补充信息中列出了本研究中使用的抗体。

　　对于所有小鼠实验，每组使用至少四只小鼠。对于更复杂的模型，我们使用更多的动物来补偿预期可变性的增加。将小鼠随机分配到治疗组。对于代谢表型，在测量体重匹配体重匹配的队列后，将小鼠分组分组。

　　将C57BL/6J，FVB/NJ，TCRA - / - 和RAG2 - / - ，RAG2 - / - OT-I和B6.SJL-PTPRCAPEPCB/BOYCRL小鼠育成并容纳在Francis Crick Institute Antile Antival。点头/shiltj小鼠购自查尔斯河实验室。动物实验受到弗朗西斯·克里克（Francis Crick）动物福利和道德审查机构的道德审查，并受到英国家庭办公室项目许可证P319AE968的监管。所有小鼠均根据英国内政部指南置于条件下。从07:00到19:00，将老鼠保持在12-H的日子：夜间周期。随意提供食物和水，并以55％的湿度将房间保持在21°C。对于三氯蔗糖处理，将三氯蔗糖（默克）（默克）溶于饮用水中，最终浓度为0.72或0.17 mg ml -1，如所示。将三氯蔗糖溶液通过0.2μm滤光片过滤，然后再添加到饮用瓶中。每周一次或两次更换三氯蔗糖溶液，并通过饮用瓶重量的变化来衡量三氯蔗糖的消耗。遵循类似的程序，准备对小鼠提供的任何解决方案。所有程序均遵循1986年《动物（科学程序）法》和《 2010年欧盟指令》。

　　食物摄入，溶液摄入和体重。

　　单独笼子的雄性C57BL/6J 7-8周龄的同窝仔用于测量体重，食物摄入量和溶液摄入量。每周测量体重和食物摄入量。通过测量溶液的重量，每周两次测量溶液摄入量。每3-4天进行每次测量后，提供新的解决方案。

　　雄性小鼠分别容纳在间接量热法的代谢笼中（TSE PENOMASTER，TSE系统），经过48小时的适应周期，我们不断测量O2的消耗，CO2的产生，呼吸汇率（RER），能量支出和近距离均为15的均值（RER），呼吸比率（RER），水平量为15，均为15次数）。108 h。使用Echo-MRI设备（Echo-MRI）测量身体成分。这项动物研究得到上巴伐利亚政府（德国）的动物伦理委员会的批准。

　　分别容纳7-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠，以超过12周的含量为水或不同的甜味剂。在接受2 mg kg -1葡萄糖的口服烤面包之前，将食物剥夺了6小时（Merck，158968）。在口腔堵塞之前，使用葡萄糖（Accu-Chek）测量血糖，每30分钟，最多每30分钟，延伸到120分钟。

　　粪便样品是从单独笼中的同窝仔的新鲜收集的C57BL/6J雄性小鼠，年龄为8周，暴露于不同的饮酒溶液中。在治疗2周和12周后收集样品。为每只小鼠收集至少两个粪便颗粒，将冷冻在液氮中，并在-80°C下储存直至提取。使用Qiaamp PowerFecal DNA试剂盒分离粪便DNA（Qiagen，12830-50）。通过基于Illumina 16S元基因组测序方案（150444223 Rev. B）对PCR进行索引，制备了16S扩增子进行测序。简而言之，将每个样品的2μL与3.25μlH2O，6.25μl2×Neb Q5高效率DNA聚合酶主混合物（M0492L）和1μL的10 µM UDI引物结合在一起，来自SET NEXTERA IDT-8NT（384 IndexES）。将样品在95°C下孵育3分钟，然后在95°C的10个循环中孵育30 s，55°C 30 s，72°C 30 s，然后在72°C的最终延伸持续5分钟。

　　Beckman Coulter Spriselect（B23319）以0.8倍的比例进行了基于珠子的清理。使用Agilent 24200挂号上的D1000屏幕截图评估了纯化的库的质量。图书馆在Illumina Miseq平台上进行了测序。使用600个循环Miseq试剂盒V3产生2×300配对末端读数。用20％的phix以8 pm的浓度加载库。

　　使用DADA2（V1.18）44处理FASTQ文件，将前向（分别反向）截断为280和210个碱基，并分别将它们缩小为17和21个基础，最多两个预期错误。使用SILVA数据库的V132进行了分类单元和物种分配。然后在R v4.0.3（参考文献45）中分析处理后的数据，Thyloseq封装46将计数数据汇总到属水平。使用DESEQ2（V1.30（参考文献47））来估计实验组之间的对数折叠变化和P值，同时考虑了跨越实验组的观察到的批处理效应。

　　提供了8-10周龄的C57BL/6J RAG2 - / - 雄性和雌性小鼠的水或三氯蔗糖（0.72 mg ml -1或0.17 mg ml -1），持续2周。然后将来自C57BL/6J供体的CFSE染色的淋巴细胞（根据制造商的指示染色，生物本）在PBS中以每只小鼠的1×106细胞静脉注射。在第3天，注射后脾脏通过流式细胞仪评估了对供体T细胞的CFSE稀释。

　　将小鼠暴露于饮用水中2周前2周的饮用水中的水或三氯蔗糖（0.72 mg ml -1），并暴露于溶液之前，直到实验结束。

　　pdx1-cre;将表达IRFP39的KRASG12D PDAC细胞皮下注入FVB/NJ或C57BL/6J RAG2 - / - 小鼠的左侧，每只小鼠在PBS中以1×106个细胞为单位。体内成像对增长进行了监测，并在英国内政部和动物许可证的规定，在人道的终点处采取小鼠。人道终点的最大肿瘤大小为1.2厘米，肿瘤溃疡或减肥10％，如英国内政部项目许可证P319AE968所授权。这些限制均未超过。

　　对于体内成像，使用LICOR ODYSSEY PEARL成像仪测量IRFP荧光（激发：685 nm和发射：730 nm），并使用Image Studio V5（LICOR）进行分析。

　　将重悬于PBS的EL4-OVA细胞（每只小鼠1×106个细胞）皮下注射到C57BL/6J受体小鼠的左侧，要么暴露于水或三氯甘蔗糖（0.72 mg ml-1或0.17 mg ml-1或0.17 mg ml-1）2周之前，要在挑战之前和实验结束，直到实验后10天。消化肿瘤，并分析针对Siinfekl肽刺激的OVA特异性CD8+ T细胞和IFNγ产生，然后进行细胞内细胞因子染色。在BD LSR Fortessa和BD Facsymphony上采集了样品。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　通过将C57BL/6J的受体暴露于水或三氯蔗糖（0.72 mg ml-1）中，进行2周，进行OT-I肿瘤抑制测定2周，然后将0.3×106 TCR- TCR-OT-IT细胞静脉注射来自RAG2-/ - OT-OT-OT-I-I-ot-ot-i-ot-i-i Donor小鼠。第二天，将小鼠皮下注射在左侧注入EL4-OVA癌细胞（每只小鼠1×106个细胞）。通过Calliper测量值监测增长，并在英国内政部和动物许可证的规定，在人道端点处进行小鼠。将肿瘤体积计算为体积=（长度×width2）/2，其长度为最长的直径和宽度，作为垂直肿瘤直径。人道终点的最大肿瘤大小为1.2厘米，肿瘤溃疡或10％的体重减轻，如英国内政部项目许可证P319AE968所授权。这些限制均未超过。

　　雄性C57BL/6J小鼠（8-10周）在感染前给予水或三氯蔗糖（0.72 mg ml -1），并在整个实验过程中保留在溶液中。三氯蔗糖冲洗实验涉及暴露于水3周的小鼠，在注射前2周暴露于Subaralose的0.72 mg ml -1的小鼠，并在实验结束时保持在三氯蔗糖上，然后在LMOVA挑战之前用水1周，在实验结束时进行了WashOut组（图3M）。简而言之，将小鼠静脉注射，并在感染后7天内对lmova（每只小鼠1×105个菌落形成单元）进行安乐死。分析脾细胞的存在是否存在OVA特异性CD8+ T细胞（使用荧光组合的MHC Tetramer Complex，美国贝勒医学院）和CD8+ T细胞的细胞因子生产，以反应Siinfekl肽重新刺激，然后是细胞内细胞因子染色。在BD LSR Fortessa和BD Facsymphony上采集了样品。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　在感染后第3天测量细菌负荷。分离并称重脾脏和肝脏，然后进行组织破坏。将脾脏和肝匀浆重悬于PBS中，并在PBS中进行1/10个系列稀释液。将每个连续稀释的五十微升铺在大脑心脏输液板上，并在37°C下放入细菌孵化器中过夜。第二天计数菌落形成单元的数量，并标准化为组织重量。

　　在T细胞转移前2周，直到实验结束，六到八周龄的雄性C57BL/6J TCRA - / - 小鼠的Ad trbitum均为水或三氯蔗糖（0.72 mg ml-1或0.17 mg ml-1）。每只小鼠注入0.5×106个细胞的CD45.1+CD4+CD45RB+T细胞。通过细胞内细胞因子染色评估第21天的炎症，然后进行流式细胞仪分析。人道终点是英国内政部项目许可证P319AE968授权的最大体重减轻15％和慢性腹泻。这些限制均未超过。

　　女性点头/shiltj购自查尔斯河实验室。从8周龄开始，给出了年龄匹配和体重匹配的小鼠的水或三氯蔗糖（0.72 mg ml-1或0.17 mg ml-1）。为了监测1型糖尿病的发育，每周使用葡萄糖（ACCU-CHEK）监测血糖。第二天第二次测量了非固定葡萄糖水平超过13.9 mmol L-1的小鼠，并且连续血糖超过13.9 mmol L-1的小鼠被认为是糖尿病患者。人道端点被定义为英国内政部项目许可证P319AE968中授权的连续非快速血糖测量值超过13.9 mmol L-1。这些限制均未超过。

　　在LPS挑战之前和直到实验结束之前，将年龄8-10周的男性C57BL/6J小鼠随机分配给水或三氯蔗糖（0.72 mg ml -1）。将小鼠从大肠杆菌（0111：B4 Sigma L4391）的LPS腹膜内注射，剂量为0.1 mg kg -1。挑战后3小时将小鼠安乐死，并通过涂有EDTA涂层管中的心脏穿刺收集血液。

　　C57BL/6J小鼠（一只年龄为8-10周的雄性小鼠和一只年龄为8-10周的雌性小鼠）被给予三氯蔗糖（0.72 mg ml -1）或余量2周，直到实验结束。然后将小鼠腹膜内注射持久的IL-4复合物（5 µg IL-4（peprotech）：25 µg ML-1抗IL-4单克隆抗体，克隆11B11; bioxcell）或PBS（对照）每隔第二天。第二次注射后牺牲小鼠。通过将5 ml PBS注入腹膜腔，收集腹膜巨噬细胞。收集并染色以进行流式细胞仪。在BD LSR Fortessa上采集了样品。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　将雌性C57BL/6J小鼠（8-10周）随机分配给2组：水处理或三氯蔗糖处理（0.72 mg ml -1）。在免疫之前，直到实验结束之前，将小鼠暴露于三氯蔗糖中2周。在HBSS中制备SRBC（在线抗体，Cat。Abin770402），在PBS中用2×109 SRBC腹膜内对小鼠进行了腹膜内免疫。通过B220（克隆RA3-6B2），GL-7（克隆GL7）和CD95（克隆SA367H8）的细胞表面染色（克隆RA3-6B2）（克隆SA367H8），在第7天的脾脏中分析了生发中心B细胞。在BD LSR Fortessa和BD Facsymphony上采集了样品。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　从健康的，未固定的个体中收集人外周血成肝素化的吸尘器（Greiner Bio-One）。通过将全血（1：1）分离到淋巴管（Stemcell Technologies）中，并在室温下以805g离心20分钟，从而分离单核细胞。使用磁性微粒（Miltenyi Biotec；CAT。130-096-495）将人CD8+ T细胞在下游分离。将分离的CD8+ T细胞（1.0×106 mL-1）用CFSE（Biolegend）染色，并用板结合的抗CD3（2μgml-1; hit3a，biolegend）和游离抗CD28（20μgml-1; CD28.2，Biolegend）在NASS-0.5中激活5IMDM（Gibco）在37°C下在5％的二氧化碳中持续3天。3小时后，培养基添加了10％Hyclone胎牛血清。72小时后，收集细胞并用生存力染料DRAQ7（Biostatus）染色。获取细胞（Novocyte，Agilent），并使用FlowJo版本10（Treestar）进行了分析。

　　参与者是从英国威尔士斯旺西大学的员工和学生群体招募的。潜在参与者通过与当地临床研究机构联系，对道德委员会批准的广告做出了回应。临床研究机构通过知情书面同意书对响应经过道德认可的参与者信息表进行了监督，该信息解释了这项研究。参与者的招聘是由斯旺西大学联合临床研究机构进行的，没有选择偏见。知情的书面同意书，并获得了威尔士研究伦理委员会6（13/WA/0190）的伦理批准。

　　从脾脏和外周淋巴结中分离CD8+ T细胞和CD4+ T细胞，制备成单细胞悬浮液，并裂解红细胞（10×RBC裂解缓冲液，Biolegend）。通过负分离试剂盒（Stemcell Technologies）和制造商的方案分离T细胞。然后，使用板块结合的抗CD3和T细胞培养基（TCM）（IMDM，10％胎牛血清（FBS），1％青霉素 - 链接受霉素和50μMβ-coccapto-Mercaptoetoethanol）中的T型结合抗CD3和抗CD28抗体进行激活和培养。

　　小鼠PDX1-KRASG12D胰腺癌细胞系源自PDX1-CRE胰腺癌模型的原发性胰腺肿瘤。细胞在DMEM，10％FBS和1％青霉素 - 链霉素中保持培养。EL4-OVA胸腺瘤细胞系在TCM中保持为0.4 mg ml-1的G418（Roche Diagnostic GmbH）。将所有细胞在37°C和5％CO2加湿的孵化器下孵育。

　　根据制造商的规程，用Biolegend或VPD450染料（BD地平线）对CFSE进行染色。然后，用抗CD3克隆145-2C11（2μgml-1）和抗CD28克隆37.51（1μgml-1）激活T细胞，除非另有指定，否则有或没有指定的甜味剂，在37°C，37°C，37°C，5％CO2 Humidified Ingubator进行流动式分析中进行流量分析。对于IL-2（Peprotech）补充，在抗CD3/CD28的存在下，将IL-2在20 ng ml-1处添加到选定的井中。在存在抗CD3/CD28的情况下，通过添加125μgml-1的离子霉素（Sigma）来进行离子霉素响应实验。所有功能级抗体均购自Thermo Fisher Scientific Ebioscience。

　　通过补充100 ng ml-1的IL-2或高剂量的PMA（10 ng ml-1）和iOnyomycin（500 ng ml-1）或低剂量的PMA（1 ng ml-1）和高剂量的PMA（1 ng ml-1）和离子菌素（500 ng ml-1）和离子霉素（500 ng ml-1），可以实现与TCR非依赖性的增殖。允许T细胞增殖3-4天。

　　Th1细胞。使用制造商的指示分离幼稚的CD4+ T细胞，并通过在涂有抗CD3（5μgml-1）和抗CD28（2μgml-1）的24孔组织培养板中每孔接种2×106细胞。TCM用IL-2（20 ng ml-1，peptrotech），IL-12（40 ng ml-1，peptrotech）和抗IL-4（Biolegend，克隆11B11，504102）补充。用PMA-离子霉素 - 高尔戈斯托克鸡尾酒重新刺激CD4+ T细胞，然后在分化后3天的IFNγ（克隆XMG1.2）和TBET（克隆XMG1.2）和TBET（克隆XMG1.2）和TBET（克隆4B10）进行表面和细胞内细胞因子染色。

　　CD8+ TEFF细胞。使用制造商的方案将幼稚的CD8+ T细胞分离，并使用涂有抗CD3（5μgml-1）和抗CD28（2μgml-1）的96孔板的250,000个细胞激活。TCM补充了IL-2（20 ng mL-1）。重新刺激CD8+ T细胞，然后进行表面染色和细胞内细胞因子染色，以进行IFNγ表达。

　　来自或不含0.5 mM磺糖糖的TCM中的siinfekl肽（10μgml-1）在TCM中与Siinfekl肽（10μgml-1）在体外与Siinfekl肽（10μgml-1）在体外膨胀的OVA特异性CD8+ TEFF细胞在体外膨胀3天。使用淋巴结解员M细胞分离密度离心方法（Cedarlane Labs）选择活淋巴细胞，然后与用VPD450（BD Biosciences）染色的EL4-OVA细胞共培养，以1：1的比例开始，并以1：1的比例稀释至32：1（El4-ova：el4-ova：ot-i）。根据制造商的说明，通过膜联蛋白V和碘化丙啶（Invitrogen，Ebioscience）染色评估了死去的EL4-ova细胞的百分比。在BD LSR Fortessa上采集了样品。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　将13毫米硼硅酸盐玻璃盖玻片（厚度为1.5 mm，VWR）放在24孔板中，并在室温下用50 mg ml-1的聚赖氨酸（Sigma）涂有30分钟，然后在一次水洗时涂上，然后进行一次洗涤。轻轻地将2000万个幼稚的T细胞轻轻放置在涂层的载玻片上，并在加湿的37°C孵化器中连接30分钟。用抗CD3-Biotin（5 mg ML-1）和链霉亲和蛋白酶（20 mg ML-1）在37°C激活T细胞。吸气无附件的细胞并加入4％PFA，并在室温下固定10分钟，然后进行一次PBS洗涤和抽吸。用0.4％Triton X-100/PBS/10％牛血清白蛋白溶液阻止样品。将PLCγ1（Santa Cruz，克隆E-2，SC7290）的一抗在染色缓冲液（0.4％Triton X-100/PBS/2％牛血清白蛋白）中稀释，并在室温下在黑暗中孵育1小时。PBS洗涤后，将荧光继发抗体（Alexa488山羊初级抗体抗小鼠IgG，Abcam 150113）在染色缓冲液中以1：500稀释，并在室温下在室温下再孵育1小时。PBS洗涤后，将样品与DAPI溶液（PBS中的1：10,000稀释； BD Pharmingen）在室温下孵育5分钟。将载玻片用PBS洗涤一次，倒置并放置在超砂光显微镜载玻片上的防抗固定介质（Vectashield）上（Thermo Scientific，12372098）。将载玻片用盖玻片盖玻片密封剂密封。使用ZEN（v2.3）程序在Zeiss直立的710上拍摄图像，该程序具有63倍油的目标和1.4 Na。488和405 nm激光器用于激发，并收集Z堆务为每个像素16位（平均尺寸为240×240像素）。使用IMARIS v9.5.1软件使用卷应用程序分析数据。

　　骨髓来源的巨噬细胞是由用PBS冲洗的股骨产生的。使用10×RBC裂解缓冲液（Biolegend）裂解红细胞，并将其余细胞以每10 cm的5×106细胞为培养皿，在IMDM中以10％FBS，1％Pen/strep，50μmβ-甲醇和25 ng ml-1的IMDM中的IMDM和Ml-CSF（PepRotech）的25 ng ml -1铺板。分化五天后，在0.5 mm的最终浓度下再增加甜味剂2天。LPS（Sigma E. coli O111：B4 LPS25）在第7天分化时以1 ng ml-1和Bd Golgistop（1：1340稀释）的最终浓度为4 h，持续4 h，然后进行表面和细胞内细胞因子染色，用于肿瘤坏死因子（TNF）（TNF）（TNF）（TNF）（Clone Mp6-X 22222222222222222）和IL。在BD LSR Fortessa和BD Facsymphony上采集了样品。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　将单细胞悬浮液染色，以在4oC时在PBS中的表面标记染色20分钟。按照制造商的说明，使用FOXP3/转录染色缓冲液集（Invitrogen，Ebioscience）评估细胞内蛋白（细胞因子）。将细胞透化30分钟，并在4°C下至少染色至少1小时。荧光色素购自Biolegend，Ebioscience（Thermofischer Scientific），BD Pharmigen或Tonbo Scientific。所有表面氟化抗体均以1：300的稀释度使用。如前所述4H，使用PMA（Sigma-Aldrich），离子霉素（Sigma-Aldrich）和Golgistop（BD Biosciences）进行重新刺激4小时。对于使用卵蛋白的抗原特异性反应，使用Siinfekl（由肽化学设施产生的OVA257-264，Francis Crick Institute产生的OVA257–264）肽用于重新刺激单细胞悬浮液（10 µg Ml-1用Golgistop（BD Biosciences）进行6 h cy的单细胞悬浮液（10 µg mL-1），并在表面播出。所有细胞内抗体均以1：250的稀释度使用。使用KB-OVA-PE染色（美国贝勒医学院）和表面标记物进行30分钟，然后立即获取，将OVA特异性CD8+ T细胞区分开。使用Invitrogen，Ebioscience的可固定活力染料Efluor780区分死细胞。使用FOXP3转录染色缓冲液集（Invitrogen，Ebioscience）固定单细胞悬浮液并通透。在BD LSR Fortessa和BD Facsymphony上采集了样品。使用FlowJo（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　如图所示，使用Indo-1AM或Fluo-3am作为探针进行钙通量测定。

　　Indo-1am。将淋巴结变成单细胞悬浮液，并将FLT3L生成的树突状细胞以2μM的最终浓度浓度的INDO-1AM（BD Biosciences）在RPMI中孵育，并补充了50μMβ-凝集乙醇的RPMI，在37°C，5％Coutified Incorator Incorator Incorator Incorator Incorator 30分钟中，在30分钟内孵育30分钟。洗涤淋巴细胞并以1,300 rpm的速度旋转5分钟，然后用CD4+（克隆GK1.5），CD8+（克隆2.43），B220（克隆RA3-6B2； Invitrogen Ebioscience）进行细胞表面染色，并使用可固定的EBISCICE（Invitbience）（Invitrogen Ebioscience）和可容纳的细胞进行区分。细胞悬浮液以每毫升3×106的细胞旋转并重悬于上述培养基中，并保持在冰上。CDC培养物对CD11C（克隆N418），B220（克隆RA3-6B2），MHCII（克隆AF700），SIRPα1（克隆p84）和XCR1（克隆ZET）染色。在LSR Fortessa（BD Biosciences）中获得之前，将细胞加热至37°C 5分钟。在基线读数中加入抗CD3 – BIOTIN（5μgml-1）（克隆145-2C11； Invitrogen Ebioscience），持续1-2分钟，然后在链霉亲和素（Invitrogen）中为20μgml-1。对于B细胞，将20μgml-1抗IGM（Jackson Immunoresearch，115-006-020）注入基线读数后。基线读取后，将树突状细胞样品注入1 mM ATP。钙通量由400 nm（绑定）到500 nm（免费）读数之间的比率确定。在BD LSR Fortessa上采集了样品。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。为了量化响应者的百分比，在添加链霉亲和蛋白250 s后将细胞门控。

　　Fluo-3am。单细胞悬浮液从淋巴结获得。将细胞用钙指示剂Fluo-3am（ABCAM）加载如下：在存在或不存在三氯济康拉酸酯的情况下恢复在TCM中的细胞在20％（w/v）Pluorinic F-127 Aid Adic Adic Ardiet（Merck，p2443 Minciub）中，在20％（w/v）的20％（w/v）中孵育30％（v/v），在20％（w/v）中孵育。通过两次无钙PBS的连续洗涤去除过量的Fluo-3am。最终，将细胞重悬于无钙的PBS中，这些PBs补充了10 mM葡萄糖，2 mM谷氨酰胺和50μMβ-甲醇乙醇并保持在冰上。使用LSR Fortessa在获取前将细胞加热至37°C 5分钟。记录基线读数1-2分钟，然后用1μMThapsigargin（Merck）或100 ng ML -1 Ionymycin（Merck）刺激细胞内钙释放。为了进行定量，使用FlowJo（Treestar）动力学选项绘制了Fluo3强度，并具有平均值和高斯平滑。然后选择相同的时间长度的基础和处理（thapsigargin或离子霉素）条件，并获得曲线下的面积。

　　在补充10％FBS，50μMβ-甲醇和1％青霉素 - 链霉素的RPMI中培养Jurkat T细胞。如所示，在存在不同甜味剂的情况下，通过将细胞与Casy计数器计数来测量增殖。

　　三氯蔗糖在体外实验中洗涤。对于急性三氯蔗糖的暴露，在存在或不存在0.5 mM三氯蔗糖的情况下培养Jurkat T细胞5天。对于慢性暴露：三氯蔗糖在开/开/关，尤卡特T细胞预先暴露于0.5 mM三氯没兰其此类知，持续2周，然后去除三氯蔗糖（三氯蔗糖开）或连续的三氯蔗糖暴露（so cons/on）。

　　用抗CD3（2μgml-1）和抗CD28（1μgml-1）激活3天的T细胞从6至10周之间的C57BL/6J雄性小鼠分离出来。然后将细胞染色以染色蛋白质表面标志物和生存力染料，然后在0.02％的pluronic F-127（默克，p2443）的情况下，在RPMI中加载了相敏感的膜探针2μMDI-4-ANEPPDHQ（ANEQ，Thermo Fisher，D36802）。在37°C下进行30分钟，然后在室温下进行15分钟。将细胞保持在37°C，并在获取前保护不受光的保护。使用BD LSR Fortessa在570 nm（高阶）和610 nm（低阶）下测量ANEQ荧光发射。使用FlowJo V10（Treestar）分析流式细胞仪数据。

　　使用补充1％SDS和磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（La Roche）的RIPA缓冲液（Millipore）裂解细胞，在95°C下进行变性，并在Nupage Polyacrylamide Pre-Cast Pre-Cast Pre-Cast Pre-Cast Pre-Cast Pre-Cast凝胶（Invitrogen，Thermo Fisher科学）上溶解。将凝胶转移到硝酸纤维素膜（GE Healthcare）上。如手稿中所示，对T细胞或Jurkat T细胞裂解物进行了探测。抗体部分列出了初级和二抗的工作稀释。源数据文件中，所有未编写和未经处理的扫描和图像。

　　在在存在或不存在0.5 mM三氯甘蔗糖的情况下，在补充了10％FBS，50μMβ-甲醇和1％青霉素 - 链霉素的RPMI中培养Jurkat T细胞。将细胞用PBS洗涤一次，并在含有1％FBS，5 mM葡萄糖，2 mM谷氨酰胺，50μMβ-耐甲醇和1％青霉素 - 链霉菌素的DPB中以30×106细胞ML – 1的浓度重悬于DPB中。

　　将细胞保存在冰上，并在37°C下用5μgml-1抗CD3（OKT3）激活。通过添加冰冷的PBS来停止反应。使用含有0.2％Triton X-100、50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl，蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Scientific）和磷酸酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒（细胞信号）的免疫沉淀裂解缓冲液提取蛋白质。使用BCA测定法对总蛋白质含量进行定量。使用抗CD3ζ抗体（Santa Cruz）从1.5 mg总蛋白中免疫沉淀CD3ζ，使用4μg抗体每0.5 mg总蛋白质和蛋白A/G加琼脂糖（Thermo Fisher（Thermo Fisher））在4°C下持续2 h。将免疫沉淀的蛋白用免疫沉淀裂解缓冲液洗涤3次，并如图所示进行蛋白质印迹。

　　将割礼的肿瘤保存在冰冷的培养基中，直到加工为止。将肿瘤切成1毫米的碎片，并在含有0.012％胶原酶，0.012％施用酶，0.1 mg ML-1 DNase I，1％FBS的消化缓冲液中消化，在KREBS RINGER碳酸氢盐缓冲液（KRB）中，在37°C下在45-60分钟内，在37°C中均匀振动。补充10％FBS（10 mL）的冷DMEM用于中和消化。通过100μM细胞过滤单细胞过滤，并通过300g离心5分钟收集。

　　通过心脏穿刺收集血液为EDTA涂层管。血液在1.5 mL Eppendorf管以2,000g的速度在4°C下旋转15分钟。收集上清液（等离子体）并存储在-80°C下。

　　对IL-2（Invitrogen，Ebioscience）的T细胞上清液进行ELISA，并评估了来自LPS挑战的小鼠的血清的血清，以循环的IL-1β水平（Sigma）评估。按照制造商的程序进行了ELISA。

　　血液是通过涂有EDTA涂层管中的心脏穿刺收集的。然后将样品以2,000克离心15分钟以去除红细胞，并根据制造商的指示使用胰岛素ELISA试剂盒（Alpco，80-INSMS-E01）测量血浆胰岛素。

　　根据制造商的方案，使用CD4+ T细胞阴性分离试剂盒（Stemcell Technologies）从雄性C57BL/6J小鼠中从淋巴结和脾脏分离CD4+ T细胞。将每个孔的2×106 CD4+ T细胞铺在24孔板中，用5μgml-1抗CD3和2μgml-1抗CD28（用各种甜味剂（0.5 mM甜味剂）处理）。电镀后24小时和48小时收集T细胞，并根据制造商的说明使用Tripure隔离试剂（Merck）分离总RNA。使用纳米体（Denovix）对RNA进行定量。

　　MRNA捕获和图书馆的制剂由弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）的高级测序设施使用KAPA mRNA Hyperprep套件（Roche）进行。在Illumina HISEQ 4000平台上对技术进行了一式三份库，平均每样品平均生成5000万个101 bp的单端读数。

　　原始读取是质量和适配器，并在Alignment50之前使用castadapt（版本2.10）修剪。映射读数，然后使用RSEM 1.3.1（参考文献51）和Star 2.7.6（参考文献52）对小鼠基因组GRCM38使用注释版本95对基因级计数，均来自Ensembl。在R编程环境（v4.0.3）45中，使用DESEQ2软件包（1.30.1）47进行了原始计数数据和差异表达分析的归一化。进行以下成对比较：三氯蔗糖24小时和TCM 24小时；三氯蔗糖48小时，TCM 48 h;糖精24 h和TCM 24 h;糖精48小时，TCM 48 h;三氯蔗糖24小时和糖精24小时；三氯蔗糖48小时，糖精48小时；三氯蔗糖48小时和三氯蔗糖24小时；糖精48小时和24小时糖精；TCM 48 h和TCM 24 h，具有造影剂函数，在不同条件之间，基因从中差异表达（调整后的P值小于0.01）。基因列表用于使用David53,54进行过度占用分析的途径和分子函数。

　　在补充10％DFB的无葡萄糖IMDM（Francis Crick Media Services）中，在无葡萄糖IMDM（Francis Crick Media Services）中进行了U- [13C]葡萄糖（剑桥同位素）的稳定同位素追踪。在存在和不存在0.5 mM的甲甘蔗糖的情况下，用抗CD3（5 mg ML-1）和抗CD28（2 mg ML-1）激活CD4+和CD8+ T细胞48小时。将T细胞计数，洗涤，并用10 mM U- [13C]葡萄糖溶液代替，浓度为2×106细胞ML-1，然后是4 H脉冲。用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并使用含有50％甲醇，30％乙腈和20％水的提取缓冲液提取代谢物，在4°C下进行10分钟。对于在Jurkat T细胞中的三氯蔗糖检测，除非另有说明，否则将细胞暴露于0.5 mM三氯蔗糖，持续48小时，并用冰冷的PBS洗涤2次。如上所述提取代谢物，使用1 ml提取缓冲液的3.5×106细胞提取。对于血浆中的三氯蔗糖检测，提取程序是根据参考文献进行的。55。简短地提取了代谢物如下：允许血浆样品在冰上融化30-60分钟。随后以3：1（v/v）的比例将冰冷的甲醇添加到50 µL血浆中。经过短暂的涡旋步骤后，将混合物在冰上孵育5分钟。使用离心（13,000 rpm，10分钟，4°C）用于颗粒。将上清液转移到Eppendorf管中，并在旋转真空浓缩器中干燥。通过添加350μl氯仿：水（1：3：3 v/v/v，含有0.375 mol的[13C] valine作为内标），将极性代谢物从Alaroler代谢产物进行了分分。通过离心分离（13,000 rpm，10分钟，4°C）。将极相转移到装有插入物的LC -MS小瓶中，并在旋转真空集中器中干燥。最后，将75 µl H2O的混合物：甲醇（1：1）添加到干燥的提取物中。随后通过LC -MS分析样品。为了制备三氯蔗糖校准曲线， 用各种浓度的标准将50 µL等离子体升高。然后如上所述进行提取和样品制备。

　　使用Thermo Fisher Scientific的Q-激活Plus（Orbitrap）质谱仪以及Thermo Fisher Scientific的Vanquish UHPLC系统，通过LC-MS通过LC-MS分析代谢产物和三氯蔗糖。色谱分离是在序列Zicphilic（Merck Millipore）柱（5μM粒径，聚合物，150×4.6 mm）上进行的。注射体积为5μL，将烤箱温度保持在25°C，并在4°C下保持自动采样器托盘温度。在总运行时间为25分钟内，使用梯度程序以300μlmin -1的恒定流速为300μlmin -1实现色谱分离。洗脱梯度的编程是因为B的百分比从80％降低到5％，为17分钟，在B的5％持续3分钟，最后在B的80％B的80％重新校准4分钟。溶剂A是在水中以1.4 ml L -1氢氢氧化铵溶液在水中35％的水和溶剂B中补充的水中的20 mM碳酸铵溶液。使用HESI II探针的Q-激活Orbitrap（Thermo Scientific）进行质谱法进行质谱。质谱参数如下：分别为正和负模式的喷雾电压3.5和3.2 kV；探针温度320°C；护套和辅助气体分别为30和5个任意单位；和完整的扫描范围：70–1,050 m/z，具有AGC目标的设置和平衡和高（3×106和70,000）的设置。使用Xcalibur 4.2.47软件（Thermo Scientific）记录数据。在使用标准的Thermo Scientific Calmix解决方案分析之前，对两种ESI极性进行了质量校准。为了增强校准稳定性，还使用无处不在的低质量污染物应用了锁定质量校正。平行反应监测（PRM）采集参数如下：分辨率17,500；在HCD（高能碰撞解离）中单独设置碰撞能量 模式。使用TraceFinder 4.1 EFS软件（Thermo Fisher Scientific），通过准确的质量和保留时间以及与保留时间，质谱和已知量真实标准量的响应相比，通过准确的质量和保留时间鉴定和量化了代谢产物。通过使用校准曲线构建的校准曲线的绝对定量，该曲线构建了已知数量的无辅助型等离子体的标准峰值的响应。

　　如先前所述，获得了细胞级分，如下所述，如下所述。

　　将Jurkat T细胞培养有或没有0.5 mM三氯蔗糖48小时。总共将3.5×106个细胞用冰冷的PBS洗涤两次，然后用含有0.5 mg ml-1 digitonin（Biovision）的1 ml PBS消化，以释放细胞质含量，然后在13,500G处离心10 s。在一个新的，含有800 µL冰冷的萃取缓冲液的新的，预冷的管中收集了两百个微量的上清液，含有细胞质分数。将沉淀重悬于100μl冰冷的提取缓冲液中。如上所述提取并处理代谢产物。对于全细胞对照，在存在或不存在0.5 mM三氯蔗糖的情况下培养的细胞（3.5×106）用冰冷的PBS两次洗涤，并在1 ml冰冷的提取缓冲液中萃取。

　　将Jurkat T细胞培养有或没有0.5 mM三氯蔗糖48小时。将细胞（3.5×106）用冰冷的PBS洗涤一次，然后用含有0.5 mg ml-1 digitonin的1 ml PBS消化，以释放细胞质含量，然后在13,500G处离心10 s。在新的，预冷的管中收集了含有细胞质馏分的上清液。将颗粒重悬于1 ml冰冷的PBS中。使用Digitonin未处理的细胞（3.5×106）用作全细胞对照。将所有样品在-80°C下至少储存12小时，并在冰上超声处理10 s。如所示，使用特定抗体测试了分数的纯度。

　　用0.5 mM氘标记的甲氯酸甲甘蔗糖（SCBT）处理原发性或jurkat T细胞48小时。使用杂交 - SIMS仪器（Iontof gmbH，Thermo Fisher Scientific）在国家物理实验室中通过冻结孔（Iontof GmbH，Thermo Fisher Scientific）通过冷冻孔分析进行了三氯蔗糖定位，该仪器（Iontof gmbH，Thermo Fisher Scientific）融合了Orbitrap Q-extractive HF分析仪和飞行时间（TOF）飞行时间（TOF）Analyser57，58。进入液氮。将样品在液氮下运输，并在液氮VCM中的液氮下安装在定制的Leica样品支架上，并将其转移到Orbisims中，以预先冷却至-160°C的样品阶段。对于电荷补偿，使用21 eV电子洪水枪，电流为-21μA，在分析室中，压力为9.7×10-7 MBAR。所有采集均以2 kV的提取电压为正性进行，样品势为〜 -80 V. 3D分析使用TOF分析仪以200μs的循环时间进行。30 KEV BI+液体金属离子枪（LMIG），斑点尺寸为〜500 nm，用作电流为1.74 pA的分析梁，并且将10 KEV AR2081+气体簇离子束（GCIB）用作溅射束，电流为0.618 Na。使用每个像素10镜头和每扫描3帧获取3D图像，在锯齿栅格模式下具有200μm×200μm的视野，在框架之间，未静置的溅射为440 s，火山口尺寸为500μm×500μm。在整个过程中，在〜 -160°C的温度下进行分析。仪器液氮露水宽松地用聚乙烯袋覆盖，以防止过度冰形成。使用以下峰进行校准质谱的M/Z标度：CH+，CH2+， CH3+和Na+。与对纯标准的分析相比，鉴定出三氯蔗糖峰，并通过同位素簇分布确认。使用Orbitrap分析仪以200μs的周期时间进行光谱分析。将20 keV AR3500+ GCIB用作分析梁，电流为172 pa，占空比为30％，点尺寸约为20μm。使用40μm×40μm的视场和20μm像素大小进行随机栅格模式进行分析。碰撞冷却HE压力为3.9×10-2 mbar。质量范围为150-600 m/z，注射时间为2,000毫秒，质量分辨率为240,000Δm/m，瞬态时间为512毫秒。使用银样品产​​生的银簇进行质量校准。使用Surfacelab 7.3（Iontof GmbH）获取和分析数据。对于图2D所示的深度曲线，相对增加深度由连续数据点表示。在每个数据点之后，GCIB溅射去除材料。图2D中的灰色区域指示离子信号被认为是噪声的区域，该值是根据未处理的对照样本计算得出的。数据代表平均值和S.E.M.位于同一视野内的八个单独的单元格中，归一化为总离子计数。使用离子[C2HO]+作为细胞特异性标记选择了感兴趣的细胞区域。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。