染色体（SMC）复合物的结构维持，例如冷凝蛋白，粘着素和SMC5/6复合物，控制染色体组织，并调节大多数基因组过程，包括基因表达，染色体分离和DNA Repair1。这些多亚基复合物由包含一对SMC ATPases和Kleisin蛋白的特征性环形三聚体结构以及其他调节亚基3。粘蛋白折叠在染色质环中，拓扑相关的域4,5,6,7，而冷凝蛋白以层次嵌套环的形式组织有丝分裂染色体8,9。单分子实验表明，凝蛋白和粘着蛋白通过主动挤出过程10,11,12形成DNA环。但是，循环挤出是所有SMC复合物的保守特征还是对冷凝蛋白和粘着蛋白的特定特征仍然是一个开放的问题。

　　与冷凝蛋白和粘着蛋白不同，第三个真核SMC复合物SMC5/6的功能探索较少。SMC5/6与同源重组13,14，促进染色体隔离15,16和复制叉稳定性和进展17,18有关。在分子水平上，已经提出了不同的作用模式，包括DNA – DNA链接17,19，通过多个复合物之间的直接相互作用以及有效识别和对超螺旋和催化的DNA15,20,21的直接相互作用，通过直接相互作用进行DNA压实。关于其与冷凝蛋白和粘蛋白的结构相似性，可以预测SMC5/6还执行DNA环挤出和/或易位似乎是合理的。但是，SMC5/6还包含可能阻止此类活动的复杂特异性功能，这使得这样的预测更加不确定22,23,24。

　　因此，我们在这里分离了酿酒酵母SMC5/6以检查其DNA回路 - 分解活性。尺寸排斥色谱法证实，分离株包含野生型（WT）八聚体配合物，所有亚基的所有亚基都大约为1：1化学计量学（图1A和扩展数据图1a，b;对于凝胶源数据，请参见补充图1）。该复合物显示DNA刺激的ATPase活性，最大水解速率为1.9分子S – 1（图1B和扩展数据图1C），类似于先前记录的SMC5/6的活性范围和其他SMC复合物10,11,12,20,20,21。正如预期的那样，未检测到SMC5和SMC6突变以防止ATP结合（KE突变体）或阻断ATP水解（EQ突变体）的复合物（图1C）。然后，我们使用单分子测定法对SMC5/6的活性进行了测试，该测定允许直接可视化由SMC复合物介导的环路挤出10,11,25（图1D）。首先，将线性48.5千里酶（KBP）λ-DNA分子的两端束缚在钝化的玻璃表面上，并用Sytox Orange（SXO）染色。然后，通过垂直于DNA轴的缓冲液流动将DNA分子拉伸，并通过总内反射显微镜成像。在恒定缓冲液流动下添加SMC5/6和ATP之后，我们观察到DNA最初被集中在一个位置，然后逐渐扩展到伸长的循环中（图1E，扩展数据图2A和补充视频1）。我们观察到大多数DNA分子上的循环形成（78％，NTOT = 233，对于2 nm SMC5/6，持续时间为1,000 s）。在没有缓冲液流动的情况下，还观察到循环事件，因为随着时间的流逝，松散压实的DNA点的大小随着时间的变化而增加（图1F和补充视频2）。DNA点成熟后缓冲液流动的应用进一步验证了单个循环（扩展数据图2B）。DNA的荧光强度基函数（图1G）和环路内DNA长度的相应估计（ILOOP） 循环外（IUP，IDown）（图1H和扩展数据图3A）显示了循环的逐渐生长（平均环大小约为16 kbp，NTOT = 100；扩展数据图4A），以循环外的DNA为代价，直到达到高原。一旦挤出停止，环路偶尔会沿DNA沿任一方向沿DNA移动（图2C，D），最终释放（71％，NTOT = 202），要么自发地在一个步骤中（图1F，G; 39％，g; 39％，NTOT = 202）或通过逐渐缩小行动（图1I，J; 32％; 32％，NTT = 202）。在没有ATP的情况下，我们观察到在没有ATP（AMP-PNP）的不可用的类似物的情况下，或者当WT复合物被ATP结合（KE）或ATP水解（EQ） - 缺陷型突变体取代时（图1K），我们没有观察到DNA循环。总之，这表明SMC5/6可以通过主动挤出DNA以ATP水解依赖性方式形成环。

　　接下来，我们估计了环路生长曲线的初始斜率（图1H和扩展数据图3B）的循环挤出速度（图1L; nTOT = 102），该速率产生的速率为1.1±0.5 kbp s – 1，这是与人凝聚蛋白报道的值相似的值（0.5-1.0 kbp s – 1 kbp s – 1 – 1-11）11,12和YEAKS 11,12和YEAB。SMC5/6的环挤出是力敏感的（扩展数据图3C – F），再次类似于冷凝蛋白和粘着蛋白。当将DNA拉伸到其轮廓长度的60％以上时，我们观察到最小的环形成（约6％），相应的力为0.5 pn（扩展数据图4B，C）。根据相对DNA延伸的值估计的平均停滞力在该相对DNA延伸的值停止并转换为已知的力 - 扩张关系10的值再次产生0.5±0.1 pn（图1M）。这接近了以前报道的冷凝素（0.5 pn）26和粘着蛋白（低于0.8 pn）的值12。大多数SMC5/6介导的回路 - 分解事件（89％，NTOT = 102分子;图1N）是“双面”，因为在流动成像中，环的两侧DNA长度降低（图1E）（图1E），以及在估计的DNA长度（IUP，IP）中（IUP，IP）（图1H）（图1H）。总而言之，由SMC5/6介导的环挤出的特征与先前观察到的粘蛋白和冷凝蛋白相似，并且与粘蛋白最相似，粘连蛋白也具有双向挤出。

　　然后，我们在NSE4亚基处标记了SNAP标签的SMC5/6复合物（图1D；对于凝胶源数据，请参见单个ALEXA 647荧光团（标记效率68±10％;方法），并在循环挤出过程中与DNA共同成像。这表明该复合物位于挤出环的底部，进一步证实了主动挤出过程（图2A和补充视频3）。为了确定挤出需要多少个SMC5/6复合物，我们监测了实时标记的环形排列复合物的荧光强度（图2B – G）。在大多数情况下（82％，nloop = 168），DNA上的SMC5/6信号首先在单个步骤中增加，这表明SMC5/6 -DNA结合事件，然后循环增长，最后一个或两个连续下降的步骤减少（图2D，G，图2D，G，补充视频4和扩展数据。较小的循环发射事件（18％）与SMC5/6信号无关，表明未标记的复合物循环。从两步和一步漂白事件和背景痕迹获得的强度分布的比较证实了两步漂白过程源自不超过两个荧光团标记的复合物（图2H）。有趣的是，我们观察到与单步相比（36％）的两步漂白事件中的比例较大（43％）（图2i）。由于SMC5/6的标记效率低于100％，因此漂白步骤（一两个）和SMC5/6复合物（单体或二聚体）的数量之间的相关性不是线性的。重要的是，单个漂白步骤可能是由单个标记的SMC5/6或仅具有一个标记复合物的SMC5/6二聚体产生的。因此，我们计算了观察零（未标记），一个和两个漂白步骤的概率，标记效率范围为68±10％，这是“二聚体分数”的函数， 其中0表示所有SMC5/6复合物都是单体，1表示所有二聚体（扩展数据图5G（右）和方法）。有趣的是，我们发现观察到的比率与100％二聚体的分数最紧密相关，这表明循环 - 分解事件是由SMC5/6二聚体执行的。此外，从具有相似标记效率的NSE2亚基标记的循环淘汰复合物获得的光漂白统计数据（图2J）（70±10％）也与二聚体的预期比率非常吻合，表明这些二聚体可能由两个复合物而不是由单个复合物携带的二重性材料形成，而不是单个复合物。在恒定缓冲液流动下使​​用标记为SMC5/6的循环挤出的实时成像（扩展数据图6）表明，这些二聚体在挤出过程中位于环的茎上。然后，我们质疑SMC5/6的二聚体状态对于环挤压还是单个复合物是否可以挤压回路，但是由于随机复合物 - 复合物相互作用的可能性很高，因此经常存在第二个复合物。如果是这样，则预计环环二聚体的比例将随着蛋白质浓度的降低而降低。然而，有趣的是，我们观察到，即使在较低的蛋白质浓度下，两个漂白步骤的分数也不会减少，而是始终比单个漂白步骤的比例始终大（图2K）。此外，拟合在不同的SMC5/6浓度下观察到的循环DNA的比例与Langmuir -Hill方程式显示，相互作用刺激了环的挤出，显示了NH = 1.84的山系数，远高于NH = 1.0（图2L和方法）。综上所述，这些观察结果支持了以下观点：SMC5/6环挤出的功能单元是复合物的二聚体。这与冷凝素形成鲜明对比，冷凝蛋白挤压回路作为单个复合物10， 而已建议将粘着蛋白挤出为单体和二聚体11,12。

　　除循环挤出外，我们还观察到SMC5/6可以以ATP依赖性方式在DNA（图3A和补充视频5）上单向转移（扩展数据图7G）。Kymographs表明，所有非循环SMC5/6易位的80％（Nnonooping = 45）大约是易位的，而较小的分子较小的部分保持稳定在一个位置或沿DNA随机扩散（图3B，C和扩展数据图7a，e，e，f）。基仪中标记的SMC5/6跟踪产生的平均平方位移（MSD）图显示出越来越多的斜率，与平均易位速度（V）1.5±0.2 kbp S – 1的定向运动一致（图3B和扩展数据图7H – J; NTOT = 32）。我们还发现，当SMC5/6到达DNA末端时，易位大部分时间在很长一段时间内稳定结合，从而导致蛋白质在这些位点的积累（扩展数据图7K）。转移SMC5/6的光漂白步骤和荧光强度分布（图3D和扩展数据图7b，c）表明，大约92％的易位单元被单个荧光团标记。通过将该值与单个漂白步骤的计算概率进行比较（扩展数据图7D），我们发现我们的数据与比90％以上的单体的一部分最紧密地匹配。综上所述，这些发现表明单个SMC5/6可以沿DNA转移，而DNA环挤出需要一对复合物。为了进一步支持这一点，当与单个转运复合物相关的第二个SMC5/6复合物时，所有环路 - 分解事件中有4％是开始的（图3E，F，补充视频6和扩展数据图8）。

　　SMC5/6还包括三个亚基（NSE2和NSE5/6子复合），此外还包括其五型核心。为了研究这些亚基在SMC5/6介导的环路挤出中的作用，我们纯化了缺乏NSE5/6的六聚体配合物，而缺乏NSE2和NSE5/6的五聚体（扩展数据图1F，G，J）并确定了他们的ATPase活性（扩展数据图1K）。在随后的六聚体配合物的单分子实验中，我们观察到与WT Octamer相比，循环概率的增加约为15倍（图4A）。与循环概率的这种差异相反，六聚体和八聚体表现出相似的循环挤出速率（分别为1.3±0.6和1.1±0.5 kbp s – 1）和相似的环路（分别为270±190和317±229 s）（图4B，C）。这些发现表明，NSE5/6负调节循环启动，但在开始后不会显着影响挤压动力学。我们的发现进一步支持了这一点，即在循环启动之前添加纯化的NSE5/6向六聚体配合物降低了循环概率（扩展数据图9B），但是循环启动后的添加并未破坏持续的挤出（扩展数据图9C）。在五聚体配合物的情况下，我们没有观察到任何循环事件（NTOT = 300；图4A），即使在蛋白质浓度时，也比用于分析WT OCTAMER的蛋白质浓度十倍，这表明NSE2是循环挤出所必需的。这是SMC5/6介导的环挤出的特征，因为其他SMC复合物不需要在盘绕螺旋臂上绑定的额外蛋白质即可进行环路 - 解压缩活性。

　　为了进一步阐明NSE5/6在循环启动中的调节作用，我们收集了循环排列的光漂白统计数据，标记在NSE4亚基和NSE5标记的OCTamers的六聚体络合物（图4D和扩展数据图1I和9A）。NSE4标记的六聚体的观察到的比率与SMC5/6二聚体的预期比率非常吻合，这表明在没有NSE5/6的情况下，循环挤出也需要二聚化。但是，我们没有观察到任何SMC5/6荧光信号，它们在分析NSE5标记的八聚体（NNSE5 = 80;图4D）时与循环引入事件相关，这表明循环排除SMC5/6二聚体缺乏NSE5/6。此外，通过分析SMC5/6的易位和环形形成概率（图4E）每个DNA载荷（扩展数据图9D），我们发现NSE5/6从18±4％（对于己烷，NTOT = 64）提高了SMC5/6的易位概率，达到87±6％（for octamer，ntot = 64）。也就是说，易位不需要NSE5/6，因为很大一部分SMC5/6六聚体（18±4％）可以沿DNA转移。知道易位事件主要是由单个复合物（图3D）执行的，而循环事件需要二聚化（图2H – L），并且环路脱离SMC5/6二聚体不包含NSE5/6（图4D），我们猜测NSE5/6通过抑制抑制dimerization的NSE5/6抑制loop的起始。

　　为了检验该假设，我们使用了质量光度法，并估计了NSE5/6对SMC5/6二聚化对六聚体和八聚体配合物的影响（图4F）。我们发现，在没有ATP和DNA的情况下，SMC5/6在十倍二聚体（占总计数的25％;图4F，中间）中缺乏NSE5/6的形式，而SMC5/6中含有NSE5/6（2％；图4F；图4F，顶部）。此外，将纯化的NSE5/6添加到1：1的比例中导致二聚化降低（3％；图4F，底部）。在存在NSE5/6（图4F，顶部，底部）中检测到的二聚体显示出对六聚体二聚体（MWEXP = 804 kDa）的预期范围，而不是八聚体二聚体（MWEXP = 1,040 kDa）的二聚体，与我们的观察结果一致，发现了一致的loop-extrud-extrud smc5/6 dimers nse 5/6 dimers nse 5/6 dimers nse5/6 dimers nse5/6 dimers nse 5/6 dimers nse 5/6 dimers nse 5/6 dimers nse 5/6 dimers。综上所述，这些数据支持NSE5/6抑制SMC5/6二聚体的想法。

　　为了进一步了解二聚化机制，我们比较了在不存在和没有ATP的情况下，使用ATP水解缺陷型EQ突变体的二聚体形成（图4G）。这表明，通过添加DNA（超过十倍，占标准化人群的40±5％），六聚体配合物的二聚化显着增强。当Smc5/6与大量过量DNA孵育时，这也是持久的，这支持了这种增强反映二聚体而不是与同一DNA结合的两个独立的单体复合物的想法（扩展数据图10B）。但是，在添加ATP之后，将二聚体的分数降低到类似于DNA未结合状态的水平（2±1％）。对于ATP水解缺乏EQ突变体，ATP的添加不会降低DNA增强二聚体分数（占标准化人群的43±5％）。这与ATP触发的环挤出和随后从DNA解离的一致。综上所述（图4A – G），这些发现表明NSE5/6通过抑制己酰胺的二聚化来负调节循环启动，这通过DNA结合增强了。

　　我们的发现，NSE5/6抑制循环挤出似乎与NSE5/6的想法相抵触，将NSE5/6充当SMC5/6的装载机对染色质27,28，并且是抗DNA29,30的高盐耐药拓扑负载所必需的。为了更好地了解环路挤出与拓扑负载之间的关系，以及NSE5/6在这些过程中的作用，我们在循环排除实验中包括了高盐洗涤步骤。具体而言，我们首先观察到DNA结合，易位（扩展数据图7K）和六聚体或八聚体SMC5/6的循环事件，然后用高盐缓冲液（1 M NaCl）洗涤流池（图4H）。这立即破坏了所有先前挤出的回路（NTOT = 60），重要的是，没有循环排列的复合物保留在DNA上（NTOT = 52）（图4H，K）。这表明循环排列复合物在DNA上没有拓扑加载。然而，有趣的是，即使在孵育1小时后，高盐水洗涤后即使在高盐水洗涤后仍与DNA相关（7％，NTOT = 481;图4i-k和补充视频7）仍然与DNA相关，这表明拓扑夹带可能会发生，但频率很低。根据NSE5/6对高盐的拓扑负载30的要求，分析了缺乏NSE5/6的己糖药后，没有SMC5/6在高盐水洗涤后仍保留了SMC5/6（图4K）。这些发现表明，尽管在没有NSE5/6的情况下SMC5/6可以挤出环，但它不能在没有NSE5/6的情况下形成与DNA高盐的结合，这反过来又表明环挤出与DNA的拓扑夹层独立发生。

　　总之，我们的研究表明，SMC5/6是DNA循环侵入的复合物。SMC5/6介导的环挤出的动力学表现出与粘着蛋白和冷凝蛋白的相似性，但其机制涉及不同的复合特异性特征（图4L）：SMC5/6通过合作对复合物进行挤出，而单个复合物沿DNA沿DNA转换。此外，NSE5/6充当环路挤出的负调节剂。具体而言，NSE5/6通过抑制六聚体二聚化来抑制循环启动时的环挤出，但对持续的环挤出没有影响。此外，NSE5/6允许SMC5/6与DNA相互作用，以高盐的耐药性方式，可能是通过DNA的拓扑诱捕，这是环路挤出所需的结合模式。综上所述，我们的发现表明，SMC5/6使用循环挤出来保护基因组完整性，从而为解剖这种多功能复合物的活性开辟了新的途径。