没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，除非另有说明，否则研究人员在实验和结果评估过程中不会对分配视而不见。

　　从受试者获得书面知情同意书，以获取参与本研究的等离子体。这项研究得到了爱荷华大学机构审查委员会的批准（IRB（202003554和201402735）。

　　先前报道了表达HACE2的转基因小鼠4。HACE2在细胞角蛋白18（KRT18）启动子的控制下表示。尽管KRT18启动子主要将基因表达引导到多个上皮衬里的组织8，但它也指导Neurons31中的报告基因表达。这些研究中使用的小鼠（7-8周大，雄性或女性）是从杰克逊实验室（034860-B6.CG-TG（K18-ACE2）2PRLMAN/J）获得的，在C57BL/6背景上是友善的。在某些实验中，将非转基因C57BL/6小鼠用作对照。所有方案均由爱荷华大学的机构动物护理和使用委员会批准。这些研究中使用的2019N-COV/USA-WA1/2019 SARS-COV-2菌株（登录号：MT985325.1）在CALU-3 2B4细胞（ATCC HTB-55）上传递。Calu-3 2B4细胞在补充20％FBS的MEM（Gibco）中生长。在补充10％胎牛血清（FBS）的DMEM（Gibco）中生长Vero E6细胞（ATCC CRL-1586）。

　　用氯胺酮/甲基嗪轻轻地用小鼠麻醉小鼠，并在总体积为50μlDMEM的情况下用指示的SARS-COV-2量身室内感染。每天监测小鼠的体重和健康。所有SARS-COV-2的实验均在爱荷华大学的生物安全3（BSL3）实验室中进行。

　　用氯胺酮/甲基嗪（100 mg kg -1氯胺酮/12.5 mg kg -kg -1甲基嗪）镇静小鼠。腹膜内施用100微升的卡尔巴醇（100μgml-1），大约15分钟后，回收了鼻分泌物。每只小鼠回收20μl的分泌。立即将鼻分泌物添加到500μlTrizol中，混合并在-80°C下储存，直到分离RNA。

　　在DMEM中连续稀释病毒或组织匀浆上清液。在37°C的5％二氧化碳中接种12孔板，持续1小时，并每15分钟轻轻摇动。去除接种物后，用含有2％FBS的0.6％琼脂糖覆盖板。3天后，去除叠加层，并用0.1％的晶体紫罗兰色染色可视化斑块。病毒滴度被定量为每ML组织的PFU。

　　如制造商所述，以1：200：抗小鼠CD3E-BV421（克隆145-2C11，562600），抗小鼠CD16/32（克隆93，cat。No.no.101302），抗Mouse CD4-Percp（Cli-Mouse CD4-Percp（Clone CD4-Percp）（Clone CD4-Percp（Clone CD4-Percp）（Clone CD4-Percp）（Clone CD4-Percpi-555509995，抗小鼠），使用了以下单克隆抗体。CD8-APC-CY7（克隆53-6.7，100714），抗小鼠CD220-APC（克隆RA3-6B2，553092），抗小鼠LY6C-PERCP（克隆HK1.4，128028），抗Mouse Ly6g-fitc（Clone Ly6g-Fitc）M1/70，101263），抗小鼠CD11C-BV421（克隆N418，117343），抗小鼠CD64-PE-CY7（X54-5/7.1，139314），Biolegend；抗小鼠CD103-APC（克隆2E7，17-1031-80），抗小鼠TNF-FITC（克隆MP6-XT22，11-7321-82），抗小鼠IFNγ-APC（克隆XMG1.2，25-7311-82），Ebiiccience。对于细胞内细胞因子染色（IC），在有2μM肽池和Brefeldin A（BD Biosciences）的情况下，在37°C的96孔菜肴中培养淋巴细胞5-6小时。然后将细胞标记为细胞表面标记，用细胞膜/细胞处理溶液（BD Biosciences）固定/透化，并用抗IFNγ和抗TNF抗体标记。所有流式细胞仪数据均使用BD FACSVerse获取，并使用FlowJo软件进行分析。

　　用PBS对小鼠进行麻醉和灌注，然后是福尔马林锌。肺固定在福尔马林锌。对于常规的组织学，将组织切片（每个约4μm）用H＆E染色。以下标准用于评分水肿，透明膜形成和坏死细胞碎片：0，无；1，不常见的检测 <5% lung fields (200×); 2, detectable in up to 33% of lung fields; 3, detectable in up to 33–66% of lung fields; 4, detectable in >66％的肺场。为了评分中性粒细胞浸润：0，在正常范围内；1，散落在隔膜中的PMN；2，不。1加孤独的PMN在空域中渗出；3，不。2加上容器和空域中的小骨料。为了评分单核浸润，血栓形成和出血：0，无；1，不常见的检测 <5% lung fields (200×); 2, detectable in up to 33% of lung fields; 3, detectable in up to 33–66% of lung fields; 4, detectable in >66％的肺场。

　　对于SARS-COV-2抗原检测，将载玻片与阻塞试剂（10％正常山羊血清×30分钟）一起孵育，然后用兔单克隆抗体抗SARS-COV-2-2核素蛋白（1：20,000稀释×60 min，40143-R019，Sino Biologaly），然后用Rabbit Envision（dakit）（Dakit）（Dakin）（Dakin）（Dakine）（DAKO）（DAKO）（DAKO）铬素。通过登机的实验病理学家进行掩盖后进行掩盖的研究和评分，对组织进行了评分。32。使用以下等级分配病变参数的序数分数：0，在预期限制内；1，罕见， <5%; 2, detectable in 5–33%; 3, detectable in 34–66% and 4, detectable in >66％的肺场（200倍目标放大）。

　　根据IRB（202003554）批准的方案，通过允许使用样品进行研究的方案，收集高尊敬的血浆。疗养血浆供体是一名58岁的女性患者，在捐赠前4周以上，他已经分子证实了Covid-19。捐赠后，她测试了HLA抗体呈阳性，因此血浆不符合对患者进行治疗的资格，并被转移到研究中。在该供体上进行的抗体测试（Eurommmun SARS-COV-2 ELISA（IgG））为9.8，远高于阳性结果的截止值1.1。使用表达荧光素酶的SARS-COV-2峰值蛋白假病毒测定法的中和滴度表明，中和半Ximimal抑制浓度（IC50）滴度为1：1,480。对照等离子体是从在Covid-19在我们地区扩散之前收集的过期等离子体单元获得的，该产品是根据IRB（201402735）批准的协议收集的，该方案允许研究这些产品。在指定的时间静脉内给予康复和对照血浆。

　　根据制造商的规程，使用Trizol（Invitrogen）从组织（或鼻腔灌洗）中提取总RNA。在DNase处理后，将总RNA的总RNA作为第一链cDNA的模板。使用Power Sybr Green PCR Master Mix（Applied Biosystems），通过实时定量PCR（Applied Biosystems）对所得的cDNA进行分化。使用每个基因的重复物中的平均值来计算标准化为HPRT的转录本的相对丰度，并以2 -ΔCT表示。先前报道了用于细胞因子和趋化因子的引物为33。为了检测病毒基因组，使用以下引物来扩增核素蛋白的基因组RNA：2019-NCOV_N1-F：5'-GACCCCAAAAATCAGCGAAAT-3'；2019-NCOV_N1-R：5'-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3'。以下引物用于扩增E蛋白的亚基因组RNA：f：5'-cgatctcttgtgtagatctgttctc-3';R：5'-atattgcagcagtacgcacacaca-3'。

　　为了确定患者和小鼠血浆的中和活性，我们使用了基于荧光素酶报告器的伪病毒中和测定法，该测定法具有非复制性囊泡性气孔病毒病毒主链涂有SARS-COV-2尖峰蛋白。在指定的时间点收集了感染了被SARS-COV-2的K18-HACE2小鼠的血清，并通过在56°C下孵育30分钟通过热量失活。在96孔板中连续稀释人疗养血浆或小鼠血清，并与在37°C下用SARS-COV-2峰值蛋白孵育相同体积的VSV伪型1小时。将样品放在Vero E6细胞上，并在37°C下孵育1小时以允许病毒结合。去除初始接种物后，将细胞孵育24小时。用荧光素酶测定试剂盒（Promega）测量中和，并相对于对照井值绘制。

　　对于雄性小鼠，社会气味歧视任务旨在评估小鼠歧视社会气味的能力，如前所述34。将两个相同的试管分别密封在一个大笼子中的Ziploc袋中（用于外壳大鼠（31 cm×26 cm×22 cm）），其中含有来自雌性小鼠的床上用品，并从家里（雄性）笼子过夜。接下来，被SARS-COV-2感染或用PBS处理的小鼠被释放在一个新鲜的笼子中，该笼子里装有放置在两个不同角落的试管。嗅探潜伏期（嗅探和探索管）是在5分钟内计算的。每天对每只鼠标进行一次试验，每天都会改变管子的位置。从大约1 m的距离中记录了数据中的数据。

　　对于雌性小鼠，将两种相同的3厘米菜从家居笼子（“熟悉”）和另一个笼子（“新颖”）分开密封。将含水卷的菜肴放在一个新鲜笼子的两个角落。被SARS-COV-2感染或用PBS小鼠治疗的小鼠被释放到笼子中，并按照雄性小鼠的描述计算并记录了嗅探潜伏期。每天对每只鼠标进行一次试验，每天都会改变菜肴的位置。

　　我们计算了每只小鼠的偏好指数，以补偿由于迁移率降低或不适而导致的任何差异。雄性小鼠的偏好指数被计算为：（女性时间 - 雄性时间）/女性时间 +雄性时间），而对于雌性小鼠，偏好指数为：（新颖的气味 - 熟悉的气味时间）/（新颖的气味时间 +熟悉的气味时间）。使用Mann-Whitney U检验分析数据。

　　如前所述34，通过埋入的食物测试对气味检测进行评估。简而言之，在开始实验之前，证实了食物上诉。在实验当天，将经SARS-COV-2感染或PBS处理的小鼠敏感10-15分钟。然后将食物颗粒埋在新鲜笼子中铺被床上用品表面下方约1厘米处。每天每天进行一次每天一次感染或未感染小鼠的试验，每天都会改变食物的位置。定位和发现埋藏的食物颗粒的延迟是用秒表记录的。允许小鼠探索笼子4分钟，如果无法找到食物，则将时间记录为4分钟。每天重复实验。

　　通过方差分析和学生的t检验分析了组之间平均值的差异，并使用GraphPad Prism 8通过对数秩（Mantel – Cox）测试分析生存率差异。所有结果均表示为平均值±S.E.M.并经过多次比较进行了纠正。对于行为研究，分别通过双向方差分析和非参数（Mann-Whitney U-Tests）测试分析了来自社会气味歧视测试的数据和埋藏的食物测试。p <0.05被认为具有统计学意义。*p≤0.05，**p≤0.005，***p≤0.0005，****p≤0.0001。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。