为了检查有袋动物胚胎发生过程中的全球甲基化，我们从负鼠精子，卵母细胞以及男性和女性植入前胚胎中产生了低输入的亚硫酸盐测序（BS-SEQ）库，每天从胚胎日（E）（e）1.5至E7.5收集每天收集的成人型成人材料，以及三个代表三个元素的型号。我们的胚胎系列包括EGA（E3.5），XCI（E3.5），胚泡形成（E5.5）和谱系差异的时间点，以形成滋养式二重和层状（EPI; E6.5; E6.5和E7.5;补充表1）。对对照BS-Seq概括的已发表的结果3，精子和脑表现出高甲基化和双峰甲基化模式，胚泡表现出全球性低甲基化（精子平均甲基化76％，脑的71％，脑中的71％，囊泡细胞中的16％；扩展数据；扩展数据图1A）。

　　在我们的负鼠实验中，我们每个图书馆获得了4,700万至3.37亿读，映射率在15.7％至71％之间（补充表1）。主成分分析将精子与其他样品分开，沿主分量2沿时间点进一步分离（扩展数据图1B）。在每个时间点的硅池合并之后，我们在1倍覆盖范围内捕获了CPG的49％至91％，在5倍覆盖范围内捕获了CPG位点的4.2％和83％（扩展数据图1C和补充表1）。由于基因组覆盖范围在较低输入的时间点没有达到饱和，因此我们检查了每个样品中捕获的基因组区域的比例，发现它们之间在时间点之间大致相似（扩展数据图1D）。因此，我们将每个时间点的全局甲基化分布解释为总体基因组的代表。

　　对负甲基化数据的检查显示出与Eutherians的相似性和差异（图1B，C和扩展数据图2A）。在负鼠中，像Eutherians 3,4,5,6一样，相对于卵母细胞，精子基因组是高甲基化的。但是，在负鼠中，差异的幅度较小（平均甲基化77％的精子为77％，卵母细胞的平均甲基化）。结果，卵母细胞的甲基化水平与体细胞组织相似（平均甲基化72％，69％和55％的脑，肝脏和脾脏）。此外，在负鼠中受精后，基因组仍然相对高甲基化（平均甲基化62.5％）。E1.5甲基团与卵母细胞的甲基化体更相似，这表明精子中的某些位点被脱甲基化并将其重编程为卵母细胞样状态（图1B，C和扩展数据图1B）。然而，早期胚胎中高水平的甲基化表明，eutherians典型的DNA甲基化的全球损失并未发生在负鼠中。为了支持这一结论，我们对5M甲基胞嘧啶（5MC）及其衍生物5-羟基环霉素（5HMC）进行免疫染色（图1D）。在Eutherians中，受精后父亲基因组的脱甲基化导致父亲的5MC和5HMC水平较低，而5小时的水平高于产妇的1,2,18,19。我们在小鼠中重现了这些发现（扩展数据图2B）。在负鼠中，父亲和产妇含有相等水平的组蛋白H3，但可以通过组蛋白3 lys9三甲基化（H3K9me3）染色来区分，其水平较低，其水平较低（有关详细信息，请参见图1D字幕）。与Eutherians的人相比，负鼠的5MC和5HMC水平相似。因此，负质核心中的DNA甲基化动力学在负鼠和eutherians之间有所不同。

　　接下来，我们在切割和胚泡形成过程中跟踪DNA甲基化水平。当平均甲基化为64％时，高甲基化状态一直持续到包括E4.5（图1B，C）。随后，在胚泡中，甲基化最初在E5.5时降至54％，在E6.5时下降45％，然后上升到E7.5时的49％。配对样品之间CPG位点的差异甲基化测试表明，超过90％的捕获位点没有发生甲基化水平的显着变化（扩展数据图2C）。在所有特定的基因组特征，包括基因，基因间区域和转座子（扩展数据图2D和3A）上观察到甲基化的稳定性。在最后一个情况下，我们在EGA处观察到多个可旋转元件家族的表达（扩展数据图3B）。这可能是因为表达源自单个的亚家族基因座，我们没有捕获足够的BS-Seq覆盖范围来揭示基因座特异性的模式。或者，可以独立于DNA脱甲基化触发表达。正如在Eutherians20中观察到的那样，启动子和CPG岛（CGI）在整个发育时间内基本上是甲基化的（扩展数据图2D）。我们得出的结论是，与Eutherians中的案件相反，在对比，EGA和裂解分裂的情况下是在高甲基化基因组的背景下进行的。