。在扩展数据表1中显示了四个用于冷冻EM的FTLD-TDP C型患者的临床病理细节。所有FTLD-TDP C型C型患者均具有野生型Anxa1111和语义变体主要渐进性失语症的临床表现。所有患有FTLD-TDP A型的患者携带的GRN变体与FTLD-TDP A型相关，并具有行为变异FTD（BVFTD）的临床表现。FTLD-TDP B型患者中有两名在C9ORF72中携带六核苷酸重复扩张，并进行了BVFTD的临床表现。FTLD-TDP B型的第三名患者具有野生型C9ORF72和ALS和BVFTD的临床表现。组织样本来自东京都会科学学院的大脑和神经科学系；国家医院组织Shimofusa精神病学中心精神病学系；东京大都会老年医学和老年病学院神经病理学系；印第安纳大学医学院的痴呆症实验室的大脑图书馆。他们在这项研究中的使用得到了每个机构的道德审查程序的批准。从患者的下一个亲属中获得了知情同意。

　　全外观测序目标富集使用了SureselectTX人类全符号库（V6; 58-MB对； Agilent），并使用Hiseq 4,000（S×75 BP配对 - 末端配置; Illumina）进行了高通量测序。如前所述53，重复提出的PCR进行了片段长度分析，以筛选C9ORF72基因内的六核苷酸重复扩展。使用从脑组织中提取的50 ng的基因组DNA，使用了旨在扩增焦虑基因的编码外显子和相应侧翼内含子区域的寡核苷酸。如前所述54，放大产物被纯化并接受直接的二氧氧化测序。

　　如前所述3进行了从新鲜冻干前额叶和颞皮层中提取淀粉样细丝。使用含有10 mM Tris-HCl（pH 7.5），0.8 M NaCl，10％蔗糖和1 mM乙烯乙二醇 - 乙二醇 - 乙二醇 - 乙二醇 - 乙二醇 - 乙二醇 - 乙烯 - 氨基乙基乙基）（β-氨基乙基）-n，n，n，n，n'，n''，n'''，使用灰质（v/w）萃取缓冲液中的多元（v/w）提取缓冲液进行了溶剂和均质。将25％的sarkosyl溶液添加到匀浆中，达到2％sarkosyl。将样品在37°C下与轨道振动在200 rpm处孵育1小时。孵育后，将样品以27,000克离心10分钟。将产生的上清液以166,000克离心20分钟。将上清液丢弃，并将含有细丝的颗粒重悬于6 mL G -1组织中的萃取缓冲液的6 ml G -1组织中，含有1％的sarkosyl，在50％振幅下超声处理5分钟（Qsonica Q700），然后用相同的缓冲液和在37°°C下在相同的缓冲液中进行40分钟的稀释度，并在200°°C下进行200分钟，在200°°C下进行。然后将样品以17,000克离心5分钟，并丢弃颗粒。将上清液以166,000克进一步离心20分钟，然后在1 ml G -1的提取缓冲液中重悬于1 ml G -1组织中，含有1％sarkosyl，在37°C下在200 rpm时孵育1 h。将样品以166,000g离心20分钟，并将最终颗粒重悬于30μlG-1组织中，为20 mM Tris-HCl（pH 7.4）（pH 7.4）和150 mM NaCl，在50％的幅度（QSonIONA Q700）以5分钟（Q700）进行超声处理5分钟。每个冷冻EM样品使用一到两克组织。所有离心步骤均在25°C下进行。

　　对于免疫组织化学，用10％缓冲的福尔马林固定脑半球，切片并嵌入石蜡中。将脱蜡的切片（8 µm厚）在10 mm柠檬酸钠缓冲液中在105°C中孵育10分钟，并用95％甲酸处理5分钟。将切片洗涤并用PBS中的10％FC封闭。对于比色免疫组织化学，将切片与TDP-43-PS409/ps410（CAC-TIP-PTD-M01A，Cosmobio; 1：1,000）的一抗孵育过夜，以阻止缓冲液。然后将切片洗涤并用生物素化的二抗孵育2小时。使用ABC染色试剂盒（Vector）检测到标记，该试剂盒（Vector）具有3,3'-二氨基苯胺（DAB）。切片用血久毒素染色。For multiplexed fluorescent immunohistochemistry, sections were incubated overnight with primary antibodies to TDP-43-pS409/pS410 (CAC-TIP-PTD-M01A, CosmoBio; 1:200 or 1:1,000) and ANXA11 residues 1–180 (10479-2-AP, Proteintech; 1:200 or 1:1,000) in blocking buffer.洗涤切片，并添加与Alexa Fluor 488、568或594（A11008，A32723，A11004和A32740，Thermo）偶联的荧光二级抗体，然后添加2 h。然后将切片用0.1％Sudan Black B（Fujifilm Wako）处理10分钟，并用Vectashield安装4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI； Vector Laboratories）或用DAPI（Thermo）延长黄金。

　　对于免疫印迹，通过与十二烷基硫酸锂样品缓冲液（Thermo）在95°C下孵育5分钟，从相等量的初始灰质中提取的细丝被拆卸和变性。然后使用12％BIS-Tris凝胶（NOVEX）在200 V处解决样品45分钟，并转移到硝酸纤维素膜上。Membranes were blocked in PBS containing 1% BSA and 0.2% Tween for 30 min at 21 °C and incubated with primary antibodies to TDP-43-pS409/pS410 (CAC-TIP-PTD-M01A, CosmoBio; 1:3,000), ANXA11 residues 3–15 (TA302761, OriGene; 1:2,000), ANXA11 residues 1–180（10479-2-AP，ProteIntech; 1：1,000）和Anxa11残基276–505（STJ29559，St John's Laboratory; 1：1,000）在21°C下1小时。然后将膜用含有0.2％Tween的PBS洗涤3次，每次洗涤5分钟，并与与Starbright Blue 520（Bio-Rad），Dylight 800（细胞信号技术）或辣根过氧化物酶（THERMO）结合的二级抗体（Brelight 800）孵育。然后将膜洗涤3次，与增强的辣根过氧化物酶偶联的二抗的化学发光检测试剂（Cytvia）孵育，并使用Chemidoc MP（Bio-Rad）成像。

　　For immuno-EM, filament extracts were deposited onto carbon-coated 300-mesh copper or nickel grids (Nissin EM and Electron Microscopy Sciences, respectively), blocked with 0.1% gelatin in PBS, and incubated with primary antibodies to TDP-43-pS409/pS410 (CAC-TIP-PTD-M01A, CosmoBio; 1:50) and ANXA11残基1-180（10479-2-AP，蛋白技术； 1:50）在21°C时含有0.1％明胶的PBS中，持续3 h或4°C，过夜。在PBS中用0.1％明胶洗涤后，将网格与连接至10 nm或6 nm的金颗粒（1:20，cytododiagnostics和1:40，电子显微镜科学）的二级抗体在PBS中孵育，其中包含0.1％明胶在21°C的PBS中。然后将网格用2％乙酸铀酰或纳米烷（TED Pella）染色。使用80 KEV JEOL JEM-1400和配备CCD摄像机的Fei Tecnai Spirit Bio-Twin电子显微镜获取图像。

　　从0.1 g组织中提取的颗粒状细丝通过重悬于100μl的六氟异丙醇中，并在37°C下孵育过夜，并在200 rpm摇动，并在37°C中孵育过夜。然后将样品在50％的幅度（Qsonica Q700）中超声检查5分钟，并以166,000克离心15分钟。通过真空离心（Savant）收集并干燥含有拆卸细丝的上清液。将8 M尿素的溶液在50 mM碳酸氢铵中添加到干燥的蛋白质样品中，然后在56°C下用5 mM二硫苏糖醇在56°C下降低，并在室温下在黑暗中用10 mM iodoacetamide烷基化30分钟。将样品用50 mM碳酸氢铵稀释至1 M尿素，并在25°C下用辣椒蛋白（Promega）消化过夜。用甲酸将胰凝乳蛋白酶灭活至终浓度为0.5％。然后将样品以16,000克离心5分钟。使用定制的C18停止和GO萃取（阶段）尖端（3 m empore）将所得的上清液脱盐和分级，并装有多孔的寡核R3树脂（Thermo Scientific）。用含有0.5％甲酸的80％乙腈（MECN）平衡阶段尖端，然后是0.5％甲酸。在10 mM碳酸氢铵中，MECN浓度从5％增加到60％，并通过真空离心（Savant）部分干燥，将结合的肽逐步洗脱。

　　使用全自动自动化的3000 RSLC Nano System（Thermo Scientific），通过液相色谱法（LC -MS/MS）通过液相色谱法分析分级肽。用pepmap100 c18 5-μm0.3×5 mm纳米陷阱柱（Thermo Fisher Scientific）和Aurora Ultimate TS75μm×25 cm×1.7μmC18柱（Ionopticks）使用0.1％的酸（Ionopticks），将肽捕获0.1％级酸（ionopticks），并以0.1％的形式（Bufferic a Bufferer a bufferer Air酸（iionopticks））b）流速为300 nl min -1。洗脱的肽是直接通过纳米式离子源引入的Q Q Quartive Plus杂种四极杆轨道质谱仪（Thermo Scientific）。MS1光谱以70,000的分辨率，质量范围为380–1,500 m/z，AGC目标1×106，最大值为100 ms；随后是15个最强烈离子的MS2采集，分辨率为17,500。使用了27％的归一化碰撞能，隔离窗口为1.2 m/z。动态排除设置为30 s。

　　使用Mascot搜索引擎（Matrix Science v2.4），针对人类审查的数据库（UNIPROT；下载2019）搜索LC – MS/MS数据。将数据库搜索参数设置为10 ppm的前体公差，片段离子质量公差为0.1 Da。最多允许三个遗漏的胰凝乳蛋白酶裂解。氨基甲米甲基半胱氨酸被视为静态修饰。精氨酸柠檬粉和甲基化以及天冬酰胺和谷氨酰胺脱氨酸被指定为可变修饰。支架（V4； Proteome软件公司）用于验证基于MS/MS的肽和蛋白质鉴定。使用脚手架碎片表手动确认了含有精氨酸柠檬酸和甲基化的MS/MS光谱。

　　将细丝提取物与0.4 mg ml -1 prinase（Sigma）在21°C下孵育1小时。将样品以3,000克离心15 s，并保留上清液。使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher）（Thermo Fisher），将三个微量的样品应用于发光的1.2/1.2/1.2/1.3μm孔镀膜300英寸金网格（Quantifoil），并在液体乙烷中陷入困境。使用配备有K3检测器（GATAN）的300 KEV Titan Krios显微镜（Thermo Fisher）和以20 eV的缝隙宽度运行的GIF-量词能量过滤器（Gatan）获取图像。在图像采集期间，使用了EPU软件（Thermo Fisher）内的无像差图像移位。扩展数据表2提供了更多详细信息。

　　电影框架是通过RIEN-4.0或RELION-5.0中的运动校正程序（参考文献55）中的运动校正程序进行了校正，对齐，加权并汇总的。通过运动校正的显微照片用于使用CTFFIND-4.1（参考文献56）来估计对比度传递函数（CTF）。所有随后的图像处理均使用RIEN-4.0或RELION-5.0中的螺旋重建方法进行（参考文献57,58）。手动挑选细丝。进行无参考的2D分类以删除不包含细丝的图像坐标。如前所述59，通过从2D类平均产生正弦图，从头产生了初始的3D参考模型。进行3D自动重新启动，以优化螺旋扭曲，然后进行贝叶斯抛光和CTF细化5,5,60。3D分类用于进一步删除不包含细丝的图像坐标，以及具有替代构象的片段。为了实现更高的分辨率，还使用3D分类来消除与最终重建一致的低分辨率细丝段。然后重复3D自动再填充，贝叶斯抛光和CTF细化。最终的重建使用标准的后处理程序进行了锐化。总体分辨率是从两个独立精制的半映射之间从0.143的傅里叶壳相关性估计的，使用相随机化来纠正宽敞的柔软，软边的溶剂Mask61的卷积影响。使用相同的相对性过程获得局部分辨率估计值，但具有在整个地图上移动的柔软球形掩码。使用Relion Helix工具箱施加了螺旋对称性。扩展数据表2提供了更多详细信息。

　　The ANXA11 chain was identified by deriving the 11-residue sequence motif G[NMQ]X[SA][EDRKQN]M[SA][SAG]X[WF][SAG] from the high-resolution cryo-EM reconstructions by inspection of well-resolved densities for amino acid side chains.然后将此基序用于组合的UniprotkB和瑞士 - 推杆参考蛋白质组。该搜索返回了Anxa11，因为单人击中并使Anxa11的残留物L39-Y74内置在NOVO的Cryo-Em重建中。我们通过使用ModelAngelo62的自动机器学习方法来计算初始原子模型而不提供参考序列，从而确认了这一结果，该原子模型也返回了Anxa11的L39-Y74。TDP-43链的原子模型及其替代构象是从头构建的。完整的原子模型是使用最佳分辨率的地图在COOT63中的真实空间中进行的。使用分子动力学进行重建，在Isolde64中进行。使用REFMAC5（参考文献65）在傅立叶空间中精制模型，并使用ServalCat66定义了适当的对称约束。为了确认没有过度拟合的情况，该模型被摇动，使用RefMac5在上半场的傅立叶空间中精制，并与下半场地图进行了比较。使用Molprobity67验证了几何形状。分子图形和分析是在Chimerax68中进行的。模型统计数据在扩展数据表2中提供。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。