普遍转录的发现和大量非编码RNA（NCRNA）的启示提出了其功能性问题4,5。NCRNA分为小（短于200个核苷酸）和长NCRNA。LNCRNA在生活中是全球代表的，并且在他们的整体上也许是最不可能的成绩单。重要的是，LNCRNA的放松管制与癌症和神经退行性疾病等人类疾病有关6。它们更像是mRNA，而不是不同的是：它们是由具有相似染色质状态的RNA聚合酶II转录，并且经历5'限制，剪接和3'-丙二酰基化7，但大多数缺乏开放的阅读框架，因此也缺乏MRNAS8的编码潜力。几份报告表明，通过抑制转录泄漏9,10,11或通过响应环境变化诱导转录12,13，通过抑制转录泄漏9,10,11或诱导转录13。然而，由于未知原因，许多反义lncRNA进入细胞质，这是细胞质外核酸酶突变XRN1（参考文献3）的显而易见的。XRN1介导的LNCRNA降解遵循RNA的翻译和随后的识别，通过非义介导的衰减（NMD）系统，该系统检测到缺乏开放的阅读框架14。尽管已经证明某些ASRNA会影响人类细胞中的翻译15,16，但目前在酵母中尚无asrnas的细胞质功能。因此，大量ASRNA的出口和细胞质降解似乎是浪费细胞的能量。我们已经发现，Asrnas通过DSRNA形成起到其感觉对应物的调节性RNA，从而导致其优先的核出口，并随后增强基因表达。

　　为了获得真核模型有机体中的核胞质RNA分布的全局图片，我们对细胞进行分级并确定了细胞质分数相对于总RNA通过RNA测序（RNA-SEQ）（RNA-SEEQ）（RNA-SEEQ）（图1A，扩展数据1A-DATE数据1A – D和补充图1A）的RNA的量。正如预期的那样，核糖体RNA（RRNA）在细胞质分数中增加，因为它们是翻译核糖体的一部分，而小核仁RNA（SNORNAS）的代表性不足，因为它们在核中起作用。有趣的是，我们发现23.69％的细胞mRNA在细胞质中极大地富集，其中更多的是核（42.14％）。相比之下，66.33％的AsrNA在细胞质中大大富集（图1B和扩展数据图1E，F）。这一发现揭示了mRNA和ASRNA的整体细胞分布的显着差异，并导致了令人惊讶的观察结果，即大量的Asrnas穿梭于细胞核中。此外，具有同样表达的曲线的mRNA平均表现出在细胞质分数中的同等富集，而没有相当大的Asrna转录本的mRNA更可能是核的（图1C）。这表明asrna转录本在其mRNA的细胞定位中的可能作用，也许是通过dsRNA形成。

　　为了鉴定酵母中的DSRNA，我们在RNA共免疫沉淀（RIP）和随后的RNA测序（RIP-SEQ）实验中使用了DSRNA特异性抗体J2（参考文献17）（图1D和扩展数据图2A – C）。该抗体识别长40个碱基对（BP），并且已经用于确定大肠杆菌的DSRNA转录组。值得注意的是，在酵母中，J2撕裂富集了洗脱株中所有ASRNA的60％以上，但仅大约13％的mRNA（图1D，E和扩展数据图2D，E），表明大多数ASRNA是双链的一部分，而这仅是少数少数人的感觉转录。明显的是，在J2洗脱中耗尽了snornas和rRNA（图1F），证实了mRNA和Asrna对在酵母中形成的抗体对DSRNA的特异性。ASRNA的主要富集与观察结果一致：Asrnas平均表达比编码转录本低10倍，并且只是在DSRNA中存在更高的可能性。此外，单细胞分析表明，只有10％的细胞是一种含义的RNA及其相应的asrna，但大约一半的AsrNA及其感知转录物都存在（扩展数据图3A）。最重要的是，超过80％的RNA富含J2的RNA是细胞质的（图1F），表明DSRNA的细胞质存在增加。相比之下，大多数未与J2抗体结合的SSRNA都是核。

　　在酵母中，先前已经通过基于RNA干扰（RNAi）的筛选来检测到DsRNA的形成，其中dsRNA降解的RNAi系统是人为建立的，因为S. cerevisiae在Evolution in evolution; 20，21 cerevisiae丢失了该系统。它允许通过检测累积的降解产物来鉴定DSRNA在DICER表达后识别。两个数据集（RNAi-Seq和我们的J2 RIP-SEQ数据）显示出很高的相关性（Spearman的等级相关性，r = 0.72；扩展数据图3B）。然后，我们根据RNA在RNAi-Seq中的富集将其分为十个簇（扩展数据图3C），并施加了分级RNA-Seq。显然，RNA越容易形成双链，野生型细胞中可能位于细胞质的可能性就越多（r = 0.52；图1G和扩展数据图3D）。Gene-coverage analysis of the RNAi-seq data furthermore revealed that most of these dsRNAs are formed with Xrn1-sensitive unstable transcripts (XUTs), which show greatest cytoplasmic enrichment and longest overlap with their mRNA in lncRNAs, fewer with stable unannotated transcripts (SUTs) and even fewer with cryptic unstable transcripts (CUTs)22（扩展数据图3E – G）。因此，ASRNA以及具有高可能与其对应物的DSRNA中存在的mRNA，平均显示细胞质富集。

　　为了研究Asrna是否确实可以增加其感官转录物的细胞质定位，我们随机选择研究细胞周期蛋白依赖性激酶PHO85 mRNA的细胞定位。基于其分级RNA-seq数据，PHO85转录本以平均值表示，并且主要是核的，而其Asrna（SUT412）仅几乎无法检测到。首先，我们在RIP实验中验证了两种转录本的双链形成，当时阿斯尔纳从质粒异位表达。为此，我们使用了带有12 ms2回路标记的PHO85 mRNA，并将pho85 asrna放在半乳糖诱导启动子（PGAL1）的下游来控制其转录并提高表达水平。共同表达了GFP标记的MS2结合蛋白MCP，随后沉淀并分析了共纯化的RNA。pho85 mRNA及其asrna存在于洗脱体中，证实我们已将RNA作为双链沉淀（图1H）。接下来，我们在过表达Pho85 asrna的同时进行了细胞质分级实验，这些实验表明，Pho85 mRNA明显将其分布转移到细胞质中，通过升高的asrna表达和DSRNA的形成升高（图1i，图1i，图1I，扩展数据图4a，b和补​​充图），以下均有效。GAL1启动子使我们能够在单分子荧光原位杂交（Smfish）实验中追踪其出口。由于探针很难在dsRNA区域结合，因此两个转录本都被标记为12（对于GFP标签）或15（对于MYC标记）探针具有不同的荧光团的探针，以与各自的单链标签互补（图1J，K）。诱导后，收集细胞并在不同的时间点固定Smfish。在实验过程中，带有和不带有Asrna的同时诱导导致PHO85 mRNA的信号强度相似（图1L）。然而， 与asrna表达结合，与无曲线表达相比，感官转录本的细胞质库显着增加（扩展数据图4C）。观察到的两个转录本的共定位表明效果是由于dsRNA的形成。实际上，在人皮肤皮肤黑色素瘤细胞中已经进行了类似的观察，其中反义RNA TTN-AS1的转录增加导致其mRNA TTN的细胞质定位增加。值得注意的是，反义形式的敲低降低了肿瘤的生长和转移23。值得注意的是，允许DSRNA形成发生，既不抑制PHO85 mRNA转录物的剪接也不抑制核质量控制，因为在总裂解物或细胞质分数中未检测到未倍增的mRNA（图1I）。因此，asrna可以将其mRNA的核总质分布转移到细胞质上，这是一种以前未知的现象，它揭示了新的基因表达层。为了研究dsRNA的形成是否可能改变转录本的稳定性，我们分析了先前从一项通过精确的假尿尿尿贴标的方法探索RNA稳定性的实验数据24，并将该研究的数据与基于RNAI-SEQ的DSRNA概率和J2 RIP-seq相结合。我们观察到RNA稳定性与其在双链中的发生之间没有相关性（r = -0.04，r = -0.13；扩展数据图5A，C）。有趣的是，具有长半衰期（r = -0.42）和高表达水平（r = -0.43）的mRNA往往更核（扩展数据图5B，C）。重要的是，由于相对细胞质分布不是由dsRNA较高的稳定性引起的，因此DSRNA的更快出口速率可能是它们增加的细胞质存在的可能解释。

　　众所周知，mRNA使用异二聚体MEX67 -MTR2（人Tap – P15）的多个分子进行出口，并且后卫蛋白在质量控制过程中募集了这些分子。Karyopherin CRM1/XPO1通过与转录本连接到转录的5'端的帽结合复合物的相互作用1,2,25,25,26,27,28支持导出。从高通量分析中可以明显看出，MEX67也与NCRNA导出有关29。此外，已显示通过MEX67，XPO1 Pathway28,30导出NCRNA，例如LnCRNA TLC1和SNRNA。为了确定DSRNA是否也取决于此途径，我们在MEX67-5 XPO1-1双突变体中重复了分馏RNA-SEQ，该突变体在37°C下转移至37°C的限制性温度1 h（扩展数据图6A，B）。实际上，所有类型的RNA都被困在细胞核中，无论其形成dsRNA的可能性如何，证明了它们对两个导出因子的依赖性（图2A和扩展数据图7a）。此外，使用J2抗体的免疫荧光和点印刷实验证实了DSRNA在野生型细胞中的细胞质定位以及MEX67-5 XPO1-1中的核保留（图2B，C和扩展数据图7B，C）。重要的是，在核糖体亚基出口突变体NMD3-2中抑制翻译，核糖体亚基连接突变体RPL10G161D和抑制剂环己酰胺增加了细胞质dsRNA含量，从而证实了对分辨率的转换的依赖，从而获得了分辨率的依赖（图2b – deftery decterred and decterred and dectery and decterry and dectery and decterry and dectery and decterry and dectery and decterry and decterry and decterry and dectery and dectery and decterry。这些发现表明DSRNA导出对MEX67 mRNA导出途径的依赖性以及需要翻译以解决DSRNA的需求。

　　为了确定dsrNA是否优先出口到SSRNA，我们进行了一个实验。首先，我们通过将其转移到37°C来阻止MEX67-5突变体中的RNA导出，从而导致MEX67从核边缘不定位到核边缘到细胞质1，然后转发SSRNA和DSRNA的核积累（图2E）。当我们将温度降低到25°C时，功能性MEX67返回到核边缘并恢复运输。要查看哪些转录物到达核糖体，因此首先，我们沉淀了RPS2并在输出块释放后的特定时间点纯化了RPS2（扩展数据图7E和补充图2B，C）。我们发现DSRNA比SSRNA更早地到达核糖体，为DSRNA提供了优先导出（并因此翻译）的实验证据（图2E）。接下来，我们分析了asrnA表达诱导的更快的导出将如何影响定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹中有义务基因的蛋白质和RNA水平（图2F和补充图2d，e）。pHO85 asRNA诱导后，PHO85-GFP的蛋白质水平升高（60分钟时为3.1倍），而PHO85-GFP mRNA的水平略有降低（60分钟时为0.32倍），因为它不再在细胞核中以潜在的导出而保持。这表明其asrna的基因表达提升。

　　更快的出口可能是由于出口受体对RNA的占用不同。如前所述，出口蛋白覆盖RNA的越来越多，较快的运输启动为26,31。为了分析MEX67与SSRNA和DSRNA的结合，我们进行了电泳迁移率分析（EMSA）。首先，我们纯化了重组MEX67 -MTR2，该MEX67 -MTR2被证明直接与MRNAS32结合。将MEX67 – MTR2添加到不同的摩尔过量荧光素（FAM）标记为36个核苷酸长的ssRNA或DSRNA中（扩展数据图7F和补充图4A-C），并在对胶Elactophoresis分析样品之前孵育15分钟。超过2摩尔的MEX67 – MTR2完全上升的SSRNA，在5摩尔过量的情况下饱和（图2G和补充图3A）。相比之下，dsRNA以10摩尔的过量过量达到结合饱和度，并在3摩尔过量的情况下进行完整的升档（图2H和补充图3B）。这表明DSRNA每7 bp可以结合大约两个异二聚体，而SSRNA仅适用于相同长度。随后，我们进行了竞争测定法，其中分别在类似标记的dsRNA或ssRNA上分别将FAM标记的DSRNA或CY5标记的SSRNA添加到MEX67 – MTR2中。MEX67 – MTR2与SSRNA解离并与DSRNA相关，在存在dsRNA量增加的情况下，但是当SsRNA被滴定在DSRNA复合物上时，几乎没有位移特性（图2I，J和补充型和补充图3C，DC 3C，D）。切换标签没有任何区别，并产生了相同的效果（扩展数据图7G，H和补充图4D，E）。这些发现表明，MEX67 -MTR2优先且更广泛地与DSRNA结合，从而解释了其在导出方面的偏爱。

　　我们的发现表明，ASRNA可以增强单个转录本的表达。酵母基因组中注释的ASRNA的广泛存在表明，asrna的一般用法可以促进基因表达，这可以解释其患病率。可能还没有发现所有增强ASRNA的促进，因为它们只能在特定条件下转录以将细胞转向特定方向，例如在发育或压力期间。例如，先前的研究发现了一组新的ASRNA，这些ASRNA被染色质修饰剂SET2抑制（参考文献33）。这些被称为SET2抑制反义转录本（SRAT）的下调转录本对应力反应和与年龄相关的转录本是反义的。To determine whether these pairs could form dsRNAs, we carried out J2 immunofluorescence (IF), J2-IP and dot-blot experiments in set2∆ and found a significant increase in the total amount of dsRNA in the cytoplasm (Extended Data Fig. 8a–c,e and Supplementary Fig. 5a), indicating that the induced SRATs form double strands with their sense counterparts and are exported asdsrna。Cell fractionation experiments and qPCRs with a Set2-responsive transcript, SEG2 asRNA, confirmed this observation and showed an up-regulation of the asRNA when SET2 was deleted (Extended Data Fig. 8d), resulting in dsRNA formation (Extended Data Fig. 8e) and a subsequent increased presence of SEG2 mRNAs in the cytoplasm (Extended Data Fig. 8f,g and Supplementary图5b）。

　　有时需要更改细胞表达程序，例如在衰老期间和应对压力时进行开发。每种情况可能会产生新的Asrna转录本，以增强单个mRNA的表达。对先前发表的RNA-seq数据的分析，这些数据是在渗透冲击后产生的，不仅揭示了应力响应性mRNA在压力期间增加，而且ASRNAS13也是如此（图3A）。实际上，有95％的mRNA显着增加，而asrna显着变化显示了asrna的上调（图3B）。为了可视化整个转录组对表达程序的变化，我们通过J2-IF实验确定了用盐（0.7 m NaCl）或乙醇（10％ETOH）冲击的细胞中的DSRNA形成（图3C，D）。尽管大量mRNA在核中积聚并在应力条件下从MEX67中解离32，但新产生的dsRNA在前5分钟内到达了细胞质。这些DSRNA代表与其asrna杂交的优先导出的应力诱导的mRNA。

　　如果这种调节的机制是由dsRNA形成产生的增强基因表达的一般性质，则dsRNA的降解应对细胞有害。先前的工作表明，mRNA和ASRNA的双链被rnaseiii从大肠杆菌中降解。在酿酒酵母中，这种研究发现在生长分析中表达RNaseIII的细胞的毒性无法归因于rRNA或一般mRNA35的降解，但可能是由未认定的DSRNA降解引起的。为了确认RNaseIII对DSRNA的特异性，我们将分离的总RNA暴露于重组RNAseIII，然后通过J2 Dot-blot检测到其余的DSRNA。RNaseIII消化后，明显降低了DSRNA（扩展数据图8H和补充图5C）。为了分析其对活细胞的影响，我们从诱导型GAL1启动子体内表达了RNaseiii，并将蛋白质引导到不同的隔室。用核定位信号标记酶会导致细胞死亡（图3E）。具有核定位信号和核出口信号（NES）的RNASEIII同样有毒。该融合蛋白可以在细胞核和细胞质之间穿梭，并且主要在核边缘上可见（图3F）。有趣的是，将降解酶限制为细胞质（RNAseIII-NES）的构建体在富培养基中耐受。这可能是因为细胞质dsRNA受到某种方式保护，或者是因为随后的翻译非常快。细胞质构建体不可能的可能性不太可能是因为在翻译缺陷型菌株RPL10G161D中可以检测到降低的DSRNA水平（扩展数据图8N和补充图5D），其中细胞质DSRNA积累了细胞质DSRNA（图2B）。最重要的是，尽管在丰富的培养基中耐受了细胞质RNaseIII -NES，但其在渗透应激中的表达导致严重的生长缺陷和DSRNA还原（图3G，H）。细胞质操作RNAi系统也是如此。总之，这些数据表明，通过dsRNA形成的mRNA表达提高asRNA在改变和具有挑战性的情况下尤其重要。

　　一种介导DsRNA形成的酶最有可能是RNA解旋酶，因为这些酶不仅以RNA的放松，而且以其dsRNA结合，dsRNA降解和dsRNA-Clamp的活性而闻名36,37。有趣的是，据报道，两个核解旋酶DBP2或MTR4的缺失会增加XUT-AsRNA水平38。MTR4是一种已知参与RNA降解的酶39，而对于DBP2，在YRA1介导下的链退火已经在体外证明，并且已被认为对Messenger Ribonaceleopretin（MRNP）组装很重要40,41。此外，YRA1被证明可以招募MRNA Export42的MEX67。为了研究DBP2和/或MTR4是否可能参与DSRNA生物发生，我们使用了冷敏感的DBP2-KNOCKOUT菌株41（扩展数据图9A）和温度敏感的MTR4G677D MUTANT43在J2中，如果研究和J2 Dot-dot-dot-dot-blot实验。有趣的是，MTR4突变体在细胞核中积累了dsRNA，表明该解旋酶不需要DsRNA形成，而是在质量控制后衰变（图4A，C，D，扩展数据图9B和补充图6A）。然而，最重要的是，DBP2的不存在导致dsRNA形成明显下降，同时核积累了poly（a）+ RNA（图4b-d和扩展数据图9C），将DBP2识别为dsRNA形成的型号，并显示为dsRNA形成的旋转酶，并显示其MRNA MRNA的MRNA Evertort-Spemport-Support-Support-Suppport-Suppport-Suppporting功能。确实，已经表明，dbp2的删除强烈相关44的含义和相应的反义转录本改变了，这支持了我们的发现。因此，我们重新考虑了先前发表的DBP2的高通量分析，其中通过在野生型和DBP2Δ中用二甲基硫酸盐的游离核苷酸标记来确定RNA二级结构（参考文献45）。我们将此数据集应用于RNAi-Seq Data21，发现RNA越容易发生双链， 与野生型相比，在DBP2Δ中添加核苷酸越多，并被标记为DBP2Δ（扩展数据图9D）。有趣的是，当在RNAI-SEQ21的背景下进行分析时，单个核苷酸分辨率交联和免疫沉淀测序（ICLIP-SEQ）data45表现出与所有转录的结合（扩展数据图9E）（图9E），表明最初的转录本所有转移物都用于所有可能的转录，以前建议使用。然后，随后的DSRNA形成的潜力取决于相应的asrna的可用性以及与YRA1的接触。

　　为了找到进一步的实验证据，我们首先证实了DBP2通过J2-IP与DSRNA结合（图4E和补充图6B）。在存在重组RNAseIII的情况下，这种结合失去了。为了验证DBP2的DSRNA形态函数的体内相关性，我们在没有DBP2的情况下从图1I-K中重复了实验。我们发现，尽管半乳糖诱导后，AsrnA仍然高度富集DBP2Δ，但它无法操纵其sense Pho85 mRNA的定位（图4F – H，扩展数据图9F，G和补充图6C，D）。这一发现表明DBP2是DSRNA形成的关键因素，可以优先导出DSRNA。

　　总之，我们的发现揭示了一个新的受调节基因表达的层。通过DBP2介导的dsRNA形成来增强Asrnas退火，并通过其感觉对应物。这些DSRNA优先出口，随后相应的感官转录本优先表达（图4i）。该机制对于有效的细胞适应尤其重要，并将优先导出作为调节基因表达的新层。此外，它还可以解释普遍的转录如何控制基因表达，以及为什么生成如此多的ASRNA并进入细胞质。