在EtablesementFrançaisDuSang（EFS）的128个健康供体中收集外周血样本。匿名捐助者的EFS血液样本的使用得到了国家de laSanté等人的批准。从所有捐助者那里获得书面同意。使用LPS小鼠模型的生存评估是根据2010/63/eu在Fidelta进行的，以及国家立法，该法规规定了在科学研究和其他目的中使用实验动物的使用（官方公报55/13）。动物研究伦理机构委员会（CARE-ZG）监督了与动物相关的程序并不损害动物福利。使用LPS小鼠模型的流式细胞术，ICP-MS，Western印迹和RNA-SEQ根据法国法律有关动物实验的法律（＃2021072216346511），并由机构动物护理和使用机构动物护理和使用委员会批准Saint-de-de Saint-quentin-quentin-en-en-en-en-en-yely-yely-ely-yely-yely-yely-yely-yely-yely-yely-Yely-yely-Yelvelines（C2EA-47）。使用CLP模型的所有动物工作均根据法国有关动物实验的法律（＃2021072216346511）进行，并经机构动物护理和使用委员会批准了Saint-quentin-en-en-Yvelines（C2EA-47）。在当地委员会评估生物学风险的协议后，在生物安全3级设施中进行了有关SARS-COV-2模型RNA-Seq的所有动物工作，并遵守了当前的国家和机构法规和义务指南（Institut Pasteur de Lille/Bilille/Bilille/B550009-9-359-350009）。使用动物的实验方案得到了机构伦理委员会的批准。动物研究由教育，研究和创新部根据注册号APAFIS＃25517-2020052608325772V3授权。有关细胞术的动物工作， SARS-COV-2模型上的ICP-MS和Western印迹是在图卢兹大学的生物安全3级设施中进行的。这项工作是由动物研究伦理机构委员会监督的（APAFIS＃27729-202010101616517580 V3，法国研究部长（CEEA-001），以确保与动物相关的程序不损害动物福利。

　　抗体在下面注释如下。WB，Western印迹；FCY，流式细胞仪；FM，荧光显微镜；NS，Nanosims；芯片，芯片塞克；胡，用于人类样品；MS，用于鼠标样品。指示稀释。制造商验证的任何抗体验证都可以在制造商的网站上找到。如下所述，我们通过敲低（KD）和/或KO策略验证了有关抗体的抗体验证。主要抗体：ALKBH1（ABCAM，AB195376，克隆EPR19215，Lot GR262105-2，WB 1：1,000，Hu，MS，由制造商验证），AMP激活的蛋白质激酶激酶subunit alpha（AMPKα，电池，信号在THR172（P-AMPKα，细胞信号，2535s，Lot 27，WB 1：1,000，HU），ATF2（ABCAM，ABCAM，AB32160，克隆E243，Lot GR3430555-1，WB 1：1,000，HU），atf2（proteeintech bignect，14834-1-ap ap by by）上，制造商），ATP7A（Santa Cruz Biotechnology，SC-376467，克隆D-9，Lot J2821，WB 1：200，HU），ATP7A（Novus Biologicals，NBP2-59376A-11，Lot I2719，WB 1：200，HU，MS），过氧化氢酶（单元信号，12980T，克隆D4P7B，Lot 3，WB 1：1,000，HU），CCL2（也称为MCP1）（也称为MCP1）（ProteIntech，66272-1-ig，66272-1-ig，Clone 1b9f7，wb 1 blue blue blue blue blue blue blue blue blue101224，克隆M1/70，Lot B350151，B323654和B323653，FCY 1：800，MS），CD14-Krome Orange（Beckman Coulter，B01175，B01175，Clone RMO/52，Lot 200040，FCY 1：1：100，HU）克隆3G8，Lot 200029，FCY 1：100，HU），CD3（Biolegend，317326，Clone Okt3，Lot B372352，T细胞激活，2.5 µg ML-1，HU），HU），CD25-BV711（CD25-BV711）（Biolegend，302934，克隆CD28.2，批次374639，T细胞激活，2.5 µg ML-1，HU），CD40-APC（Biolegend，124612，Clone 3/23，Lot B309981，fcy 1：200，mss），cd40-bv510（clone 510）（3329，3329，332，332，332）312131，FCY 1：100，HU），CD44（ABCAM，AB189524，LOT GR320797-13， GR3314218-16, clone EPR18668, WB 1:30,000, Hu, Ms, KO/KD validated by us and manufacturer), CD44 (Thermo Fisher Scientific, 701406, clone 19H8L4, lot 1976318, FM 1:400, Hu), CD44-AF647 (Novus Biologicals,NB500-481AF647, clone MEM-263, lot 118753, FCy 1:100, Hu), CD44-AF647 (BioL​​egend, 103018, clone IM7, lot B317762, FCy 1:200, Ms), CD45-BV510 (BioL​​egend, 103138, clone 30-F11, lot B362964,B322199，B333193，FCY 1：200，MS），CD64-FITC（Biolegend，399505，克隆S18012C，Lot 308498，FCY 1：100，HU），HU），CD666B-PE/CY7（BioleGend，305115，305115，Clone g10f5，lot 283925，lue 283925，FCY），FCY 283925，HHU）CD69-PERCP（Biolegend，310928，克隆FN50，Lot B290414，FCY 1：100，HU），CD80-AF700（BD Biosciences，561133，561133，克隆307.4，Lot 1060235B303073, FCy 1:100, Hu), CD86-PE (BioL​​egend, 105007, clone GL-1, lot B318893, FCy 1:200, Ms), CD86-PE/Cy7 (BD Biosciences, 561128, clone 2331 (FUN-1), lot 1309531, FCy 1:33, Hu), CD109 (Santa Cruz生物技术，SC-271085，克隆C-9，Lot E1018，WB 1：200，HU），CD109（Biotechne，AF7717-SP，WB 1：1,000，MS），CD163-PE（BD Biosciences（BD Biosciences（siglec-f）-peefluor 610（Ebioscience，61-1702-80，克隆1RNM44N，批次2472220和2152352，FCY 1：200，MS），CGAS（单元信号，15102，15102，clone d1d3g，lot 4，lot 4，lot 4，wb 1：1,000：1,000，cgas），cgas（cgas），cgas（cgas），cgas，cgas，cgs cgs，cgs cgs cg gy，D3O8O，Lot 3，WB 1：1,000，MS），时钟（ProteIntech，18094-1-AP，WB 1：1,000，由制造商验证），时钟（ABCAM，ABCAM，AB3517，WB 1：1,000GR81444-2，WB 1：1,000，HU，KD由我们验证），CTR2（Novus Biologicals，NBP1-05199SS，WB 1：1,000，HU），CTR2（Novus Biologicals，NBP1-85512，Lot Lot lot R05901，fm 1：fm 1：400，bu）lot BR2373, WB 1:1,000, Hu) COX IV (Abcam, ab16056, lot GR320655-1, FM 1:400, Hu), CREM (Proteintech, 12131-1-AP, WB 1:1,000, Hu), cytochrome c (Cell Signaling, 12963S, clone 6H2.B4, lot 1 and 2, FM 1:400,NS 1：400，HU），DMT1 （ABCAM，AB55735，克隆4C6，批次GR3243346-1，WB 1：1,000，HU，由我们验证的），果蝇峰型抗体（活动主题，61686，Lot 23521010，23521010，条件下，条件50 ng chip 50 ng）HU），E-钙粘蛋白（BD Biosciences，610181，克隆人36，Lot 7187865，WB 1：1,000，MS），F4/80-Bv605（Biolegend，123133，Clone BM8，Lot BM8，Lot B362524，B362524，B309659，B309659，MSS 1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：F4/80-PE（TONBO，TNB50-4801-U100，克隆BM8.1，批次C4801060619503，FCY 1：100，MS），Fibronectin（Sigma-Aldrich，sigma-Aldrich，f0791，f0791，clone ist-3，clone ist-3，lot 026m4781v，wb 1：1,000，000，000，000,000，hu27226-1-ap，WB 1：1,000，HU，MS，KD/KO由制造商验证），H3（单元信号，9715S，Lot 23，fm，wb 1,000，WB 1：1,000，HU，HU，MS），H3K4ME3（DIAGENODE，DIAGENODE，c15410003-50，c15410003-50，lot A8034D，FM 1：400，fm 1：400，dot dot，HHU）H3K9AC（细胞信号，9649s，克隆C5B11，批次13，FM，WB，芯片6 µl每106个细胞，HU，MS，用SimpleChip酶染色质IP验证，由制造商通过SimpleChip酶），H3K9Me2（H3K9Me2）（细胞信号传导，4658S，4658S，clone d84b4 bot 10：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：4658，FM 1：4658，FM 1：4658S，FM 1 4658，FM 1 4658S，FM 1 4658s，FM 100，4658S106 cells, Hu, Ms, validated with SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP by manufacturer), H3K9me3 (Cell Signaling, 13969S, clone D4W1U, lot 3, FM 1:400, Hu, validated with SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP by manufacturer), H3K14ac (Cell Signaling, 7627S, clone D4B90, lot 6,FM，WB 1：1,000，每106个单元，HU，MS的芯片6 µl，用制造商的简单酶染色质IP验证），H3K27AC（单元信号，8173S，克隆D5E4，Lot 8，Lot 8，lot 8，fm，fm，fm，wb 1,000，Chip 6 µL Per 106 Cell，CHR Per 106 Cell，MS MS，HU，HU，HU，HU，HU，HU，HU，HU，HU，HU，HU，HU，HU制造商），H3K27ME3（细胞信号，9733s，克隆C36B11，批次19，FM 1：400，WB 1：1,000，芯片6 µL每106个单元，HU，MS，用SimpleChip酶促IP验证，由制造商由SimpleChip酶促IP验证，H3K36Me2（ABCCCAM，AB903），AB9049，lotm gr 336me2（abcccam，ab9049）1：400，hu），透明质酸合酶1（Has1，Novus生物学，NBP1-51635，Clone 3E10，Lot 141031，WB 1：1,000，HU），HAS1（Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich， SAB4300848，批次492637613，WB 1：1,000，MS），透明质酸合成酶2（Has2，Abcam，AB140671，Clone 4E7，Lot GR3212928-2，WB 1：1,000Ms), hyaluronan synthase 3 (HAS3, Abcam, ab154104, lot GR113715-12, WB 1:1,000, Hu), HAS3 (Proteintech, 15609-1-AP, WB 1:1,000, Ms, KO/KD validated by us and manufacturer), HAT1 (Proteintech, 11432-1-AP, WB 1:1,000, Hu, Ms,由美国和制造商验证的KO/KD，5-羟基甲基环霉素（5HMC，Active Motif，39069，Lot 23720003，FM 1：400，HU，HU，DOT BLOT由制造商验证）由制造商验证）1：400，MS），IRAK4（单元信号，4363T，Lot 5，WB 1：1,000，HU，MS），JAK2（单元信令，3230T，Clone D2E12，WB 1：1,000，Lot 13，Lot 13，Lot 13，Hu，Hu，MS），JMJD6，JMJD6（ABCAM，ABCAM，AB64575，MS）KAT2B/PCAF (Cell Signaling, 3378T, clone C14G9, lot 2, WB 1:1,000, Hu, Ms, validated with SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP by manufacturer), KAT3A (also known as CREBBP) (Abcam, ab2832, lot GR3360262-6, WB 1:1,000, Hu, Ms), KAT5 (also known asTIP60）（Santa Cruz Biotechnology，SC-166323，克隆C-7，Lot 166323，WB 1：200，HU，MS），Kat6a（也称为Moz）（Santa Cruz Biotechnology，SC-293283，SC-293283，clone 4d8，clone 4d8，lot f0420PA5-103467, lot XH3653004, WB 1:1,000, Ms), KAT8 (also knon as MOF) (Proteintech, 13842-1-AP, KD/KO validated by manufacturer, WB 1:1,000, Hu, Ms), KDM2A (Abcam, ab191387, clone EPR18602, lot GR3330146-4,WB 1:1,000, Hu, Ms, KO validated by manufacturer), KDM5A (also known as Jarid1a) (Cell Signaling, 3876S, clone D28B10, lot 5, WB 1:1,000, Hu, Ms), KDM5B (also known as Jarid1b) (Cell Signaling, 3273T, lot 3, WB 1:1,000, Hu), KDM5B（ABCAM，AB181089，Clone EPR12794，WB 1：1,000，MS，由制造商验证的KO），KDM5C（也称为JARID1C）（CellID1C）（单元信号，5361，克隆D29B9，lot 1，5361，5361，WB 1：1,000，WB 1：1,000，hu，k.1,000，knu Ass as as as as as as ass ktm6a，克隆D3Q1L，地段4， WB 1：1,000，HU，MS），KDM6B（ABCAM，AB169197，WB 1：1,000，HU），KDM6B/JMJD3（单元信号，3457，3457，WB 1：1,000，MS），KDM7A，KDM7A（Invitrogen，Pa5-96987，lot UIII of Uiii of Uii，huLy6C–PerCP/Cy5.5 (BioL​​egend, 128012, clone HK1.4, lot B363119 and B310463, FCy 1:200, Ms), Ly6G–PE-Cy7 (BioL​​egend, 127618, clone 1A8, lot B288785 and B351626, FCy 1:200, Ms), Ly6G–AF647（Biolegend，127610，克隆1A8，批次B2559839，FCY 1：200，MS），与溶酶体相关的膜蛋白2（LAMP2）（ABCAM，AB25631，克隆H4B4，FM 1：4002154045，FCY 1：100，MS），SLC25A3（Santa Cruz Biotechnology，SC-376742，SC-376742，克隆F-1，Lot H2313，WB 1：200，FM 1：100，HU，HU，HU，由我们验证）SLC25A37（Mybiosource，MBS9210193，克隆ID：RB24153，LOT SA100524AR，WB 1：1,000，FM 1：400，HU，HU，由我们验证），SLUG（单元格信号，9585，9585，Clone C19G7，Lot 6，lot 6，lot lot 6，wb 1：1,000：1,000，000,000，MS，MS，HU14994T，克隆D1K9Y，Lot 8，WB 1：1,000，Hu，MS，用STAT2（ABCAM，AB32367，Clone Y141，Lot GR3294792-5，WB 1：1,000，HU，MS，MSSCOURDAT2），STAT2（ABCAM，AB32367，clone y141，abcam，ab3267，clone y141）验证（abcam，ab32367，abcam，abcam，ab32367）验证。ab13534, lot GR3345921-12 and GR33618-52, FM 1:400, WB 1:1,000, Hu, Ms, KD validated by us), Tet methylcytosine dioxygenase 2 (TET2, Abcam, ab94580, lot GR3243631-2, WB 1:1,000, Hu, Ms), Tetmethylcytosine dioxygenase 3 (TET3, Abcam, ab139311, lot GR3314447-1, WB 1:1,000, Hu, Ms), TRAF2 (Cell Signaling, 4724T, clone C192, lot 2, WB 1:1,000, Hu, Ms), TFR1 (Invitrogen, 13-6800, clone H68.4, lotVJ313549，WB 1：1,000，HU，KD由我们验证），TFR1 – APC – AF750（Beckman Coulter，A89313，A89313，Clone YDJ1.2.2，Lot 200060，FCY 1：1：100，Hu），Hu），γ-纤维蛋白（Sigma-Aldrich，sigma-Aldrich，t5326，clone gto，0000128065, WB 1:1,000, Hu, Ms, enhanced validation by manufacturer), Twist (Santa Cruz Biotechnology, sc-81417, clone Twist2C1a, lot J2213, WB 1:200, Ms), vimentin (Cell Signaling, 5741S, clone D21H3, lot 8, WB 1：1,000，HU，MS，KO由以前的用户根据制造商的网站验证）。Secondary antibodies: Alexa Fluor 488 anti-rabbit (Invitrogen, A-11070, lot 2161039, FM 1:1,000, Hu), Alexa Fluor 594 anti-mouse (Invitrogen, A-11032, lot 1826426, FM 1:1,000, Hu), Alexa Fluor 594 anti-rabbit (Invitrogen, A11072,lot 1985650, FM 1:1,000, Hu), Alexa Fluor 647 anti-mouse (Invitrogen, A21237, lot 1743738, FM 1:1,000, Hu), Alexa Fluor 647 anti-rabbit (Invitrogen, A21246, lot 2418503, FM 1:1,000, Hu), donkey anti-rabbit IgG-h+IHRP偶联（贝尔特基实验室，A120-108P，地段和第13页），山羊抗小鼠IgG H+I HRP偶联（Bethyl Laboratories，A90-116p，Lot 41和44），10 nm纳米纳米菌的抗小鼠抗小鼠（10 nm annanoparticle负载抗小鼠）胡）。

　　从EFS的128个健康供体收集外周血样本。Inserm委员会（Institut National de laSanté等人RechercheMédicale）批准了匿名捐助者的EFS血液样本的使用。从所有捐助者那里获得书面同意。根据制造商的说明（Miltenyi Biotec，130-096-537），通过使用微粒进行负磁分析泛单核细胞，并在细胞因子存在下立即培养以触发“细胞培养”中所述的体外分化。细胞被新鲜使用而无需先前冷冻。通常，除非另有说明，否则通过与1×PBS与10 mM EDTA孵育，在37°C下与10 mM EDTA一起孵育，除非另有说明。原发性非小细胞肺循环癌细胞获自Celprogen（36107-34CTC），并如“细胞培养”中所述进行培养。如“ LPS诱导的败血症模型”，“ CLP诱导的败血症模型”和“ SARS-COV-2诱导的急性炎症模型”中所述，分离并处理了来自体内小鼠模型（LPS，CLP和SARS-COV-2）的原代巨噬细胞。

　　这项研究是使用从EFS的128个不同人类供体的外周血样本获得的原代单核细胞进行的。根据制造商的说明（Miltenyi Biotec，130-096-537），通过使用微粒进行负磁分析泛单核细胞，并在rpmi 1640中培养，并补充了谷氨酸（Gibco，61870010），10％胎发树脂血清（fbs，fbs，fbs，fbs，fbs，euribio covs，euribio covfs，euribio cvffs，gibco，61870010）。为了产生MDMS，用粒细胞 - 巨噬细胞刺激因子（GM-CSF，Miltenyi Biotec，130-093-866，100 ng ML-1）处理PAN单核细胞5天。随后，将LPS（Invivogen，TLRL-3PELPS，100 ng ML-1）和干扰素-γ（IFNγ，Miltenyi Biotec，130-096-484，20 ng ml-1）添加到24 h培养基中，以产生AMDM。根据制造商的说明（Miltenyi Biotec，130-096-533），通过使用微粒分类从外周血样品中分离出CD4+ T细胞，并在RPMI 1640中培养，补充了谷氨酰胺和10％胎牛血清。随后，将CD3/CD28抗体添加到培养基中48小时以产生活化的CD4+ T细胞。根据制造商的说明（Miltenyi Biotec，130-096-495），通过使用微粒分类从外周血样品中分离出CD8+ T细胞，并在RPMI 1640中培养，补充了谷氨酰胺和10％胎儿的血清。随后，将CD3/CD28抗体添加到培养基中48小时以产生活化的CD4+ T细胞。为了产生抗炎巨噬细胞，用巨噬细胞群刺激因子（M-CSF，Miltenyi Biotec，130-096-492，100 ng ml-1）用泛池单核细胞处理5天，随后将IL-4（Miltenyi Biotec，130-093-93-92-92-92-92-92-92-20 n gl）添加了5天。从外周血样本中分离中性粒细胞。将全血样品中的红细胞裂解（Ebioscience RBC裂解缓冲液，00-4300-54）。在补充谷氨酰胺的RPMI 1640中培养其余细胞， 和2％的人血清。随后，加入LPS（2 µg mL -1）1小时以产生活化的中性粒细胞。使用FSC，SSC和CD15表面染色通过流式细胞仪确定中性粒细胞群体。为了产生树突状细胞，用GM-CSF（100 ng ML-1）和IL-4（10 ng ml-1）处理泛单核细胞5天。随后，将LPS（100 ng mL -1）添加到培养基中以产生活化的树突状细胞（ADC）。FC1242 mouse pancreatic cancer cells were a generous gift from the Tuveson laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory) and were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMAX (DMEM, Gibco, 61965059) supplemented with 10% FBS (Gibco, 10270-106) and penicillin–streptomycin mixture (BioWhittaker/Lonza,DE17-602E）。用TGF-β（Miltenyi Biotec，130-095-066，10 ng ML-1）处理细胞6天。原发性非小细胞肺循环癌细胞（Celprogen，36107-34CTC，Lot 219411，性别：女性）是使用干细胞完整培养基（Celprogen，M36102-29P）生长的，直到第三次通过。这些细胞在干细胞ECM T75-Flasks（Celprogen，E36102-29-T75）和ECM 6孔板（Celprogen，E36102-29-6 Well）中生长，并用TGF-β处理3天。

　　用LPS和IFNγ激活MDMS，并与ATTM（Sigma-Aldrich，323446，323446，10μM）或EDTA或EDTA（EUROMEDEX，EU0007，500μm），透明质酸（Carbosynth）（Carbosynth，FH45321，600-1000 KDA，1 M. MG MG ML-MG ML-1-1-HYTRATE，IN-1-HYTRATE（IN）1 mg mL-1），LCC-12（内部，10μM），LCC-4,4（内部，10μM），二甲双胍（1,1-二甲基甲基盐盐盐酸盐，Alfa Aesar，Alfa aesar，j63361，10 mm），10 mm），penigma-Aldrirentions trients trients trients trients trients trients trients trient trients trients trient trients p455555555555.555555555555555555555.5555555555555555555555555555555555555559555号，p455555。盐酸盐（Trien，Sigma-Aldrich，PHR1495-500MG，200μM）或抗人CD44 CD44治疗抗体（RG7356，Creative Biolabs，TAB-128CL，10μgml-1）24小时。AMDM用CCCP（Sigma-Aldrich，C275​​9，10μM），15N，13C-LCC-12（内部，10μm），LCC-12,4（内部，100 nm）或Trientine Alkyne（内部，10μm）（内部，10μm），直接添加3小时，持续3小时，持续3小时。将树突状细胞与LPS和LCC-12（10 µM）共同治疗24小时。将CD4+和CD8+ T细胞与CD3/CD28和LCC-12（50 µM）共48小时共处。将抗炎巨噬细胞与IL-4和LCC-12（10 µM）共处理24小时。与LPS和LCC-12（10 µM）共1小时，中性粒细胞与LCC-12（10 µm）共处。将原发性非小细胞肺循环癌细胞和FC1242细胞分别与TGF-β和LCC-12（1 µM）共3天和6天。

　　对于人类免疫细胞：用冰冷的1×PBS洗涤细胞，与FC块（人信任FCX，Biolegend，Biolegend，422302，1：20）孵育15分钟，随后在1×PBS/ 0.5％Bovine Serman（LSA）（bd cy）（bd castore）（bd cy）在4°C下与抗体孵育20分钟，然后孵化。X-20）。用相应的抗体面板分析细胞。使用胰蛋白酶/EDTA（Gibco，Trypgib01）通过胰蛋白酶次化收集原发性非小细胞肺循环癌细胞和FC1245细胞，并用1×PBS洗涤，并在1×PBS/10％FBS中在4°C下在4°C下在4°C下进行20分钟。使用流式细胞仪（BD精确C6）洗涤细胞并分析细胞。有关LPS鼠模型细胞上的流式细胞仪，请参见LPS诱导的败血症模型段落。线粒体H2O2含量：MDMS的流式细胞仪分析在存在Mitopy1（R＆D Systems，4428/10，5μM）的情况下用LPS和IFNγ激活24小时。通过流式细胞仪分析荧光。用线粒体CU探针MCU-239：用LPS和IFNγ激活并与LCC-12（10 µM）共同处理的NAMDMS，AMDM和MDMS进行流式细胞仪分析，将其与MCU-2（10 µM）一起孵育1H。通过流式细胞仪分析荧光。使用FlowJo软件v。10.8.2分析数据。

　　用硝酸65％（VWR，Suprapur，1.00441.0250）清洁配备有Teflon Septa的玻璃小瓶，并用超纯水（Sigma-Aldrich，1012620500）洗涤并干燥。收集细胞并用1×PBS洗涤两次。然后使用自动细胞计数器（ENTEK）对细胞进行计数，并在200 µL 1×PBS或超纯水中转移到清洁的玻璃小瓶中。将相同体积的1×PBS或超纯水转移到单独的小瓶中以进行背景减法，至少在每个实验的重复中。如从预先计算的细胞群中提取的线粒体，核和内质网状。使用冷冻干衣机（基督，2-4 ldplus）冻干样品。随后将样品与硝酸65％混合，并在80°C的同一玻璃小瓶中加热，并用带有特氟龙隔隔隔的玻璃小瓶加热。然后将样品冷却至室温，并用超纯水稀释至最终浓度为0.475 N硝酸，并转移到无金属离心机小瓶（VWR，89049-172）中，以进行随后的质谱分析。考虑使用天然同位素分布，使用敏捷的7900 ICP-QM测量的金属量。通过Scott喷雾室通过微型脉络膜（Micromist，0.2 mL min-1）实现样品引入。使用与氦气（5 mL min-1）的碰撞反应界面测量同位素以去除多原子干扰。在与样品混合后，注入了丑闻和内部标准标准，以控制信号漂移和基质效应的缺失。以涉及样品的浓度来测量认证标准，以将计数测量值转换为溶液中的浓度。值对单元格数进行标准化。

　　MDM被视为指示，然后用1×PBS洗涤。对于MDM，将蛋白质溶解在含有苯甲酶的2x Laemmli缓冲液中（VWR，70664-3，1：100）。将提取物在37°C下孵育1小时，并在94°C加热10分钟，并使用纳米罗普2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行定量。如相关流式细胞仪部分所述，通过流式细胞仪分离了来自LPS，CLP和SARS-COV-2小鼠模型的SPM和AM。由于细胞数低，将SPM收集在1×PBS中，随后将其冷冻在Eppendorf管中。将干材料溶解在含有苯并酶的2x Laemmli缓冲液中。将AM沉淀，并将细胞颗粒溶解在含有苯酶的2x Laemmli缓冲液中。然后将来自SPM和AM的提取物在37°C下孵育1小时，并在94°C加热10分钟。使用Qubit（Invitrogen）和量子蛋白定量测定法（Invitrogen，Q33212）对SPM和AM的蛋白质提取物进行定量。对于LPS模型，将SPMS用于8个假小鼠，4 lps处理的小鼠以及6 LPS和LCC-12处理的小鼠。对于CLP模型，将SPMS从8个假小鼠和7只小鼠中汇总。对于SARS-COV-2模型，将AM用于10个假小鼠和10个SARS-COV-2感染的小鼠。通过SDS-PAGE（Invitrogen Sure-Lock System和Nupage 4–12％BIS-Tris预制凝胶）解决蛋白质裂解物。在来自MDMS或癌细胞的典型实验中，每条车道将10–20 µg的总蛋白质提取物加载在含有溴酚蓝的2×Laemmli缓冲液中。对于体内分离的SPM和AM，蛋白质量受限制的AM，通常将1 µg总蛋白质提取物加载（如果抗体无法以这些蛋白质量识别特定的谱带，则将更多的蛋白质裂解物加载到新实验中）。在每个凝胶上，都运行一个尺寸标记物（3 µL Pageruler或Pageruler Plus，Thermo Scientific，26616或26620和17 µL 2×Laemmli缓冲液） 并联。然后，使用1×Nupage转移缓冲液（Invitrogen，NP00061），使用Trans-blbot SD半干电池（Biio-Rad）将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（Amersham Protran0.45μm）上，使用10％甲醇。用5％的非脂肪脱脂奶粉（Régilait）在0.1％Tween-20/1×PBS中封闭膜。在适当的标记尺寸下切开膜，以允许在同一膜上探测几种抗体。然后用相关的原代抗体在5％BSA，0.1％Tween-20/1×PBS中探测印迹，或在4°C下在0.1％Tween-20/1×PBS中的5％非脂肪脱脂奶粉中探测，在一个手工密封的透明塑料袋中轻柔运动，在4°C下过夜。将膜用0.1％Tween-20/1×PBS洗涤3次，并在5％非脂肪脱脂奶粉中与辣根过氧化物酶共轭二抗（Jackson Laboratories）孵育，0.1％Tween-20/1×PBS在房间温度下1 h，并在3次时用0.1％的Tween-tween-tween-20/1×PBS洗涤。使用SuperSignal West Pico Plus（Thermo Scientific，34580）和SuperSignal West Femto（Thermo Scientific，34096）化学发光检测套件检测到抗原。对于在同一膜上的吸墨蛋白，使用剥离缓冲液（0.1 M Tris pH 6.8，2％SDS W/V，0.1 Mβ-羟基乙醇）使用30分钟，并用0.1％Tween-20/1×PBS洗涤膜，并随后重新涂上如上所述。使用Fusion Solo的成像系统（Vilber）记录信号。对于组蛋白标记，H3并行在单独的凝胶上作为样品处理控制，并显示在相应的面板中。γ-微管蛋白是同一凝胶上的负载对照，并且在各个面板中未显示。使用像素强度针对γ-微管蛋白的信号进行标准化的像素强度，用fiji 2.0.0-RC-69/1.52N进行带量化。所有完整的印迹扫描都显示在补充信息中。

　　如“细胞培养”中所述，将分离的单核细胞铺在盖玻片上，分化和激活。为了透明检测透明质酸盐和Lys-Cu，将活细胞用透明质酸盐-FITC（800 kDa，Carbosynth，YH45321，0.1 mg ml-1）和lys-Cu（内部，内部，20μm，1 h）26在1 h中，在透明度上为1 h，透明度为1 h。mg ml -1）。在添加到细胞之前，将透明质酸盐-FITC和透明质酸酶一起在37°C的培养基中溶解2小时。然后将细胞用1×PBS洗涤3次，用2％多聚甲醛在1×PBS中固定12分钟，然后用1×PBS洗涤3次。对于抗体染色，然后将细胞用0.1％Triton X-100在1×PBS中透化5分钟，并用1×PBS洗涤3次。随后，将细胞在2％BSA，0.2％Tween-20/1×PBS（阻止缓冲液）中封闭20分钟。将细胞与相关抗体在室温下阻止缓冲液中孵育1小时，用1×PBS洗涤3次，并与二抗孵育1小时。最后，用1×PBS洗涤盖玻片3次，并使用含有DAPI的Vectashield（Vector Laboratories，H-1200-10）安装。使用Deltavision实时显微镜（应用精度）获取荧光图像。40×/1.4NA，60×/1.4NA和100​​×/1.4NA目标用于采集，所有图像均作为Z堆栈获取。图像用软孔（保守比例为15迭代，应用精度）对图像进行反驳，并用fiji 2.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.52n进行处理。荧光强度显示为任意单位（AU），不同面板之间不可比拟。使用斐济2.0.0-RC-69/1.52N计算共定量定量。使用FIJI 2.0.0-RC-69/1.52N进行组蛋白定量，通过使用DAPI荧光描述核，并计算按面积标准化的平均荧光强度。

　　在不存在或存在CCCP或LCC-12竞争者（10 µM，3小时）的情况下，用LCC-12,4（内部，100 nm，3 h）的AMDM用LCC-12,4（内部，100 nm，3 h）处理，固定并按照荧光显微镜段中的指示进行了通透。固定前，将Mitotracker（Invitrogen，M22426）添加到活细胞中45分钟。对于trientine的细胞内标志性，将活细胞与trientine Alkyne（内部，10μm，3小时）一起孵育。根据制造商的协议，使用Click-IT EDU成像套件（Invitrogen，C10337）制备了点击反应鸡尾酒。在典型的实验中，我们将50μl的10×单击反应缓冲液与20μlCUSO4溶液，1μLAlexa荧光 - 氮，50μl反应缓冲添加剂（抗坏血酸钠）和379 µL超富水以达到最终体积500μL。对于图中所示的变化，用或不带有cuso4和抗坏血酸的反应进行了反应。将盖玻片与喀哒声在室温下在黑暗中孵化30分钟，然后用1×PBS洗涤3次。然后如“荧光显微镜”中所述进行免疫荧光。

　　MDM在盖玻片上生长并激活以获得“细胞培养”中所述的AMDM。用10 µM 15N，13C-LCC-12处理细胞3小时。随后，用1×PBS洗涤细胞两次，一次用0.1 M cacodylate缓冲液（LFG分布，11653）洗涤细胞，然后在0.1 M cacodylate缓冲液中用2％多聚甲醛固定20分钟。然后，将细胞用0.1 M cacodylate缓冲液洗涤3次，并用0.1％Triton X-100在0.1 M cacodylate缓冲液中透化5分钟。随后，将细胞用0.1 M cacodylate缓冲液洗涤3次，并添加0.1 m cacodylate缓冲液中的阻止缓冲液（2％BSA，0.1％Tween），持续20分钟。在阻塞缓冲液中加入初级抗体（1：400）1小时。然后，将细胞用0.1 M cacodylate缓冲液洗涤3次，并在阻止缓冲液中添加10 nm金纳米颗粒的二抗二抗（1:50）1小时。将细胞用0.1 M cacodylate缓冲液洗涤3次，并用1％OSO4（电子显微镜科学，19152）在0.1 M cacodylate缓冲液中处理1小时。用样品盖上样品用毫克水洗涤3次，持续10分钟。随后，用乙醇溶液顺序脱水10分钟：50％，70％，2×90％，3×100％（在分子筛子上干燥，Sigma-Aldrich，69833）。然后将样品与树脂的1：1混合物（电子显微镜科学，十二烯基核酸酐，13710，甲基-5-甲基烯-2,3-二羧酸甲基氢酸酐，19000，DMP-30，13600，13600 and Ladd Research Industries：LADD Research Industries：LX112 Resin，21310）和Dry Ethanol。然后，将样品嵌入纯树脂中1小时。嵌入胶囊（电子显微镜科学，69910-10）充满树脂，倒在盖板上，并在56°C下放置在烤箱中24小时。使用Leica Ultracut UCT微型组制备了厚度0.2 µm的切片。样品部分沉积在干净的硅芯片上（电子基础研究所/CNR和巴黎大学SUD） 并在接触空气后干燥，然后将其引入纳米Sims-50离子微探针（Cameca）。使用CS+原发离子从样品表面产生负次离子。将探针在图像字段和选定的二次离子物种的信号上记录为像素以创建2D图像。记录了12C14N-的图像以提供细胞的解剖结构，而31p-突出了细胞核的位置。通过测量相对于自然丰度水平（0.0037）的12C15N-至12C14N-比例的过量来成像15N标签的细胞分布（0.0037），而一种具有金染色靶向线粒体的抗体的过量。当检测12C15N -ION时，需要适当的质量分辨率能力来区分丰富的13C14N-同烷离子（M/∆M为4,272）。对于每个图像记录过程，应用了多帧采集模式，并记录了数百个图像平面。与197AU图像相对应的15N图像的总体采集时间为12 h和6 h 30分钟。在使用Fiji（2.0.0-RC-69/1.52N）处理图像过程中，使用Tomoj插件正确对齐了连续的图像平面，以纠正长时间获取时的轻微主束位移。然后，通过改进的统计数据获得了总结图像。此外，对于12C15N-至12C14N-比率图，使用OpenMIMS显示出具有增加显着性52的HSI（HUE-饱和强度）颜色图像。色相对应于绝对15N/14N的比率，给定色调处的强度是统计可靠性的索引。

　　根据制造商的说明，用人单核细胞核对象试剂盒（Lonza，VPA-1007）转染人的原发性单核细胞。在用核对象II（lonza）核反理之前，将5×106单核细胞重悬于100μL核对象溶液中，用200 pmol的targetplus smartpool siRNA或阴性对照siRNA（Qiagen，1027310）重悬于。然后立即去除细胞并与5 mL预热的完整RPMI培养基（Gibco）一起孵育过夜。第二天，GM-CSF被添加到培养基中。补充信息中详细介绍了使用的SmartPools的序列。

　　使用以下策略进行了CRISPR淘汰赛。人单核细胞用人单核细胞核对象试剂盒转染（Lonza，VPA-1007）。将500万个单核细胞重悬于100μl核对器溶液中，用100 pmol Cas9（Dharmacon，cas12206）/200 PMOL CD44（Dharmacon，SQ-009999-01-0010）单引导RNA（SGRNA）混合物。将Cas9 -CD44混合物在37°C下与核对象II（LONZA）一起在37°C下孵育10分钟。然后立即去除细胞并与5 mL预热的完整rpmi培养基（Gibco）一起孵育过夜，第二天将GM-CSF添加到培养基中。在第5天，用LPS（100 ng ml -1，24 h）和IFNγ（20 ng ml -1，24 h）激活细胞。在第6天，用BD FACSARIA对CD44-与CD44+种群进行分类。补充信息中详细介绍了用于CD44 SGRNA（编辑R人类合成CD44，3，目标序列）的排序策略和序列。

　　使用CKX41显微镜（Olympus）和Cellens进入成像软件（Olympus）获取明亮场图像。数字图像是使用iPhone 11 Pro（Apple）拍摄的。

　　根据制造商的协议，使用Q蛋白酶线粒体隔离试剂盒（Qiagen，37612）分离线粒体。洗涤细胞并在500克以500克离心10分钟，然后去除上清液。然后将细胞用0.9％NaCl（Sigma-Aldrich，S7653-250G）的溶液洗涤，并重悬于冰冷的裂解缓冲液中，并在4°C下孵育10分钟。然后将裂解液在4°C下以1,000克离心10分钟，并小心去除上清液。随后，将细胞颗粒重悬于中断缓冲液中。通过使用Dounce匀浆器（用于ICP-MS的线粒体）或钝性针和注射器（用于代谢组学的线粒体）获得完全的细胞破坏。然后将裂解液在4°C下以1,000克离心10分钟，然后将上清液转移到干净的管中。然后将上清液在4°C下以6,000克离心10分钟，以获得线粒体颗粒。

　　根据制造商的说明，使用核EZ Prep（Sigma-Aldrich，nuc101-1kt）分离核。简而言之，在刮擦和计数时按照指示并收集细胞。随后，将细胞用1×PBS洗涤两次，并用1 ml冰冷的核EZ裂解缓冲液在冰上裂解5分钟。将悬浮液在4°C下以500克离心5分钟。用核EZ裂解缓冲液洗涤所得的核，并离心以产生一个分离的细胞核。

　　根据制造商的说明，使用内质网富提取试剂盒（Novus Biologicals，NBP2-29482）分离内质网。简而言之，将500 µL的1倍等均匀均化缓冲液加入5 µL 100倍PIC，将其添加到106个细胞的颗粒中。在4°C下以1,000克离心10分钟。将上清液转移到干净的离心管中，并在4°C下以12,000克离心15分钟。浮动脂质层被丢弃。将上清液以90,000g的超速离心分离在干净的离心管中离心1小时。所得的颗粒包含总内质网级分（粗糙而光滑）。

　　1H NMR，13C NMR和15N NMR光谱在298 K或310 K处的500 MHz Bruker光谱仪上记录，化学位移δ在PPM中使用残留溶剂信号作为内标表示在PPM中。为了测量透明质酸四糖与铜的相互作用，将CUCL2溶液的一部分等同于D2O（599μLD2O中的8.6 mg）（8.6 mg）（在599μlD2O中）的一部分被添加到2 mM溶液中，将透明质酸盐四氯（TCI化学物质，h1284）在D22O中的2 mM溶液（1.0 00）D2O）最多1摩尔等效到NMR管。然后，加入了一滴三氟乙酸（TFA，Alfa Aesar，A12198）。在单独的NMR管中，将一滴TFA添加到D2O中透明质酸四糖的无铜2 mM溶液中。为了测量NADH到NAD+的氧化，记录了1H NMR，并准备了管子，并按照以下方式制备试管：NADH（Sigma-Aldrich，N4505-100mg，200 µm，200 µm）或NAD+（Sigma-Aldrich，Sigma-Aldrich，N0632-1G，N0632-1G，200 µm），Imidazole AS（imidazole as in Mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm）（CUSO4）在D2O（10 mM，PD 8.4、981 µL）或D2O中含有磷酸钠缓冲液。1H NMR记录在T0处。H2O2（H2O中的32.3％（w/w％）的19 µL 100倍稀释的溶液）在NMR管中添加到NMR管中，并在1小时后记录1H NMR。

　　将产物纯化在配备有光电二极管阵列检测器（Waters）的制备HPLC Quaternary梯度2545上，该梯度（Waters）配备了反相柱（Xbridge beh c18 OBD Prep列5μm30×150 mm）。除非另有说明，否则在DMSO-D6，甲基氯D2或甲醇-D4中运行NMR光谱。在400或500 MHz的Bruker光谱仪上记录了1H NMR光谱。化学位移δ在PPM中使用残留的非溶剂信​​号作为内标表示。使用以下缩写：EX，可交换；s，辛格；D，Doublet；t，三重态；TD，Doublets的三元组；m，多重。以100.6或125.8 MHz记录了13C NMR光谱，化学位移δ在PPM中使用氘化溶剂信号作为内标表示。最终化合物的纯度，确定为uplc-ms> 98％，低分辨率质谱（LRMS）在水域的生科中记录了配备有光电二极管阵列驱动器和SQ检测器2（UPLC-MS）的Waters Acerity H级，该级别拟合了带有反向的相位柱（Acceational up c18 1.7μmm，2.7μmm，2.150mm，uplc-ms）。HRM在Thermo Scientific Q-extractive和配备有机器人Triversa纳米酸盐趋势的热门Q- Q- Q-extricative上记录。

　　Dicyandiamide (Alfa Aesar, A10451, 500 mg, 5.94 mmol), 1,12-diaminododecane (Alfa Aesar, A04258, 500 mg, 2.50 mmol) and CuCl2 (Sigma-Aldrich, 22.201-1, 249 mg, 1.85 mmol) were suspended in water (6 ml) in a sealed tube and在室温下搅拌1小时，然后在80°C加热48小时。过滤所得的粉红色混合物，并将固体重悬于水中（10 mL）。H2S是由FES（〜100网格粉末，Alfa aesar，17422）滴下37％水（aq。）HCl（Supelco，1.00317.100）产生的，直到混合物变成黑色。过滤黑色混合物，并用1 M aq将滤液酸化至pH 5。HCl的解决方案。在减压下蒸发溶剂。通过制备HPLC（H2O：乙腈：甲酸，95：5：5：5：0.1至0：100：0.1）纯化LCC-12，以提供LCC-12二二酸盐作为白色粉末（280 mg，24％）。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 8.80–8.08 (m, 2H, ex), 8.47 (s, 2H, formate), 7.60–6.78 (m, 12H, ex), 3.14–2.93 (m, 4H), 1.55–1.34 (m, 4H), 1.32–1.18 (m, 16H) ppm.13C NMR（125.8 MHz，DMSO-D6）δ：167.2（构造），160.3，159.2，41.3，29.5（3c），29.2，29.2，26.8 ppm。HRMS（ESI+）M/Z：计算为C16H38N10 [M+2H] 2+ 185.1635，发现185.1637。

　　BIS-（Cyanoguanidino）丁烷（200 mg，0.90 mmol）和丁胺盐酸丁胺（TCI Chemical，B0710，197 mg，1.80 mmol）在密封管中混合在一起，并在150°C下加热，无溶液4 h。冷却至室温后，将混合物在乙醇中摄入，并加入大量过量的乙酸乙酯。通过制备HPLC（H2O：乙腈：甲酸：100：0：0：0：0：0：0：0：0：0：0：0.1至50：50：0.1）过滤白色沉淀物并纯化LCC-4,4二二二酸盐为白色粉末（130 mg，31％）。1H NMR（400 MHz，DMSO-D6）δ：8.82–7.77（M，4H，EX），8.46（S，2H，构造），7.36–6.80（M，8H，EX），3.16–2.99（M，8H），M，8H），1.58-1.37（1.58-1.37（M，8H），1.37-1.3-1.3-1.3-1.3-1.3-1.3-1.3-1。j = 6.8 Hz，6h）ppm。13C NMR（100.6 MHz，DMSO-D6）δ：167.3（构造），159.1（2C），40.9（2C），31.6，26.8，20.0，14.1 ppm。HRMS（ESI+）M/Z：针对C16H38N10 [M+2H] 2+ 185.1635，发现185.1636。

　　Bis-（Cyanoguanidino）丁烷的合成是根据先前发表的程序进行了改编的53。1,4-二氨基丁烷（Acros Organics，112120250，554 mg，5,68 mmol）溶解在水中，并用37％的水溶液搅拌。HCl在室温下持续10分钟。将溶剂在降压下蒸发，并将所得的盐悬浮在丁醇（5 mL）中，用二氯烷钠（Sigma-Aldrich，178322，1.09 g，11.4 mmol）悬浮在140°C中搅拌过夜。过滤后，将固体用丁醇和冷水洗涤，并从水中重结晶，以使Bis-（Cyanoguanidino）丁烷为白色粉末（350 mg，27％）。1H NMR（500 MHz，DMSO-D6）δ：7.62–6.12（M，6H，EX），3.23–2.85（M，4H），1.71–1.15（M，4H）ppm。13C NMR（125.8 MHz，DMSO-D6）δ：161.6，118.8，40.9，26.8 ppm。

　　BIS-（Cyanoguanidino）十二烷（227 mg，0.60 mmol）和But-3-yne-1-氨基盐酸盐（烯胺，EN300-76524，126 mg，1.20 mmol）在密封管中混合在密封管中，并在150°C下加热，无需溶于4小时。冷却至室温后，将混合物在乙醇中摄入，并缓慢加入大量过量的乙酸乙酯。通过制备HPLC（H2O：乙腈：甲酸：95：5：5：5：0.1至40：60：0.1）过滤白色沉淀物并纯化LCC-12,4二二二酸盐作为白色粉末（102 mg，30％）。1H NMR（500 MHz，DMSO-D6）δ：9.05–7.95（M，4H，EX），8.47（S，2H，构造），7.60–6.60（M，8H，EX），3.29–3.16（M，4H），3.11-11-3.33.004H），1.49–1.38（M，4H），1.33–1.18（m，16h）ppm。13C NMR（125.8 MHz，DMSO-D6）δ：167.6（构造），159.7，158.5，82.6，72.7，41.3，40.3，40.3，29.5（3C），29.2，29.2，26.8，19.4 ppm。HRMS（ESI+）M/Z：计算为C24H46N10 [M+2H] 2+ 237.1948，发现237.1947。

　　Bis-（Cyanoguanidino）十二烷的合成是根据先前发表的程序进行了改编的53。将1,12-二氨基二烷（500 mg，2.5 mmol）溶解在水和甲醇的混合物中，并用37％的水溶液搅拌。HCl在室温下持续10分钟。将溶剂在降压下蒸发，并将所得的盐悬浮在丁醇（2.5 mL）中，用二氰酰胺（444 mg，5.0 mmol）悬浮在丁醇（2.5 mL）中，并在140°C搅拌过夜。过滤后，将固体用丁醇和冷水洗涤，并从水的混合物中重结晶：乙氧基乙醇（2：1），以将Bis-（Cyanoguanidino）十二烷作为白色粉末（365 mg，44％）。1H NMR（400 MHz，DMSO-D6）δ：7.21–6.18（M，6H，EX），3.11–2.94（M，4H），1.49–1.34（M，4H），1.33–1.14（M，14H），1.33–1.14（m，16h）ppm。13C NMR（100.6 MHz，DMSO-D6）δ：161.6、118.8、41.0、29.4（3C），29.2、26.7 ppm。

　　15n和13c标记的dicyandiamide（Eurisotop，CNLM-9324-PK，50 mg，0.55 mmol），1,12-二氨基二烷烷（46.8 mg，0.23 mmol）和Cucl2（0.23 mmol）和CUCL2（31.4 mg，0.23 mmol）均采用1.6毫克，并悬挂在WEALS（0.23 mmol）中（0.6 mmol）（0.6 MMOL）（0.6），并均匀地温度（0.6），并搅拌（0.6），并均匀地温度（0.6）（0.6）在80°C加热48小时。将所得的粉红色混合物用水溶液酸化。HCl（2 m，1 mL）的溶液直至完全溶解沉淀物。通过制备HPLC（H2O：乙腈：甲酸：95：5：5：5：5：5：5：5：5：5：0.1至73：27：0.1）纯化混合物在降压下浓缩，同位素标记的LCC-12纯化。1H NMR（500 MHz，DMSO-D6）δ：8.60–7.76（M，2H，EX），8.48（S，2H，构造），7.70–6.30（M，12H，EX），3.12–2.95（M，4H），M，4H），1.53-1.35（1.53-1.35（M，M，4H），1.33-3-3-3-3-3-3-18-18-18-18-18-18（M.18）。13C NMR（125.8 MHz，DMSO-D6）δ：167.0（构造），160.2，159.2，41.3，29.5（3c），29.2，29.2，26.8 ppm。15n NMR（50.7 MHz，DMSO-D6）δ：156.2，84.1（2n），81.2 ppm。HRMS（ESI+）M/Z：针对C1213C4H37N215N8 [M+H]+381.3095计算，发现381.3093。

　　在氩气气氛下，将二盐二氢氯化物（圣克鲁斯生物技术，SC-216009，0.050 g，0.228 mmol）溶解在0°C的无水甲醇中，然后添加4-（Prop-2-ynyloxy） - 苯甲酰苯二甲酸盐和0.073 mmg，0.073 mmMMMMMMMMMM，4Å。将混合物在室温下搅拌3小时，然后在添加NABH3CN（0.026 g，0.684 mmol）之前，并在室温下搅拌过夜。接下来，对反应混合物进行过滤，将滤液在降压下蒸发，并通过制备HPLC（H2O：乙腈：甲酸：95：5：5：5：0.1至73：27：0.1）纯化，以使Trientine Alkyne作为白色粉末（20.7 mg，21％）。1H NMR（500 MHz，甲醇-D4）δ：7.40–7.33（M，4H），7.06–6.99（M，4H），4.74（D，D，J = 2.4 Hz，4H），3.97（S，4H），3.00-2.91（M，10H），3.00-2.91（M，10H），2.87（2.87（S.87），S，4H）。13C NMR（125.8 MHz，甲醇-D4）δ：159.4、131.7（2C），128.7、116.4（2C），79.6、76.9、56.7、52.4、52.4、47.7、46.7、46.8（2C）。（ESI+）M/Z：针对C26H35N4O2 [M+H]+435.2755，发现435.2758。

　　如先前报道的溶酶体铜探针Lys-Cu合成，光谱数据与文献一致26。1H NMR（400 MHz，甲基氯D2）δ：8.69–8.59（M，2H），8.31（DD，J = 8.5，1.2 Hz，1H），8.04（D，D，J = 1.5 Hz，1H），1H，1H），7.82-7.69（M，2H）（M，2H），7.64（7.64（7.64），dd，DD，1。7，dd，1。(d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.60 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 2.5 Hz, 2H), 6.38 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 2H), 4.33 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.74 (s, 2H), 3.65–3.62 (m, 4H), 3.40–3.34（M，9H），2.69（t，j = 6.9 Hz，2h），2.56（s，3h），1.19（t，j = 7.1 Hz，12h）。

　　如先前报道的线粒体铜探针MCU-2合成，光谱数据与文献一致39。1H NMR（400 MHz，DMSO-D6）δ：9.89（S，1H），8.07-7.67（M，16H），7.58–7.45（M，2H），7.02–6.93（M，M，1H），6.806.58–6.36（M，4H），4.44（S，2H），4.08（t，j = 6.0 Hz，2H），3.75–3.58（M，2H），2.02–1.83（M，M，2H），1.83–1.60（M，2H）。

　　使用改良的公开方法25,55合成甲基化的透明质酸盐（METH-HA）。简而言之，在室温下，将1克透明质酸钠（600-1,000 kDa）溶解在200毫升蒸馏水中。然后将琥珀阳离子阳离子交换树脂（H+）（10 g）添加到溶液中，并在室温下搅拌一天。随后将树脂从溶液中过滤。然后，使用四氧化铵（TBAOH）中和所产生的溶液，以获得（四丁丁基铵）tba-氢烯酸盐酸氢醛酸酯，如下所示：TBAOH，用水稀释到液体酸液滴液滴至先前准备的透明质酸溶液中，直到pH启用8。直到溶解液。将0.530 g的TBA-羟醛酸酯溶解在30°C的10 mL DMSO中，然后加入1.5 mL甲基碘化物，并将溶液保持在30°C过夜。在恒定搅拌下将所得的混合物缓慢倒入200 mL乙酸乙酸乙酯中。将获得的白色沉淀物过滤并用100 mL乙酸乙酯洗涤四次，最后在室温下真空干燥24小时。通过1H NMR光谱和尺寸排斥色谱法证实了透明质酸盐的甲基化。在含有0.125 M甲氧氧化钠的D2O的Bruker 400 MHz光谱仪上获取了1H NMR光谱，以增加透明质酸质子的迁移率，从而改善了光谱分辨率。1H NMR光谱显示在1.79–1.86 ppm处的甲基NHCOMEN的峰，以及在2.61、2.78 ppm和3.22 ppm时的甲基OME峰。

　　Cu（Met）2的起始结构基于已发布的X射线结构56。通过分子动力学构象搜索（Gabedit57，Amber99（参考文献58）电势）获得了其他铜复合物的起始几何形状。对于每个复合物，使用MOPAC2016（PM7（参考文献59），COSMO60水模型）重新优化了由分子动力学搜索产生的最低能量的十种几何形状。使用ORCA 4.2.1（参考文献61）在TPSSH/D3BJ/DEF2-TZVP水平上优化了每个配合物的最低能量的几何形状。我们使用B3LYP62，M062X63，TPSSH，BHLYP64,65功能基于CU（MET）2的结构进行了基准研究，并使用DEF2-TZVP66基集使用D3BJ67分散校正和CPCM水溶液溶解模型。我们还将BHLYP功能与SVP基集和SMD水溶液模型一起使用，SMD水溶液模型在文献68中建议用于铜络合物。

　　UBHLYP功能64,65与SVP基set69,70和SMD溶剂化模型71,72相关联，以代表描述[Cu（H2O）6] 2+物种的适当方法68。因此，所有原子（Doublet Spin态）在Ubhlyp/SVP水平上使用高斯16个程序（Doublet Spin态）优化了所有结构（最小值和过渡状态）。在优化过程中应用了SMD溶剂化模型（水）。在310.15 K下计算对Gibbs自由能的热校正。进行UMP2/SVP水平的单点。列出的结果为Kcal mol -1中的ΔG298。选择MDHNA作为NADH模型，以研究铜催化的氢化物转移至H2O2。

　　制备HRMS溶液并在没有进一步稀释的情况下注射。LCC-12：K2CO3（1：2）（100 µM）或二甲双胍的储备溶液：K2CO3（1：1）（200 µm）在分析级甲醇中制备。Stock solutions of metals, CuCl2.2H2O (Acros Organics, 405840050, 100 µM), MnCl2 (Sigma-Aldrich, 244589, 100 µM), CaCl2.2H2O (Acros Organics, 423520250, 100 µM), FeCl2.xH2O (Alfa Aesar, 12357, 100 µM),MGCl2.6H2O（Prolabo，25 108.295，100 µm），NICL2（Alfa Aesar，53131，100 µM）和ZnCl2（Sigma-Aldrich，429430，100 µM）在MilliQ水中制备。用LCC-12：K2CO3（10 µL）在甲醇（80 µL）中制备HRMS溶液，并具有1：1比例的相关金属（10 µL），或用二甲甲蛋白：K2CO3（10 µL）和CUCL2.2H2O（10 µL）（10 µL），并具有2：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。

　　对于在HEPES（10 mM）中的LCC-12（5μM）的溶液中，将HEP2溶液（10 mm）溶液的0.1 mol等效添加至3 mol等效剂。使用微型比色杯（Quartz Excellence Q 10毫米），在室温下，在室温下，在室温下，在室温下在Analytik Jena UV/ VIS分光光度计205系统上记录UV光谱。所有光谱都在HEPES缓冲液上遮挡。

　　NADH（Sigma-Aldrich，N4505）的氧化动力学之后，使用Cary 300 UV-VIS光谱仪测量340 nm的吸光度。在37°C下，用Pelletier Cary温度控制器（Agilent Technologies）记录了测量值。Stock solutions of NADH (1 mM), imidazole (Sigma-Aldrich, 56750, 100 mM), CuSO4 (Sigma-Aldrich, 451657, 500 µM), LCC-12 (10 mM or 1 mM), metformin·HCl (Alfa Aesar, J63361, 100 mM or 10 mM) and LCC-4,4 (10MM）在调节至pH 8.0的10 mM磷酸钠缓冲液中制备。H2O2的浓度（Sigma-Aldrich，16911，32.3％的H2O中）通过用KMNO4滴定确定，并在磷酸盐缓冲液中稀释100次。在一次性的比色绿色中，使用磷酸钠缓冲液和各自的储备溶液制备了1 ml实验溶液，以达到图3F所描述的最终浓度，通过添加：NADH（200 µL），咪唑（100 µL），CUSO4（20 µL），CUSO4（20 µL），LCC-12（20 µL），LCC-12（20 µL），LCC-4,4（20 µLCC-4,4（20 µLCC-4,4）指示为T0时的H2O2溶液（19 µL）。NADH的浓度是从340 nm的测得的吸光度及其摩尔灭绝系数计算的。

　　根据制造商的协议，使用荧光测定法（ABCAM，AB176723）测量NADH的绝对浓度。每个条件收集至少500,000个细胞。收集浮细胞，并用1×PBS洗涤粘附的细胞。将粘附的细胞与1×PBS与10 mM EDTA孵育，然后与收集的浮动细胞一起刮擦并合并。随后将细胞用冰冷的1×PBS洗涤并计数，然后以1,500 rpm离心5分钟，然后丢弃上清液。然后将沉淀重悬于100 µL裂解缓冲液（套件组件）中，并在37°C下孵育15分钟。加入NAD+和NADH提取溶液以及NAD+/NADH控制溶液（套件组件），并在37°C下以15 µL样品的体积在37°C下孵育15分钟，至相应的缓冲液的15 µL（套件组件）。使用15 µL各自的缓冲液（套件组件）停止反应。最后，加入了75 µl NAD+/NADH反应混合物（NAD+/NADH回收酶混合物和传感器缓冲液，套件组件），并在室温下孵育1小时的混合物。使用Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2微板读取器记录荧光强度（激发540 nm；发射590 nm）。值是从每个实验的标准曲线得出的，并将其与基于质谱的代谢组学获得的数据进行比较，以计算总NADH浓度。

　　在典型的实验中，将150万个细胞用于总提取物和1500万细胞用于线粒体提取物。收集细胞并去除上清液以产生相应的细胞颗粒。随后，将颗粒干燥并补充300 µL甲醇，涡旋5分钟，离心（在15,000g，4°C下为10分钟）。然后，将上清液的上层分为两个部分：使用微管中的气相色谱 - 质谱法（GC -MS）实验，将其余150 µL用于超高压液相色谱 - 质量 - 质量 - 质谱法（UHPLC – MS）。对于GC -MS等分试样，将上清液完全从样品中蒸发。将50 µL甲氧基胺（吡啶中的20 mg ml -1）添加到干燥的提取物中，然后在室温下在黑暗中储存16小时。第二天，加入了80 µL的N-甲基N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰氨酰胺，并在40°C下发生最终衍生化30分钟。然后将样品转移到小瓶中，并直接注射进行GC -MS分析。对于UHPLC-MS等分试样，将150 µL在微管中以气动辅助浓缩剂（Techne DB3）干燥。将干燥的UHPLC -MS提取物用200 µL MILLIQ水溶解。将等分试样转移到液相色谱小瓶中，并注入UHPLC -MS或保持–80°C直至注射。对细胞内代谢物气相色谱的广泛靶向分析，该分析耦合到三倍的量子质谱仪（QQQGGC – MS）：GC – MS/MS方法在7890A气体色谱（敏捷技术）上与脉动启用技术（敏捷的技术）进行了良好的启动式技术（模式73。使用Agilent Mass Hunter定量软件（B.07.01）进行了分析物的峰检测和整合。通过离子配对超高性液相色谱（UHPLC）对核苷酸和辅因子的靶向分析 耦合到三极四极杆（QQQ）质谱仪：在RRLC 1290系统（Agilent Technologies）上进行有针对性的分析，该系统（安捷伦技术）与配备了在负极和正面模式下运行的电喷雾源的三倍四极杆6470（Agilent Technologies）。气体温度设置为350°C，气流为12 l min -1。毛细管电压在正模式下设置为5 kV，在负模式下将4.5 kV设置为4.5 kV。从敏捷技术的Zorbax Eclipse XDB-C18（100毫米×2.1 mm粒径1.8 µm）中注入十微透明的样品，该样品受敏捷技术的保护，受保护列XDB-C18的保护（5 mm×2.1 mm×2.1 mm粒径1.8μm），并在40°C下由Pelletier oven进行40°C的热量。梯度流动相由2 mM乙酸二丁胺浓缩物（DBAA）（A）和乙腈（B）组成。流速设置为0.4 mL min -1，初始梯度为90％A期A和10％B期，该梯度维持3分钟。然后在1分钟内使用梯度从10％到95％的B期洗脱分子。使用95％流动期B平衡2分钟将色谱柱洗涤，并使用10％流动相B进行平衡1分钟，并将自动采样器保持在4°C。使用的扫描模式是生物样品的MRM。使用Agilent Mass Hunter定量软件（B.10.1）进行了分析物的峰检测和整合。通过UHPLC耦合到Q激活质谱仪的UHPLC对细胞内代谢产物的伪靶向分析。相反的相乙腈方法：分析实验是使用Dionex Ultimate 3000 UHPLC系统（Thermo Fisher Scientific）进行的，该系统与配备有电源源的Q激活（Thermo Fisher Scientific）结合使用，该Q-激活（Thermo Fisher Scientific）在100到1,200 m/z中，配备了电喷雾源，并在100到1,200 m/z中运行。Q激活参数为：鞘气流流量55 AU，辅助气流流量15 au，喷雾电压3.3 kV，毛细管温度300°C， S型镜头RF水平55 V.用乙酸钠溶液校准质谱仪，用于低质量校准。将10μl样品从Agilent Technologies中注入SB-AQ色谱柱（100 mm×2.1 mm粒径1.8μm），受到防护柱XDB-C18（5 mm×2.1 mm×2.1 mm粒径1.8μm）的保护，并在40°C下由Pelletier Oven加热。梯度流动相由水与0.2％乙酸（A）和乙腈（B）组成。流速设置为0.3 mL min -1。初始条件为98％A期A和2％的B期B。然后使用梯度从2％到95％B期22分钟洗脱分子。使用95％流动相B进行2分钟洗涤该色谱柱，并使用2％流动相B进行4分钟的平衡。将自动采样器保持在4°C。使用Thermo Xcalibur定量软件（2.1。）73进行了峰检测和集成。

　　如图所示，生长并处理细胞。与1×PBS在37°C下用10 mM EDTA孵育后，通过刮擦来收集全细胞提取物。在4°C下以1,500G离心5分钟后，用冰冷的1×PBS两次洗涤细胞，并使用裂解缓冲液（8 m尿素，200 mM NH4HCO3，完成）在4°C的旋转轮上裂解1 h。在20,000g（4°C）离心20分钟后，含有蛋白质的上清液用于全局蛋白质组分析。简而言之，使用无标签方法用Orbitrap Eclipse质谱仪进行定量分析全局蛋白质组。通过在57°C下与5 mM二硫硫代醇（DTT）孵育30分钟，然后在室温下在黑暗的室温下用10 mM的碘乙酰胺在57°C下孵育30分钟，从而减少约10μg的总蛋白细胞裂解物。然后将样品用100 mM碳酸氢铵稀释，以达到1 M尿素的最终浓度，并在37°C下用胰蛋白酶：Lys-C（Promega，V5071）以1:50的比例消化过夜。然后将样品加载到自制的C18 stagetips上以进行脱盐。通过与40:60乙腈孵育：含0.1％甲酸的水从珠子中洗脱肽。在液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）分析之前，将肽在SpeedVac中干燥，并在10μL0.3％TFA中重构。使用RSLCNANO系统（Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific）在线与Orbitrap Eclipse质谱仪（Thermo Fisher Scientific）在线耦合，将4μL的样品色谱分离。Peptides were first loaded onto a C18-trapped column (75 μm inner diameter × 2 cm; nanoViper Acclaim PepMap 100, Thermo Fisher Scientific), with buffer A (2:98 MeCN:H2O with 0.1% formic acid) at a flow rate of 3 μl min−1 over 4 min and then switched for separation to a C18 column (75 μm inner diameter ×50 cm;纳米植物C18、2μm，100Å，Apraim pepmap RSLC，Thermo Fisher Scientific），温度为50°C，线性梯度为2至30％ （100％MECN和0.1％甲酸）在211分钟内的流速为300 nl min -1。在Orbitrap中收集了MS1数据（120,000分辨率；最大注射时间60 ms； AGC 4×105）。对于MS2分析，需要2至5的电荷状态，并且使用了45 s的动态排除窗口。MS2扫描在离子陷阱中以HCD片段化（隔离窗口1.2 da; NCE 30％;最大注射时间60 ms; AGC 104）进行快速模式进行。蛋白质的身份是从UniProt人类规范数据库（UP000005640_9606）通过sequest HT通过蛋白质组发现器（版本2.4）（Thermo Scientific）建立的。将酶的特异性设置为胰蛋白酶，并最多允许两个丢失的切割位点。将氧化的蛋氨酸，蛋氨酸损伤，蛋氨酸 - 叶乙酰基和N末端乙酰化设置为可变修饰。将半胱氨酸蛋白的氨基甲基化设置为固定修饰。对于单异位素前体离子，将最大允许的质量偏差设置为10 ppm，MS/MS峰为0.6 DA。使用MyProms v3.9.3（https://github.com/bioinfo-pf-curie/myproms)74进一步处理所得文件。对于错误的发现率（FDR）计算，我们使用了Percolator75，并且在整个研究的肽水平上将其设置为1％。通过MassChroq版本2.2.21（参考文献76）计算的肽提取的离子色谱图（XICS）进行无标签定量。对于蛋白质定量，使用了比较条件（TOPN匹配）之间共享的蛋白质型XIC，最多两次丢失的裂解和氨基甲基甲基修饰。对总信号应用了中值和尺度归一化，以纠正每个生物学重复的XIC。为了估计蛋白质丰度变化的重要性，是线性模型（根据肽和生物学重复调整） 执行并使用对照阈值设置为0.05的Benjamini -Hochberg FDR程序调整P值，并且蛋白质应至少具有3个肽75。

　　根据制造商的说明，使用荧光乳酸分析（ABCAM，AB65330）对细胞外乳酸进行定量。收集细胞的培养基并以500克离心5分钟。随后将上清液以20,000克离心10分钟。然后使用10 kD旋转柱（ABCAM，AB93349）脱蛋白，然后将上清液剥离。通过将100 nmol µl -1乳酸标准的5 µL添加到495 µL乳酸化测定缓冲液中来制备乳酸标准。随后，通过将10 µL的1 nmol µl -1标准稀释至990 µL乳酸化测定缓冲液，从而产生1 ml 0.01 nmol µl -1乳酸标准。在96孔板中，添加了每孔0-0.1 nmol的标准样品。为每个孔准备了46 µL乳酸测定缓冲液，2 µL探针和2 µL酶混合的反应混合物。为了进行背景测量，将48 µL乳酸测定缓冲液与2 µL探针混合，以获得背景反应混合物。将每个样品的五十微升添加到96孔板中，并加入反应混合物或背景反应混合物。将样品在室温下孵育30分钟。使用Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2微板读取器记录荧光强度（激发540 nm；发射590 nm）。值是从标准曲线得出的。

　　使用荧光甘油醛3-磷酸盐测定试剂盒（ABCAM，AB273344）对甘油醛3-磷酸（GA3P）进行定量，以调整制造商的说明。将细胞用1×PBS洗涤两次，然后在100 µL GA3P测定缓冲液中收集到离心管中。将样品放在冰上10分钟，然后以10,000×g离心10分钟。收集上清液，然后使用10 kD自旋柱（ABCAM，AB93349）进行脱蛋白。对于每个测试样品，将10 µL样品添加到三个平行的井中，中的平面96孔板。将样品背景对照，未加入和加标本的样品添加到这三个井中。尖刺样品包含200 pmol的GA3P标准。每孔添加50 µL的GA3P测定缓冲液。对于测定空白，每孔添加50 µL GA3P测定缓冲液。在每个背景中，加入了由46 µL GA3P测定缓冲液，2 µL GA3P酶混合和2 µL GA3P探针组成的50 µL反应混合物。加入了每个剩余的50 µL反应混合物，其中包括44 µL GA3P测定缓冲液，2 µL GA3P开发人员，2 µL GA3P酶混合物和2 µL GA3P探针。使用Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2微板读取器记录荧光强度（激发540 nm；发射590 nm）。每隔1分钟进行几个读数。通过减去背景样本值计算最终的GA3P浓度。

　　使用V-PLEX促炎性面板（MSD，K15049D-1）在细胞培养上清液中测量细胞因子水平。该套件是根据制造商的协议运行的，化学发光信号是在2400（MSD）上测量的。

　　使用RNeasy Mini套件从MDM中提取RNA（Qiagen，74104）。使用Illumina Truseq绞合的mRNA文库制备试剂盒（Illumina，20020594）从1μg总RNA制备RNA测序文库，该库允许使用链特异性测序。使用磁珠选择多A选择的第一步，以允许对聚腺苷酸化的转录本进行测序。片段化后，进行cDNA合成，并将所得碎片用于DA尾部，然后连接Truseq索引适配器（Illumina，20020492）。随后，进行聚合酶链反应放大以生成最终的条形码cDNA库。根据2×100循环模式（配对 - 末端读数，100个碱基），对来自Illumina的Novaseq 6000仪器进行了测序。有关来自体内鼠模型的细胞上的RNA-Seq，请参见各自的段落。首先使用FASTQC（0.11.8）检查了原始测序读数的质量，并使用Trimgalore（0.6.2）软件对适配器序列进行了修剪。然后，使用Star Mapper（2.6.1b）将修剪的读数对齐在人HG38参考基因组上，直到每个基因生成原始计数表（Gencode注释V29）。用于这些任务的生物信息学管道可以在线获得（RAWQC v2.1.0：https：//github.com/bioinfo-pf-curie/raw-qc，rna-seq v3.1.4：https：//github.com/github.com/bioinfo-pf-curie/rna-rna-seq）。然后，下游分析仅限于蛋白质编码基因。文献77的数据通过保持注释为巨噬细胞，然后将每个样品的计数求和来转化为批量。从登录号GSE73502下载了文献中的计数44。从文献中的原始数据45,46从NCBI简短读取档案中下载在记录下，根据PRJNA528433和PRJNA290995，并如上所述处理。对于L. Major，我们在感染后4小时使用了数据；对于A. fumigatus， 感染后2小时，我们使用了数据。使用EDGER（V 3.30.3）78的TMM归一化将计数标准化。用Limma/VOOM框架（v 3.44.3）79评估差异表达。通过使用Limma的重复关系来控制Donor内相关性。调整后的P值<0.05的基因被标记为显着。已经使用ClusterProfiler软件包v3.16.1的富集函数进行了差异表达基因的富集分析。

　　如所述生长并处理细胞。在室温下以1,500克离心5分钟。将沉淀的细胞重悬于培养基中，在室温下与1％甲醛交联10分钟。然后，将2.5 m的甘氨酸添加至0.125 m的最终浓度，并在室温下孵育5分钟，然后在4°C下以1,500g离心5分钟。用冰冷的1×PBS将沉淀的细胞洗涤两次，并在4°C下以1,500g离心5分钟收集。将颗粒重悬于裂解缓冲液A（50 mm Tris-HCl pH 8，10 mm EDTA，1％SDS，完成）中，并在4°C的旋转轮上孵育30分钟。接下来，将裂解液以1,500克离心15分钟，以防止SDS沉淀，并丢弃上清液。然后将颗粒剪切在缓冲液B中（25 mm Tris-HCl pH 8，3 mm EDTA，0.1％SDS，1％Triton X-100，150 mm NaCl，完整）至约200-600 bp的平均尺寸，使用Bioruptor pico（iagego）。在4°C下在20,000g处离心15分钟后，将含有剪切染色质的上清液用于免疫沉淀。剪切染色质的25微透明（10％）用作输入DNA，以使测序数据归一化。作为归一化的额外控制，使用了果蝇（活动基序，53083）和峰值抗体的尖峰染色质。使用剪切的染色质和针对特异性组蛋白标记的染色质免疫沉淀（每个芯片条件100万个细胞）进行，随后将其与H3K27AC，H3K14AC，H3K14AC，H3K9AC，H3K27和H3K27和H3K27和H3K27ME同变蛋白G蛋白G胶状磁珠（Invitrogen，10003d）进行复合。简而言之，将每种抗体与1μg尖峰抗体混合。然后，在冰冷的缓冲液C（20 mm Tris-HCl pH 8，2 mm EDTA，0.1％SDS，1％Triton X-100，150 mm NaCl中洗涤3次22μl磁珠，并完整），并与抗体混合物孵育4 h （494μl）。旋转和去除上清液后，将珠重悬于50μl的缓冲液中。随后将这种悬浮液与先前先前与50 ng的果蝇中混合的250μl剪切染色质一起孵育。旋转后，将上清液丢弃，并在缓冲液C（两次），缓冲液D（20 mm Tris-HCl pH 8，2毫米EDTA，0.1％SDS，1％Triton X-100，500 mm NaCl），NACL），buffer E（10 mm Tris-Hcl PH 8，0.25 m licl，0.25 m licl，0.5％NP）中连续洗涤珠。1毫米EDTA），一次在缓冲液F（10 mm Tris-HCl pH 8，1 mm EDTA，50 mm NaCl）中。最后，将输入和免疫沉淀的染色质样品重悬于含有TE缓冲液/1％SD的溶液中，通过在65°C的65°C加热过夜，并遭受RNase A（Invitrogen，12091-039，12091-039，1 mg ML-1）和蛋白酶K（Thermo Crecientic k（Thermo Crecientic），EOO0491，EOO049 1 MEO049。输入和免疫沉淀的DNA提取：在反向交联后，用RNase A和蛋白酶K和糖原（Thermo Scientific，R0561，20 mg ML -1）处理反向交联后，输入和免疫沉淀的染色质样品。将样品在37°C下孵育2小时。使用8 m licl（终浓度0.44 m）和苯酚：氯仿：异氧氨基醇进行DNA沉淀。样品在4°C下以20,000克离心15分钟。通过涡旋将上层与氯仿混合。在4°C下以20,000g离心15分钟后，将上相通过涡旋与–20°C绝对乙醇混合，并在–80°C下储存2小时。接下来，将样品在4°C下以20,000克的含量为20,000克。将颗粒用冰冷的70％乙醇洗涤，并在4°C下以20,000克离心15分钟。将上清液丢弃，并在室温下干燥颗粒，溶解在无核酸酶的水中，并使用量子荧光测定法（Invitrogen）进行定量 根据制造商的协议。图书馆的准备和测序：根据制造商的协议（IP-202-1012），使用Illumina Truseq芯片库制备套件从输入和免疫沉淀的DNA中制备Illumina兼容库。简而言之，将4至10纳图DNA进行末端修复，DA尾和连接的Truseq索引光照明适配器。在最终的PCR扩增步骤（带有15个周期）之后，使用KAPA库定量试剂盒（Roche，07960336001）对所得的条形码库进行了等效合并并通过定量PCR定量。测序是在Novaseq 6000（Illumina）上进行的，针对每个样品的7500万个簇，并使用配对端2×100 bp进行测序。在https://github.com/bioinfo-pf-curie/chip-seq上，已使用Institut Curie芯片芯片nextflow Pipeline（1.0.6）进行了芯片– Seq数据处理和质量控制。简而言之，对衔接含量进行了修剪，并在人类参考基因组HG38与BWA-MEM对齐。低质量的映射读数，读取在编码黑名单区域，读取在尖峰基因组上的读取，并从分析中丢弃了标记为重复项的读数。然后，使用DeepTools生成Bigwig Tracks，并标准化为100万读，以解释测序深度的差异。为了将组蛋白标记富集与基因表达数据（RNA-SEQ）整合在一起，验证型信号已在转录启动位点（±2 kb）上计数允许组蛋白标记的转录启动位点（±2 kb），或在基因体处计入抑制性组蛋白标记的基因体。Gencode V34的编码基因已用于注释。然后已经过滤芯片 - 序列计数数据以删除低计数，并使用TMM方法（EDGER R软件包）进行了归一化。然后，已经计算出所有基因和供体的倍数变化。

　　根据2010/63/EU的Fidelta（现为Selvita），使用LPS小鼠模型进行了生存评估，并根据科学研究和其他目的进行了实验动物的使用（官方公报55/13）。动物研究伦理机构委员会（CARE-ZG）监测了与动物相关的程序，以确保它们不会损害动物福利。实验是在八周大的雄性BALB/C小鼠上进行的。其他涉及LP和CLP小鼠模型的实验是根据法国有关动物实验的法律（＃20210722216346511）进行的，并得到了Saint-de-Saint-de-quentin-en-en-envelines大学机构动物护理和使用委员会的批准（C2EA-47）。这些LPS实验是在八周龄的雄性BALB/C小鼠和五周大的雄性瑞士小鼠上进行的，涉及CLP模型的实验是在为期9周大的雄性BALB/C小鼠上进行的。小鼠被安置在最先进的动物护理机构中（2CARE，县号协议：A78-322-3，法国）。对于涉及SARS-COV-2的实验，使用了8周大的雄性K18-Human ACE2表达C57BL/6小鼠。在当地委员会评估生物学风险委员会验证协议之后，在生物安全3级设施中使用了SARS-COV-2小鼠模型，并遵守了当前的国家和机构法规和道德准则（Institut de Lille/B59-350009）。使用动物的实验方案得到了机构伦理委员会的“Comitéd” Extemique En实验Animale（CEEA）75，Nord-Pas-de-Calais的75。该动物研究由“教育，研究与创新部”授权，根据APAFIS＃25517-2020052608325772V3授权。在图卢兹大学的生物安全3级设施中使用了SARS-COV-2小鼠模型。这项工作由动物研究伦理机构委员会监督 （许可APAFIS＃27729-2020101616517580 V3，法国研究部长（CEEA-001），以确保与动物相关的程序不损害动物福利。每个笼子中有四只小鼠被放在带有媒体浓缩元件的通风架上。所有动物设施中的小鼠均在通风笼中（温度22°C±2°C，湿度为55％±10％），并在12小时的光/暗周期中自由获取水和食物。在整个过程中，将男性同窝仔随机分配给实验组。

　　生存评估是在Fidelta（现为Selvita）进行的。将LPS（Sigma-Aldrich，L2630，20 mg kg-1）腹膜内注射到雄性BALB/C小鼠（8周大）。LCC-12（0.3 mg kg-1，腹膜内注射，n = 10）或媒介物（0.9％NaCl，10 mL kg-1，腹膜内注射，n = 10）在挑战之前2小时，然后在挑战后24 h，48 h，72 h，72 h，72 h，72 h，72 h，72 h和96 h。在LPS挑战之前，给出了地塞米松（10 mg kg -1，口服膨胀，n = 10）。每4小时至48小时监测死亡率的发生率，然后每天两次。细胞仪工作，ICP-MS，Western印迹和RNA-Seq工作是在八周大的雄性BALB/C小鼠和五周大的雄性瑞士小鼠上进行的。通过腹膜内注射LPS（BALB/C小鼠中的5 mg kg-1（Escherichia Coli O111：B4，Sigma-Aldrich，L2630）或瑞士小鼠中的20 mg kg-1）诱导了实验性内毒素模型。在LPS给药后6小时，将所有小鼠用30 ml kg -1体重的盐水复苏。腹膜内注射LCC-12（0.3 mg kg-1）。LPS挑战后22小时杀死小鼠。在LPS挑战后0小时，6小时和22小时测量体温。流式细胞仪：在LPS挑战后22小时安乐死后，将器官灌注PBS/EDTA（1 ml G -1，2 mm，pH 7.4），并在腹膜中注入10 ml 1×PBS。然后收集腹膜液体，并以1,500 rpm的速度离心5分钟。将颗粒重悬于含2％胎牛血清的RPMI培养基中（Dutscher，S181H-100）。然后将腹膜液体以2,000 rpm的速度在96孔板中洗涤2分钟，然后将颗粒悬挂在完全的rpmi中。对于细胞内蛋白染色，将样品在Brefeldin A（BFA，5 ng ml-1，Invitrogen，00-4506-51）中孵育2小时，然后用可固定的生存能力780（Invitrogen，65-0865-14），65-0865-14），经过45-0865-14），含有荧光量（35）。固定与BFA一起孵育的样品（FOXP3/Transcription因子固定/PERS 4X，细胞信号，44931s）在4°C下持续20分钟并透化（流式细胞仪PURS BAFPER 10X，TONBO，TNB-1213-L150），然后再进行细胞内染色。The antibodies used were as follows: CD11b-Pacific Blue (BioL​​egend, 101224), CD40-APC (BioL​​egend, 124612), CD45-BV510 (BioL​​egend, 103138), CD86-PE (BioL​​egend, 105007), CD170 (Siglec-F)-PEeFluor 610 (eBioscience,61-1702-80），F4/80-BV605（Biolegend，123133），I-A/I-E-E-AF700（Biolegend，107622），LY6C – PERCP/CY5.5（Biolegend，128012）和Ly6g – Pe/cy7（Biolegend，128012）和Ly6g – Pe/Cy7（Biolegend，1276618）。对于细胞内染色，使用了NOS2-APC（EBISoscience，17-5920-82）。SPM对应于CD45+IA-IE+CD11b+F4/80intsigleCf-细胞。用PBS或使用PERS缓冲液洗涤后，使用LSR Fortessa流式细胞仪（BD Biosciences）获取数据，并用FlowJo进行分析。软件v。10.8.2。如“ ICP-MS”中所述，使用SPMS进行了ICP-MS实验。针对干重的组织特异性数据归一化。使用以下抗体进行SPMS分选：CD11B-太平洋蓝色（Biolegend，101224），F4/80-PE（Tonbo，TNB50-4801-U100），LY6C – Percp/cy5.5（Biolegend，Biolegend，128012）和LY6G – AFC647（Biolegend，127647（Biolegend）（Biolegend，1276110）。排序的SPM对应于CD11b+F4/80intly6c -Ly6g-细胞，并在BD Facsaria IIIU上分离。RNA-seq：从7 lps处理的小鼠（102283 SPM）中的CD11b+F4/80intly6c-ly6g-排序的spms，从8 lps和LCC-12的瑞士小鼠（66967 spm）中心，然后在350μl的TCL（Qiaia and 1％）中重新悬浮，并重新悬浮在350μl（Qia）中，Qiaia，1031515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151515151111111111111，β-羟基乙醇。用Norgen单细胞RNA纯化试剂盒（Norgen，51800）提取总RNA。使用较智能的总RNA-Seq Kit V2-PICO输入哺乳动物（Clontech/Takara，634419）制备RNA测序库。对于每种条件，总RNA的输入量为10 ng。RNA片段化的第一步使用在94°C下的专有碎片混合物施加4分钟。分裂后， 进行了索引cDNA合成。然后使用特定于哺乳动物rRNA的探针进行核序列步骤。进行PCR扩增（12个周期）以扩增cDNA文库。使用量子量荧光测定法（Invitrogen，Q32854）使用DSDNA HS（高灵敏度）测定试剂盒和LabChip GX Touch使用高灵敏度DNA芯片（Perkin Elmer，760517，CLS760672）进行库定量和质量评估。然后使用KAPA库定量试剂盒（Roche，07960336001）对库进行等效汇总并通过定量PCR进行定量。测序是在针对每个样品的1亿个群集的Novaseq 6000（Illumina）上进行的，并使用配对端2×100 bp进行了测序。有关分析，请参见“ RNA-Seq”。修剪读数在小鼠MM10参考基因组上排列。

　　这些实验使用了9周大的雄性BALB/C小鼠。通过异氟烷（Forene）麻醉动物。腹部切口后，将盲肠结扎，用量规针（25克）刺穿，并释放出少量的粪便。对于假小组，在腹部切口后，盲肠被操纵，但既没有连接也没有刺穿。盲肠返回腹部后，将腹腔分为两层闭合，并用皮下施用的30 ml kg -1体重（0.9％NaCl）复苏小鼠。在CLP创建后，LCC-12（0.3 mg kg-1，腹膜注射）在4小时，24 h，48 h，72 h和96 h时给予。CLP创建后，每2小时至上午10点至上午6点，每2小时监测死亡率的发生率。在CLP创建前，在1 mg kg -1 5分钟内腹膜内腹膜内施用地塞米松。如“ ICP-MS”中所述，在SPMS上进行了ICP-MS实验。针对干重的组织特异性数据归一化。SPMS的排序使用以下抗体进行：CD11b-太平洋蓝色（Biolegend，101224），F4/80-PE（Tonbo，TNB50-4801-U100），LY6C – Percp/cy5.5（Biolegegend，128012）和Ly6g – Affcp – percp/cy5.5（Biolegend）和Ly6g – Af647（Biolegend）（Biolegend）（Biolegergend，127610）。排序的SPM对应于CD11b+F4/80intly6c-ly6g-细胞。

　　八周大的雄性K18-Human ACE2表达C57BL/6小鼠（B6.CG-TG（K18-HACE2）2PRLMN/J）购自杰克逊实验室。通过腹膜内注射氯胺酮（100 mg kg-1）和甲基嗪（10 mg kg-1），然后在室内感染50 µL的DMEM，含有5×102 TCID50的HCOV-19_ILP_FRANCE菌株SARS-COV-2（NCBI555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555年），通过腹腔内注射（10 mg kg-kg-1）进行麻醉。在感染后鼻内接种LCC-12（0.5 mg ml-1，50 µL）6 h，24 h和48 h。在感染后第4天，小鼠被杀死。细胞分选：在短暂的麻醉（异氟烷为4％）下，通过鼻内途径为105 pfu SARS-COV-2（菌株Be-Tacov/be-Tacov/france/france/idf0372/2020），在短暂的麻醉（异氟烷为4％）下感染了K18-HACE2小鼠（杰克逊实验室，雄性，每组10只小鼠）。在感染的4天内，每天监测小鼠以进行疾病进展。在感染后第4天，在末期麻醉（氯胺酮100 mg kg-1和甲基嗪10 mg kg-1，腹膜内注射）后，在gentlemacs c Tubes（Miltenyi biotec）中收集并均质于含有RPMI 1640培养基（2.5 mL）（Miltenyi Biotec）（Miltenyi Biotec）（Miltenyi Biotec）（Miltenyi Biotec）（2.5 mi）。Roche）使用Gentlemacs解散剂（Miltenyi Biotec）。在摇动下，在37°C下进一步分离肺组织30分钟，通过70 µM细胞过滤器，然后进行红细胞裂解，然后进行细胞分类。将细胞用可固定的生存力染料efluor 780（Invitrogen，65-0865-14）染色，然后用荧光组合偶联的抗体（4°C时35分钟）染色。所使用的抗体如下：CD11b-太平洋蓝色（Biolegend，101224），CD45-BV510（Biolegend，103138），CD170（Siglec-F）-Peefluor 610（Ebioscience，61-1702-80），61-1702-80），F4/80-BV605（Biolesef）（Biolescience）。AMS对应于CD45+CD11BINTF4/80+SIGLECF+细胞，并在BD FACSARIA融合上分离。如“ ICP-MS”中所述，在AMS中进行了ICP-MS实验。RNA-seq：右叶的一半是从Nucleospin RNA试剂盒中的1 mL RA1缓冲液中匀浆（Macherey Nagel，740955.250） 含有20 mM的Tris（2-羧乙基）磷酸（TCEP）。用Nucleospin RNA试剂盒提取组织匀浆中的总RNA。用60μl水洗脱RNA。有关以下步骤，请参见“ RNA-Seq”。修剪读数在小鼠MM10参考基因组上排列。

　　使用Fiji 2.0.0-RC-69/1.52N，Prism 8.2.0和Adobe Illustrator 26.0.2和Biorender.com创建了插图。Biorender.com用于无花果。1A和5A和扩展数据图10G。

　　结果表示为平均值±S.E.M或平均值±S.D.如所示。在框图中，盒子代表四分位间范围和中位数，晶须表示最小和最大值。盒子图上的特定颜色仅表示给定图面板内的独特供体。每个供体或小鼠代表一个独立的生物样品。PRISM 8.2.0软件用于使用双面Mann-Whitney测试，双面未配对的t检验，Kruskal-Wallis测试，并使用Dunn的两侧t检验，双向ANOVA或MANTEL – MANTEL – COX LOG-RANK测试。Prism 8.2.0软件或R编程语言用于生成定量数据的图形表示，除非另有说明。精确的p值在图中指示。样本量（n）在图中指示。至少n = 3个供体重复所有免疫荧光实验，结果相似。从小鼠分离的巨噬细胞上的蛋白质印迹在合并的样品上进行，并每池进行一次。在n = 128个供体中观察到了NAMDM和AMDM之间观察到的形态变化，n = 1个供体的代表性图像显示在扩展数据中。在N = 1个供体上进行了纳米成像，并在扩展数据中显示了代表性图像图5b。

　　可以根据与Curie Insting Insting协议一起提供内部试剂。询问应提交给R.R.

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。