因为这是一个没有先前数据的动物模型，所以统计方法不能用于预先确定样本量。

　　根据该机构的指南和NIH Privation of Animal和NIH原则，根据机构和基本原则的指南，由经过认证的员工在评估和认证实验室的指南和NIH原则指南中，由经过认证的员工在评估和认证方面，由经过认证的员工在评估和认证方面，由岩石山实验室（国家卫生研究院（NIH））的机构动物护理和使用委员会批准了所有猕猴的实验，并由岩石山实验室（NIH）的机构动物护理和使用委员会批准。美国农业部和美国公共卫生服务部关于人道护理和实验动物使用的政策。恒河猕猴被安置在相邻的单个灵长类笼中，允许社交互动，在气候控制的房间中，带有固定的光/黑暗循环（12-H灯/12-H的深色/12-H深色）。在整个实验中，每天至少对猕猴进行监测。训练有素的人员每天两次提供商业猴子食物，零食和水果。随意可用。环境丰富包括各种人类互动，Manipulanda，商业玩具，视频和音乐。机构生物安全委员会（IBC）在生物安全3级条件下批准了与感染性SARS-COV-2菌株的工作。根据IBC批准的标准操作程序进行样品灭活，以从高容器中去除标本。

　　为了评估恒河猕猴作为SARS-COV-2的模型，通过鼻内（每鼻孔0.5 mL）（0.5 mL）（0.5 mL），气体内（4毫升），口腔（1 mL）和Ocular（1 mL）和Ocular（0.25 mL）的组合，将八个成年恒河猕猴（4名男性和4个女性，4-6岁）接种。无菌DMEM中的每毫升感染剂量（TCID50）（每毫升3×108基因组拷贝）。使用标准化的评分表（补充信息，补充表1），每天观察猕猴两次，以示疾病的临床迹象。同一个人在整个研究中评估了猕猴。该实验的预定端点为4组4个猕猴的3 dpi，其余4个猕猴为21 dpi。在实验开始之前，猕猴被随机分配到一组尸检。在本研究中未使用盲目，因为所有猕猴都接受了相同的治疗方法。临床检查对麻醉猕猴的0、1、3、5、7、10、12、14、17和21 dpi进行。在考试日，收集了临床参数，例如体重，体温和呼吸率，以及腹侧和侧面X线片。胸部X光片由董事会认证的临床兽医解释。在所有临床检查中收集以下样品：鼻，喉，泌尿生殖器和直肠拭子以及血液。用IDEXX Procyte DX分析仪（IDEXX实验室）确定了总白细胞计数，淋巴细胞，中性粒细胞，血小板，网状细胞和红细胞计数以及血红蛋白和血细胞比容值。使用Piccolo Xpress Chemistry Analyzer和Piccolo General Chemistry 13面板盘（Abaxis）分析血清生物化学（白蛋白，AST，ALT，GGT，BUN，BUN和肌酐）。在1、3和5 DPI的临床检查中，使用10 mL无菌盐水进行支气管肺泡灌洗。间隔48小时，支气管肺泡灌洗不会诱导肺损伤，28。安乐死后，进行了死灵。The percentage of gross lung lesions was scored by a board-certified veterinary pathologist and samples of the following tissues were collected: the inguinal lymph node, axillary lymph node, cervical lymph node, salivary gland, conjunctiva, nasal mucosa, oropharynx, tonsil, trachea, all six lung lobes, mediastinal lymph node, right and左支气管，心脏，肝脏，脾脏，胰腺，肾上腺，肾脏，肠系膜淋巴结，胃，胃，胃，十二指肠，空肠，肠，肠，结肠，结肠，尿道，膀胱，生殖小界，睾丸或卵巢（睾丸或卵巢）组织载玻片的组织病理学分析是由对猕猴分配的董事会认证的兽医病理学家进行的。

　　SARS-CoV-2 isolate nCoV-WA1-2020 (MN985325.1)14 (Vero passage 3) was provided by the Centers for Disease Control and Prevention, and propagated once in VeroE6 cells in DMEM (Sigma) supplemented with 2% fetal bovine serum (Gibco), 1 mM -glutamine (Gibco), 50 U/ml penicillin and 50 μg/ml链霉素（Gibco）（病毒分离培养基）。所使用的病毒库存与初始沉积的GenBank序列（MN985325.1）相同，未检测到污染物。VEOE6细胞在补充有10％胎牛血清，1 mM-谷氨酰胺，50 U/mL青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM中。Veroe6细胞由R. baric提供，未在内部进行身份验证。定期进行支原体测试，并且未检测到支原体。

　　根据制造商的说明，使用QIAAMP病毒RNA试剂盒（Qiagen）从拭子和支气管肺泡灌洗中提取RNA。根据制造商的说明，将组织（30 mg）在RLT缓冲液中匀浆，并根据制造商的说明提取RNA。为了检测病毒RNA，根据制造商的指示，使用转子基因探针试剂盒（QIAGEN）中使用5μLRNA在一步实时RT – PCR E测定中。在每次运行中，并行运行计数RNA标准的标准稀释液，以计算样品中的拷贝数。For detection of SARS-CoV-2 mRNA, primers targeting open reading frame 7 (ORF7) were designed as follows: forward primer 5′-TCCCAGGTAACAAACCAACC-3′, reverse primer 5′-GCTCACAAGTAGCGAGTGTTAT-3′, and probe FAM-ZEN-CTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAAC-IBFQ.根据制造商的指示，使用转子基因探针试剂盒（QIAGEN）在一步实时RT-PCR中使用了五μLRNA。在每次运行中，并行运行计数RNA标准的标准稀释液，以计算样品中的拷贝数。

　　组织病理学和免疫组织化学对猕猴组织进行。固定在10％中性缓冲福尔马林并嵌入石蜡中至少7天后，用甲莫莫毒素和曙红染色组织切片。为了检测SARS-COV-2抗原，使用1：250稀释的抗SARS Nucleocapsid蛋白抗体（Novus Biologicals）进行免疫组织化学。该抗体首先在SARS-COV-2感染和未感染的Vero E6细胞颗粒上进行了测试，该抗体用感染细胞的特异性染色，没有未感染的细胞染色。该抗体显示了受感染的实验组织的特异性染色，并且没有恒河猴的未感染组织染色。当用兔IgG对照（非特异性兔IgG取代代替原代抗体）运行时，感染的组织和细胞颗粒标本没有染色。通过董事会认证的兽医病理学家分析了染色的幻灯片。

　　在与卡诺夫斯基的固定剂在4°C下固定7天后，将切除的组织用0.5％四氧化os骨和0.8％的0.1 m cacododylate固定1小时，并用0.1 m的cacododylate中的0.1 m钠固定，然后用0.1 m cacodium cacododylate用1％的1％的cacodody buffer用1％的1％的the酸洗涤，并用1％的1％的cacotodium buffer incatie四氧化盐在0.1 m cacodylate中，在4°C下用1％乙酸乙酸氨基烷酸​​酯过夜。在浸润前100％丙烷丙烷中，标本的乙醇系列脱水，并在嵌入式-812和Araldite树脂中脱水。用Leica EM UC6超级机体（Leica）切成薄片，然后在Tecnai BT Spirit Translans Electron显微镜（Thermo Fisher/ FEI）上观看120 kV。使用Gatan Rio底部安装数码相机系统（GATAN）获取数字图像，并使用Adobe Photoshop V.CC 2019（Adobe Systems）处理。

　　根据标准操作程序，用γ辐射（2 mRAD）灭活了用于细胞因子和趋化因子水平的血清样品。粒细胞群刺激因子，粒细胞 - 巨噬细胞刺激因子的浓度，IFNγ，IL-1β，IL-1β，IL-1RA，IL-2，IL-4，IL-4，IL-5，IL-6，IL-6，IL-8，IL-8，IL-8，IL-10，IL-10，IL-10，IL-12/23（p40）MIP-1β，可溶性CD40-LIGANG（SCD40L），TGFα，TNF，VEGF和IL-18在Bio-Plex 200仪器（Bio-Rad）上使用非人类灵长类动物细胞因子米利普莱克斯米利普莱克斯·米利普莱克斯·米普莱克斯·米普（Breiplex Milliplex Milliplex Milliplex Map）根据制造商的说明进行测量。

　　如先前针对MERS-COV30所做的那样，通过SARS-COV-2尖峰（S）蛋白连接的免疫吸附测定（ELISA）分析血清。简而言之，将Maxisorp（Nunc）板涂在一夜之间，用100 ng/井的蛋白在PBS31（Graham的礼物）中稀释，并用PBS中的阻滞剂酪蛋白阻塞（Life Technologies）。血清连续稀释。使用抗孔基IgG多克隆抗体HRP偶联抗体（KPL），过氧化物酶 - 基底试剂（KPL）和Stop Reagent（KPL）检测SARS-COV-2特异性抗体。在405 nm处测量光密度（OD）。通过将阳性的阈值乘以3的平均值乘以3。

　　为了中和，将血清热灭活（30分钟，56°C），并在2％DMEM中制备双重连续稀释液。然后，添加了100 TCID50的SARS-COV-2。在37°C下孵育60分钟后，将病毒：血清混合物添加到VEROE6细胞中，并在37°C和5％CO2下孵育。在5 DPI时，对细胞病变效应进行了评分。病毒中和滴度表示为血清最高稀释的相互值，该值仍抑制病毒复制。所有血清均以一式两份分析。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。