从addgene（106094）获得编码GFP标记的TIA1的质粒。先前描述了抗GFP纳米病的细菌表达的质粒，称为GBP（用于GFP结合肽）。To generate a plasmid encoding GFP-tagged FUS low-complexity domain (noted FUS-LCGF; corresponding to the FUS reference sequence NM_004960.4), purified RNA from human SH-SY5Y cells was reverse-transcribed using a FUS-specific primer (5′–3′, CGCCGCCGCCACCACTGCC).cDNA was then PCR-amplified using FUS low-complexity-spanning forward and reverse primers with EcoRI and BamHI sites, respectively (forward-EcoRI, 5′–3′, ATCTATGAATTCGCCACCATGGCCTCAAACGATTATACCCAAC; reverse-BamHI, 5′–3′, ATATGGATCCCCTCCACGGTCCTGCT).经过ECORI/BAMHI消化后，将FUS低复杂性片段克隆到PEGFP-N1载体中（BD Biosciences； GenBank：U55762）。FUS-LC-EGFP质粒通过Sanger-severing验证。

　　除非另有说明，否则从Sigma-Aldrich购买了试剂和纯化的蛋白质。Dextran-35KDA来自Leuconostoc Mesenteroides（Sigma-Aldrich，D1662）。Rhodamine-Peg-20kda来自Creative Peg Works。FITC标签的泛素购自Thermo Fisher Scientific。如前所述59表示无标记的GFP表达和纯化。

　　为了产生BSA – A647，将纯化的BSA（在0.1 M碳酸氢钠中为4 mg ml -1，pH 8.3）与十倍摩尔过量的Alexa Fluor 647 NHS酯（Thermo Fisher Scientific，A20006）反应1小时。使用在20 mm HEPES，150 mM KCl，pH 7.6中平衡的Zeba Spin柱（Pierce）去除过量染料。

　　为了产生GBP – A555，将纯化的GBP（0.5 mg ml -1 in 0.1 m碳酸氢钠，pH 8.3，如前所述纯化）60，与超过四倍的摩尔的Alexa Fluor 555 NHS Ester（Thermo Fisher Scientific）反应1小时。通过在PBS中平衡的自制G25柱去除过量染料。蛋白质在液氮中闪烁，并储存在-80°C下。

　　根据制造商的说明，在Vapro 5600（ElitechGroup）系统上进行蒸气压渗透压，并通过改变环境室温来控制温度。允许该仪器平衡到环境温度过夜，并在进行测量之前验证了读取稳定性。评估了渗透压读数的不同组合物的溶液，并通过以下测试正态分布：Anderson -Darling，D'Agostino -Pearson，Shapiro -Wilk，Kolmogorov – Smirnov。除Xenopus和人类细胞提取物外，使用含有20 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM KCl的缓冲液制备所有溶液和稀释系列，它们用纯水稀释，因为它们的整洁渗透势与缓冲液相似。在解冻的冷冻样品（即，不是新鲜）上进行了异武提取物的蒸气压渗透压法（图5D）。人类细胞提取物和稀释液一直保持在冰上，直到每次读数之前。将库存的大分子溶液在37°C下孵育过夜，搅拌在300 rpm下孵育，以确保在进行测量之前完全溶解，并用于制作稀释系列。对于主要数字，通过在每组渗透压测量过程中减去缓冲液的平均渗透势来校正基线的值；鉴于，扩展数据数字显示了绝对渗透势值。蔗糖混合物的渗透潜力的预测值（扩展数据图10F）的误差是通过误差传播计算的（即相关样品的S.E.M.平方之和的平方根）。使用MATLAB 2020B拟合渗透势数据（补充讨论1）。

　　使用Osmomat 3000冻结点 - 抑郁症的操作仪（GONOTEC）进行了新鲜的细胞周期捕集，爪诺尾卵提取物（扩展数据）的渗透压测量（扩展数据）。在对提取物样品进行测量之前，使用超纯水和经过认证的100和300 MOSM kg-1溶液对操作机计进行了三分校准。为了确保两个细胞周期状态之间的差异的准确测量，我们测量了稀释串联的渗透势，以及从曲线的部分中的外推值（渗透势作为稀释性的渗透潜力表现出非线性，如预期的，因为细胞质是由cytosol组成的，它是由理想和非IdiDeal Proteine proteine ofteal protine ofteal protence bssa-extered Data Data Data Data Data data Data data Data fig.1; 1）组成的。在制备稀释期间，将未稀释的提取物保存在水浴中或在冰上保存在冰上，并且我们没有在测量前观察到测量的渗透压对孵育温度的系统影响。为了减少在测量前处于稀释状态下所花费的时间，通常在测量之前，通常在测量前样品之前单独制备稀释时间。通过添加超纯水在所需稀释的情况下制备样品，并在新鲜的实体仪管中提取到最终体积35 µL，然后用P200尖端将移液器混合到视觉均匀。注意在制备过程中避免在溶液中引入小气泡。在测量之间，用干燥的金刚管擦了两次探针计探针，用超纯水冲洗，并用新鲜的金木再次擦拭两次。制备稀释液并按非顺序测量（例如，100％，50％，10％，90％，20％等）避免将任何潜在的时间依赖性叠加到滴定数据中。

　　请注意，为了测量提取物的自由水缓冲能力（图5D和扩展数据图10J，K），重要的是使用蒸气压机度计，而不是冻结抑郁的抑郁症的操作仪，以确保测量过程中的温度变化，从而影响凝结，不会影响结果。

　　将SH-SY5Y细胞（Sigma）保持在Dulbecco修饰的Eagle的培养基（DMEM）中，该培养基（DMEM）在37°C和5％Co2处补充了20％的胎牛血清（FBS），1倍非注重氨基酸（Gibco）和青霉素氨基酸（Gibco）和青霉素 - 链霉素（100 U ML-1）。人类U2OS骨肉瘤细胞（ATCC）或小鼠原发性肺成纤维细胞分别保存在DMEM（Thermo Fisher Scientific）中，这些DMEM（Thermo Fisher Scientific）分别添加了青霉素 - 链霉素（100 U ML -1）和10％Hycllyclone fetalclone II或10％Hyclone III。当培养基不含有谷氨酰胺进行长期培养时，使用谷氨酸（Gibco）。对于瞬态转染，根据制造商的说明，在实验前24小时，用Lipofectamine-2000（SH-SY5Y细胞）或-3000（U2OS细胞）转染细胞。为了进行细胞活力分析，分别在RPMI或DMEM中分别培养淋巴细胞生长Raji细胞61（来自P. Farrell，先前描述的62）或人类包皮成纤维细胞（HFFS，来自ATCC）培养10％FCS，glutamax（Gibco）（Gibco）（Gibco）和conifielin -Strepthepsycin in 37°C and 377°coubtor。测试了所有细胞系，并发现支原体污染阴性。

　　为了产生浓缩的细菌提取物（扩展数据图10J），在25°C下在棒状肉汤培养基中生长了BL21细菌。用20 mM Tris，150 mM KCl，pH 7.4洗涤与大约20毫升的细菌颗粒洗涤一次，然后在7 mL的20 mm Tris，150 mM KCl，150 mM KCl，pH 7.4富含蛋白酶抑制剂（Roche Complete）（Roche Complete），lysozyme（0.8 mg ml -1 -1 final），dnasase，dnasase，4.2 n（4.2）（4.2）（4.2），pH 7.4（4.2）（0.5 mg ml -1最终），苯甲酰胺（最终5.3 mm）和PMSF（最终0.6 mm）。将提取物在冰上孵育10分钟，超声处理，然后以20,000克离心四次，直到获得清晰的溶液。

　　对于人类细胞提取物，在自由泳血清和无蛋白质培养基（Thermo Fisher Scientific）中，在37°C的摇动培养箱中，将Expi293F悬浮液（Thermo Fisher Scientific）生长至2.5×106 mL-1的密度，并在5％CO2的37°C下生长。通过以2,000g离心20分钟收集总共1.25×109个细胞，并吸出了培养基。将细胞沉淀添加到液氮中，并在低温条件下使用杵和砂浆在粉末中均质，并用30 mg（1/2片剂）的完整无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）均匀。将裂解液储存在-80°C下，然后在0°C中解冻。将裂解物在4°C下用30 s循环进行超声检查，然后在4°C下以两轮离心在1,000克时进行10分钟，每次将上清液转移到冰上的新管上，并轻轻地进行三尿。

　　如先前所述的63,64，制备了细胞抑制剂（CSF）的Xenopus laevis卵提取物，除了将细胞chalasin d替换为细胞切拉斯蛋白B。简短地收集，通过偏见收集，去除并压碎。提取细胞质级分后，将1/1,000次蛋白酶抑制剂混合物（亮肽素，pepstatin和chymostatin）以及1/1,000体积的细胞切拉蛋白B添加到提取物中，最终浓度为10 µg ml -1。该CSF逮捕的提取物存储在冰上。为了检查CSF折扣提取物的状态，通过将少量的青蛙精子添加到25 µL提取物（每µL约200个精子）中，制备了测试反应。在18°C下孵育30分钟后，通过使用偏振光显微镜可视化减数分裂II，如前所述65。

　　如先前所述的66，制备了相互障碍的X. laevis卵提取物，并进行了较小的修饰。简而言之，在0.2×MARC的改性铃声（MMR）缓冲液中孵育2-4分钟，将未施用的鸡蛋取消，然后补充了0.5 µg ML-1钙离子载体（A23817，Sigma-Aldrich）。然后通过离心洗涤活化的鸡蛋。至于CSF的提取物，将蛋白酶抑制剂和细胞切拉蛋白B添加到细胞质分数中，每个分数为10 µg ml-1。该循环提取物存储在冰上。为了在相间停滞，将环己酰亚胺添加到最终浓度为200 µg ml -1。在冰上孵育20分钟后，随后将这种相间序列提取物储存在冰上并用于渗透压。当提取物的制备产生的新鲜提取物比当天所能使用的更新鲜的提取物要多得多时，过滤过滤，缓慢冷冻（约1°C min-1）并存储在-80°C下。

　　酿酒酵母在MSS4-NULL背景中稳定地表达WT或MSS4TS中的PLCΔ-2XPH-GFP（下面以下详细基因型中的MSS4T简称为MSS4T），是由C. Godlee和M. Kaksonen生成的。表达2×pH-GFP和MSS4T的原始质粒是S. Emr17实验室的礼物。酵母细胞在缺乏URA的液体培养基中生长过夜，并补充了2％葡萄糖的TRP。随后将细胞稀释至600 nm（OD600）为0.1的光密度，并允许恢复到0.4的OD600。然后允许酵母在成像之前轻轻粘附15分钟，以涂有姜黄蛋白A（PBS，30分钟，30分钟）的玻璃盖板。在缺乏URA和TRP的液体培养基中进行成像，并在下面描述的旋转盘装置中补充了2％葡萄糖。对于低湿性休克，将50μl的酵母培养基用950μL的去离子水稀释，下降速度为405 MOSM L -1至23 MOSM L -1。请注意，由于膜信号的短暂变化，去除低渗性休克后立即获得的框架，这可能是由于整个膜上离子梯度的变化。温度保持在32°C（低湿度休克实验；图1D – E和扩展数据图2d – f）或39°C（热休克实验；扩展数据图2A – C）使用加热阶段（Tokai Hit tokai Hit hit tokai Inub-Zilcs-f1）。

　　表达微管标记α微管蛋白（ATB2）的S. pombe菌株融合到MCHERRY和主轴电杆体（SPB）标记物SID4在Cut7-24背景中与GFP融合的SID4在30°C的背景下保持在酵母菌料中的30°C下，并捕获了每三天的第三天。CUT7-24在限制性温度下诱导单极纺锤体形成18,67。对于活细胞成像，将细胞转移到液体介质中，并在指数级生长期间成像。所有S. pombe Live细胞成像均在八孔μ-slides（Ibidi，IB-80807）中进行，并在下面描述的旋转磁盘仪器中与lectin（Soybean，L1395，Merck）整夜进行预直孵育，配备有暖气仪器，配备有加热室以维持精确的温度（35°C或37°C）。将细胞在显微镜阶段孵育30分钟，以确保在获取图像之前的热平衡。每个通道的七个平面（ΔZ=1μm），曝光时间为488 nm，为561 nm激光器获得200 ms。对于每个延时视频，每5分钟拍摄一次图像，持续180分钟。成像前的晚上，用氧化氘（D2O）处理的细胞在50％2×Yes+50％D2O中生长。直接在显微镜的成像盘中直接进行低湿性条件（5％是+95％H2O），并在中等交换后直接开始成像。

　　详细的基因型如下：WT：MATA，HIS3Δ200，LEU2-3，112，URA3-52，LYS2-801，PRS426-PLCDELTA-2XPH-GFP和MSS4TS：YCPLAC111-MSS4-2TS（CEN LEU2），PRS426-PLCDELTA-2XPH-GFP（图1C – E）；MSS4TS：MATA，HIS3Δ200，LEU2-3、112，URA3-52，LYS2-801，MSS4 ::: HPHNT1，YCPLAC111-MSS4-2TS（CEN LEU2），PRS426-PLCDELTA-PLCDELTA-PLCDELTA-2XPH-GFP（扩展数据扩展数据图2A-C）。WT：MATA，HIS3Δ200，LEU2-3、112，URA3-52，LYS2-801，PRS426-PLCDELTA-2XPH-GFP和MSS4TS：MATA，HIS3Δ200，LEU2-3、112，112，112，ura3-52，ura3-52，ury3-52，lys2-801，MSS4 :: ycpl ycpl（CEN LEU2），PRS426-PLCDELTA-2XPH-GFP（扩展数据图2D – F）；和cut7-24：h+，cut7–24，sid4-gfp：leu2+，mCherry-atb2：hph（扩展数据图2G – I）。

　　所有动物工作均由内政部根据1986年的《动物（科学程序）法》获得许可，并由医学研究委员会和曼彻斯特大学进行当地伦理审查。如先前所述，将原发性肺成纤维细胞分离为68。使用先前描述的方案69从5天大的小鼠中分离出原发软骨细胞。简而言之，5天大的C57BL/6 Per2 :: Luc Mice被斩首安乐死。解剖膝盖，臀部和肩关节，并去除任何软组织。将关节​​软骨用胶原酶D 3 mg ml-1在DMEM中进行前消化，在37°C下两次在37°C下进行间歇性涡旋，以去除软组织剩余。随后，使用手术刀将软骨切成切，并在37°C下消化过夜。细胞通过移液分散并通过70 µm细胞过滤器。然后将细胞悬浮液离心，并将沉淀重悬于DMEM/F12中，用10％FBS重悬于T75烧瓶中。在进行实验之前，仅将细胞传递一次。

　　对于钙成像，将原发软骨细胞铺在四室35毫米玻璃底盘上（Greiner Bio-One）。将总计0.5 µl的1 mM Fluo-4 AM钙染料（Thermo Fisher Scientific）添加到每个室内，其中含有500 µL DMEM/F12培养基中培养的细胞并孵育20分钟。图像采集是通过共聚焦显微镜进行的（见下文）。通过在培养基中添加山梨糖醇，并通过添加蒸馏水来诱导高渗性休克。通过根据以下公式计算出的质量，在细胞培养室中添加冰冷培养基来实现温度变化：

　　其中t是最终温度（°C），c1，...，n是物质的比热（kj kg -1°C）和t1的热量，... n是物质的温度（°C）。

　　使用手持红外温度计确认了正确的温度。

　　为了生存力实验，将拉吉细胞以3×105 mL -1的播种，然后在挑战rpmi中24小时重悬于24小时后。将HFF播种在六孔板中，并将汇合单层置于挑战DMEM中。对于低温治疗，将细胞转移到预先冷的挑战RPMI或DMEM培养基中，通过改变NaCl浓度以达到150至450 MOSM L -1之间的最终渗透压，将其放入预先冷的金属块中，并保持在4°C或在冰上24小时。对于热热处理细胞，将使用0–50％D2O制成的预热挑战rpmi或DMEM转移到预热的金属块中，并在47°C（Raji悬浮液）或45分钟（在50°C）下孵育30分钟，或在50°C（Adherent HFFS）（Adherent HFFS）（Adherent HFFS）（在Adherent HFFS上）转移至0％D2O对照中的培养基和培养物进行培养，并在37°C培养之前进行了24小时的培养。对于低温和高温实验，对照细胞在37°C的金属块中并联孵育。

　　通过流式细胞仪评估Raji悬浮细胞活力。简而言之，将细胞离心，在PBS中两次洗涤，然后根据制造商的说明在流式细胞仪分析之前的说明（Fortessa仪器，然后使用FlowJo V.10.6进行分析，然后根据制造商的说明连续染色，然后用Calcein AM（Ebioscience）和DRAQ7（Biostatus）（Biostatus）染色。每次重复评估10,000个悬浮单元的生存力。对于HFF粘附的细胞活力，类似地对细胞进行染色，并通过使用EVOS FL AUTO2显微镜对细胞进行成像染色细胞，然后使用FIJI70测量活细胞来评估单层活力。

　　全长人WNK1（残基1-2,382）在expi293细胞中表达，并如前所述71。GCN2在SF9细胞中表达，并如先前报道的72纯化。在测定缓冲液（50 mM HEPES，100 mM KOAC，2 mM MGAC2、0.1 mM ATP，0.2 MCI MCI ML-1γ-32P-ATP，1×PHOS-PHOS-Stop，pH 7.5）的测定缓冲液中，用50 ng蛋白和0.5 µM激酶进行激酶测定，pEG-20K-20K-SIGMA（SIG），81300-1公斤）。将反应在32°C下孵育30分钟，然后用样品缓冲液淬火并煮沸。然后由于高浓度的PEG，将样品在电泳前稀释七倍。通过将凝胶暴露于磷光液筛选中，分析了γ-32P的掺入。

　　ADP-肌动蛋白的制剂是根据参考文献进行的。48。简短的纯化肌动蛋白（细胞骨架）根据制造商的指示重悬于。然后将重悬的Ca2+-atp-肌动蛋白重悬于G-Buffer（5 mM Tris-HCl pH 8.0、0.2 mm CaCl2、0.2 mm ATP）中，并与80 µM MGCL2和200 µm EGTA孵育3分钟，以在ICE上持续3分钟，以换成MG2+-ATP-ATP-ATP-Actin。为了确保溶液中所有其余ATP的耗竭，将20 U mL-1的己糖激酶（H6380，Sigma-Aldrich），0.2 mM ADP和1 mM葡萄糖加入溶液中，并在冰上孵育3小时。最后，将溶液在4°C下以100,000g离心1小时以去除肌动蛋白丝，并将含有MG2+-ADP-肌动蛋白的上清液用于其余实验。使用BCA分析（Pierce）测量肌动蛋白浓度。

　　通过制备50 µL Mg2+-ADP-肌动蛋白在F-buffer（50 mm Kcl，1 mm MgCl2，1 mM EGTA，1 mm eGTA，1 mm DTT，10 mM imidazole pH 7.0）或G-G-Buffer（5 mm Tris-Hcl PH 8.0 pH 8.0，0.2 mm cacc，1 mm dtt）中，通过制备50 µm Mg2+-ADP-肌动蛋白诱导肌动蛋白聚合作用。0.2 mM ADP或1 mM ATP取决于所测试的状况，100 mg ml-1 PEG-35KDA或100 mg ml-1 dextran-35KDA。请注意，对于ATP-ACTIN的0.7 µm高于临界浓度（CC），但低于ADP-ACTIN73。允许溶液在室温下聚合1小时，然后在4°C下以100,000g离心1小时。从每种条件中，除去上清液的顶部40 µL，保存并标记为“上清液”。将其余的10 µL丢弃，并用3×50 µL聚合缓冲液小心地洗涤三次。最后，将沉淀重悬于50 µL聚合缓冲液中，并保存40 µL并将其标记为“颗粒”。然后，根据制造商的说明，通过SDS-PAGE（生命技术）对样品进行分析。即时蓝色（Sigma-Aldrich）用于凝胶的总蛋白质染色（扩展数据图10i）。请注意，为了避免由于高PEG-35KDA/DEXTRAN-35KDA浓度而导致的SDS-PAGE中的伪像，所有样品在凝胶中加载之前被稀释了两次。作为对照，我们在f-buffer中对BSA进行了相同的实验，以验证在存在葡萄糖或PEG的情况下与单体肌动蛋白相似的蛋白质不会颗粒（扩展数据图10i（底部车道））。

　　为了估计通过ADP-肌动蛋白组装释放的水（扩展数据图10H），我们将肌动蛋白的表面积用作代理。使用探针半径为2Å的Pyrosetta74测量溶剂可访问的表面积。使用了F-肌动蛋白的现有冷冻EM结构（蛋白质数据库（PDB）：5ONV），在单体和组装状态下测量了可溶剂可访问的表面积（SASA）。对其他可用的肌动蛋白结构（PDB：4A7N，7BT7、8A2Z）重复了此分析，并在两种状态之间进行了平均并进行了比较。

　　为了分析磷酸蛋白酶对FUSLC – GFP的全局调制（扩展数据图8K）的特定影响，用FUSLC – GFP暂时转染SH-SY5Y细胞。然后，转染后24小时，将细胞用成圈蛋白A（3 nm）处理15分钟，或者在5％CO2下37°C的星形孢菌素（10 µm）在37°C下50分钟（每次复制，每种情况一个汇合10厘米盘）。然后用冰冷的PBS洗涤细胞两次，在猎鹰管中刮擦并收集。After centrifugation at 1,800 rpm for 5 min 4 °C, the pelleted cells were lysed for 20 min in lysis buffer (40 mM HEPES, 150 mM KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 1.0% Triton X-100, 0.1% SDS, pH 7.4) supplemented with protease inhibitors (Complete, Roche), phosphatase inhibitors（Phosstop，Roche）和DNase（D4513，Sigma-Aldrich）。然后使用生物发射器超声（Diagodator（Diago）在4°C下进行超声检查3循环30 s On/30 s，并以20,000g清除10分钟，以准备FUSLC -GFP免疫沉淀。然后，将25 µL的GFP陷阱树脂（GTA-20，Chromotek）浆液等分并通过在裂解缓冲液中洗涤3次，并预取平衡。平衡后，将裂解物加载到珠子上，并在4°C下旋转2小时。然后将珠在洗涤缓冲液中洗涤3次（20 mM HEPES，150 mM KOAC，2.5 mm mg（OAC）2，0.5％Triton X-100，pH 7.4，含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂）。然后将珠子重悬于2×Nupage LDS样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific），5 mM DTT中，并在95°C煮沸5分钟。然后根据制造商的协议，对常规，Nupage 4–12％Bis-Tris凝胶（NP0321Box，Invitrogen）或超级PHOS-TAG50μmolL-1，7.5％凝胶（192-18001，Fujifilm）分析样品。对于免疫印迹，将凝胶在米利波尔水和蛋白质转移中短暂洗涤至硝酸纤维素膜上，使用标准的干燥转移IBLOT2系统（IB21001，Thermo Fisher Scientific）进行（P0，7分钟） 协议。将膜在水中短暂洗涤，然后在室温下含有0.1％Tween-20（TBST）的5％（w/w）非脂肪干牛奶（Marvel）TBS封闭。然后将膜与原代抗GFP抗体（AB290，ABCAM，1：10 000稀释）一起在4°C的阻塞缓冲液（5％牛奶，TBST）中稀释，过夜。随后，将膜洗涤3次，持续10分钟（以TBST为单位），然后与抗兔HRP偶联的二抗（A6154-1ML，Sigma-Aldrich，1：10,000稀释）孵育，在块状缓冲液中稀释1 h。通过洗涤3次（以TBST为单位）去除过量的继发抗体。通过使用Chemidoc MP（Bio-Rad）系统将膜与Immobilon试剂（Millipore）和成像进行化学发光检测。

　　大多数成像（在扩展数据图3B，G和4E中除外）是使用自定义TIRF/旋转磁盘共聚焦显微镜进行的，该显微镜包括配备完美的焦点系统和快速piezo阶段（ASI）的尼康Ti支架。所有数据均以×100计划apo lambda na 1.45或×60计划apo lambda na 1.4目标收集。共聚焦成像臂由横川CSU-X1旋转盘头和一个光检查95B后刷的SCMOS摄像头组成，该摄像头以伪全球快门模式运行（与旋转盘式旋转同步）。摄像机箱设置为1，将电子增益设置为1。照明由405 nm，488 nm（150 mW obis lx），561 nm（100 mW obis ls）或630 nm（140 mW obis obis lx）的相干激光器安装在Cairn Laser发射中。单带通滤器（GFP的Chroma 525/50，MCHERRY的Chroma 595/50和A647/JF-646的Chroma ET655LP或四型带通滤波器（Chroma Zet405/488/561/640 m for Hoescht for Hoescht for Hoescht for Hoescht for Hoescht for Hoescht for Hoescht）均安装在快速的Cairn Opspers Whell中。为了实现快速的四维获取，使用FPGA模块（国家仪器SBRIO-9637运行自定义代码）用于基于硬件的显微镜同步。对于Z轴采集，FPGA确保了Piezo Z stage仅在SCMOS摄像机的读数期间移动。整个系统由metamorph软件控制，并使用自定义加热外壳（https://microscopeheaters.com）维持样品温度。对于长期视频（> 2 h），将开放水瓶添加到加热外壳中，以增加湿度并减少蒸发。

　　或者，使用在加湿的5％CO2中配备了37°C阶段的Zeiss Incriter共聚焦显微镜进行钙成像（扩展数据图3B）。使用488 nm激发波长和520 nm带通滤波器进行发射和Fluar 40×Na 1.3（油浸入）镜头进行成像。使用Zeiss软件AIM v.4.2使用Autococus Macro75进行图像捕获。对于粘附的细胞活力测量值，使用了EVOS FL AUTO2显微镜（扩展数据图3G和4E）。

　　为了图像凝结，我们通过在两个玻璃盖板之间夹有0.5毫米厚的PDMS插件来组装自制的密封室。用GraphTec CE6000切割板从PDMS（Silex Silicone）中切出带有5毫米直径孔的插入物。用PLL-PEG（SUSOS，0.5 mg ml-1在20 mM Tris中，pH 7.4，1 H，在室温下）钝化两个玻璃表面，以防止蛋白质吸附到玻璃表面上。将溶液添加到井中，并添加第二盖板，以防止空气水接口的发展。在蛋白质添加的2分钟内获取图像，并在指定浓度下添加蛋白质。PEG溶液以20 mm Tris + 150 mm KCl组成。

　　SH-SY5Y（图3A，C – E和扩展数据图8A，B，I，J）或U2OS​​（图3B和扩展数据图8C，D，G，H）细胞在成像之前，用表达FUSLC-GFP或TIA1-GFP的质粒暂时转染，然后才能进行想象。成像之前，将细胞在玻璃底底成像（荧光佳肴，世界精密仪器）上（PBS中的50μgml-1，1 h）涂抹。在莱博维茨的L15培养基中，将SH-SY5Y细胞在37°C下成像，并补充了20％FBS和20 mM HEPES pH 7.6。将U2OS细胞成像在DMEM高葡萄糖，10％Hyclone II和青霉素 - 链霉素中成像，在37°C下补充了25 mM HEP。在这两种细胞系中，细胞外渗透压都通过添加蒸馏水或蔗糖而改变。通过共聚焦Z-stack成像在渗透挑战之前和之后成像细胞，并计算了最大强度投影。然后，在自动或手动分割的核中测量了颗粒度指数，即GFP信号的缩合度的度量（见下文）。对于每个细胞，在渗透挑战之前将数据标准化为颗粒度指数单元的值。我们一直将细胞与新鲜的，预热的培养基孵育前进行渗透性控制测量，以避免随着时间的推移在培养基中积累和细胞副产物的积累，否则可能会改变细胞外渗透压，从而改变细胞的反应。除非另有说明，否则通过在细胞上添加带有所需的蔗糖浓度的两倍的温暖培养基来进行高渗性冲击。

　　为了响应低纤性挑战的核仁凝结成像（扩展数据图8E，F），根据制造商的指示，用核酸ID（ENZO）染色15分钟，根据制造商的说明，在随着时间的时间挑战后成像（50％的L15 Med Med Med Medim Med Medim Med Medim Med Medim Med Medim Medim Medim Medim Medim Medim Medife Medim Medife Medim Medife Medim Medior form the Image the Warducturer the Warductures offorment of the Sh-Sy5Y细胞）。pH 7.6）。

　　For imaging of FusLC–GFP condensation in response to global changes in protein phosphorylation (Extended Data Fig. 8i,j), SH-SY5Y cells transfected with FusLC–GFP plasmid were spread onto fibronectin-coated glass-bottom imaging dishes as described above and imaged over time in Leibowitz’s L15 medium supplemented with 20% FBS and 20 mM HEPES pH 7.6,添加青春期A（3 nm）或10 µm星形孢菌素后。

　　为了对能量消耗的细胞中的FUSLC – GFP凝结进行成像（扩展数据图8G，H），我们改编了先前建立的能量耗竭方案76。具体而言，将U2OS细胞用FUSLC – GFP转染24小时，并将其镀到纤连蛋白涂层的玻璃底成像（Ibidi 8-Well Dishes）中，在37°C的全生长培养基中2小时。然后将培养基交换为预热的葡萄糖/丙酮酸钠/无DMEM（Thermo Fisher Scientific，A1443001），并添加了5％FBS，1倍谷氨酸（Thermo Fisher Scientific），10 mm 2-Deoxy-deoxy-glutamax（Thermo Fisher Scientic）（Sigma-Aldrich，08591）和10毫米HEPES。在37°C下的该培养基中孵育30分钟，诱导了层状脂蛋白/荷叶边的特征（扩展数据图8G），以及先前报道的77（扩展数据图8G（蓝色箭头））的特征性尖峰突起，证明了能量 - 驱虫处理的功效。As non-energy-depleted controls, cells were incubated in glucose/sodium pyruvate/glutamine-free DMEM (Thermo Fisher Scientific, A1443001) with the addition of 5% FBS, 1× GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 10 mM -glucose, 10 mM HEPES and 1× sodium pyruvate (Thermo Fisher Scientific) for 30 min在37°C。在这些同质条件下获取Z-stacks之后，通过添加584 mM浓缩蔗糖溶液的总体积的十分之一（200 µL为20 µL），并重新重新重新诱发过度渗透性冲击。

　　为了在存在D2O的情况下对FUSLC – GFP凝结的成像（图4G，H），在成像之前，用FUSLC – GFP质粒暂时转染U2OS细胞。在在存在或不存在50％D2O的情况下，在添加蔗糖（+20 MOSM L-1）的情况下改变了细胞细胞渗透压（+20 MOSM L-1），在莱博维茨的L15培养基中获得了共聚焦Z-stacks的Z-stacks，在莱博维茨的L15培养基中获得了20％FBS和20 mM HEPES pH 7.6的共聚焦Z堆栈。然后在细胞核中测量颗粒度指数，对于每个细胞，将数据标准化为渗透攻击之前的颗粒度指数细胞的值。

　　为了响应持续的高渗性休克（扩展数据图11a），FUSLC – GFP凝结的长期降低为成像，在成像之前，用FUSLC-GFP质粒暂时转染U2OS细胞。然后将细胞铺在上述37°C下在5％CO2的DMEM高葡萄糖中，在37°C下在37°C下2小时将细胞镀在纤连蛋白涂层的玻璃底上，并补充了10％Hyclone II和Penicillin-streptomycin。然后将细胞在补充有10％海克隆II，青霉素 - 链霉素和20 mM HEPE的DMEM高葡萄糖中洗涤，并将该培养基的1 mL添加到该菜肴中。通过添加1 mL DMEM高葡萄糖，并补充了10％Hyclone II，青霉素 - 链霉素，20 mM HEPES 150 mM蔗糖，从而诱发了高渗性休克，从而导致+75 MOSM MOSM渗透性休克（通过渗透压验证）。然后使用40毫米盖玻片和真空润滑脂密封该盘子，并开始共聚焦成像。每30分钟，每30分钟获取每30分钟的共聚焦Z堆栈，具有较大的Z间距（20个平面，ΔZ= 0.75 µm），并以最小激光功率最大程度地减少光漂白。在这些长时间尺度上，只有对凝结的定性分析才有可能，因为其他多个变量会影响（可能）影响凝结（细胞迁移，细胞周期状态），并进一步表达转基因，这将改变细胞的全局荧光，这会偏向我们的测量。但是，当观察到恢复时，这会在小时的时间尺度上发生，这与已建立的渗透调节机制和其他IDR蛋白的行为一致。43,50,78,79。

　　为了快速成像FUSLC – GFP响应过度渗透性休克的短期增加（扩展数据图6D，E和补充视频2），将用FUSLC-GFP转染24 h转染的U2OS细胞将24 h置于纤维蛋白胶蛋白涂层的玻璃瓶中成像（IbiDi 8-well Enders）中（ibote ii himed Medimed in Medimed in Medimed（DM）丙酮酸钠，青霉素 - 链霉素）在37°C下持续2小时。将细胞在补充25 mM HEPE的全生长培养基中洗涤一次，并留在250 µL该培养基中。然后开始快速共聚焦采集（单一共聚焦平面，启用完美的焦点，在流媒体模式下运行的相机，在140 ms的帧之间有效时间）和125 µL预热的充分增长培养基，富含25 mm HEPES和200毫米蔗糖，在100帧后添加200毫米蔗糖。这导致+67 MOSM L -1冲击。

　　为了在各种渗透条件下经历快速温度变化的细胞成像（图3C，D），我们使用了已建立的樱桃温度系统微流体系统（Cherry Biotech）。使用该系统，在样品80时从37°C到20°C的温度变化大约需要4 s。简而言之，将细胞分布在用细胞粘附纤连蛋白（Sigma-Aldrich，PBS中的50μgml-1），PDMS间距（0.5 mm厚）和热量CHIP（Cherry Biotech）的盖覆盖膜中的定制腔室。在莱博维茨的L15培养基中，在不同温度下成像，并补充了20％FBS和20 mM HEPES pH 7.6，用蔗糖或蒸馏水调节了渗透压。在每个温度系列中成像相同的细胞，但在不同的细胞外渗透压下成像不同的细胞。

　　为了响应温度和外部渗透压变化，单个细胞内FUSLC – GFP凝结的同时成像（图3E和补充视频1），我们使用了双层微流体设备（Thermaflow Chips，Cherry Biotech）。这结合了使用樱桃温度系统（见上文）的快速温度变化，并使用独立的微流体环（Elvesys）中的快速介质更改。该细胞培养基微流体环由OB1阳性压力调节器（Elvesys），十个输入Mux分配器阀（Elvesys）组成，以选择以添加到细胞中的不同介质，一个气泡陷阱和位于流室入口的流动传感器。将流量保持在114 µl min -1的恒定低值以避免对细胞的剪切应力。将这些微流体片的玻璃底部用纤连蛋白（PBS中的50μgml-1）覆盖，然后允许用FUSLC – GFP转染的SH-Sy5Y细胞在使用SDCM（21 Z-Planes，20 Z-Planes，δZ=0.5μmmmmm）中进行成像，然后在流动室中粘附在流动室中，并粘附在流量室中hepes pH 7.4。然后使用Cherry Niotech顶层独立控制温度，而外部渗透压是通过更改进入腔室的介质来控制底层的输入的50:50（VOL：VOL）在蒸馏水中稀释的（导致325至162.5 MOSM L -1 Hypoomotic Shock）。使用硬件自动对焦（Posect focus，Nikon）保持焦点。

　　使用可根据要求可用的自定义代码使用fiji70和Matlab 2020b（Mathworks）处理图像。出于可视化目的，将J. Manton集合（https://github.com/jdmanton/imagej_luts）中的POPRED查找表应用于大多数单色图像之后，在每个图像的最小值和最大灰色值之间调整了动态范围（请注意，在每个图像之间保持动态范围并不保持在图像之间保持相同的情况下，请参见不同条件的相同情况）。数字是在Adobe Illustrator 2021中组装的。在Adobe Premiere 2021中编辑了视频。

　　在适当的情况下，使用基于连续框架之间的互相关的自定义GPU加速注册代码来纠正视频中的空间漂移。出于表示目的，将小波“ Trous” DeNoising滤波器应用于扩展数据图8C（自定义的GPU加速器MATLAB端口最初由F. Cordeliere开发的代码，以改善Kymo Imagej Plunin81）。通过过滤视频将原始图像平均。这两个代码均可在我们的GitHub页面（https://github.com/deriverylab）以及下面介绍的蛋白质冷凝和核分段的代码。

　　我们在显微镜图像中客观地评估体外测定的凝结程度的管道（图4和扩展数据图9）在扩展数据中显示了图9a，b。

　　简而言之，我们计算了源图像的快速傅立叶变换（所有600×600像素，导致1,024×1,024个傅立叶转换图像），以及在直径增加的圆环中发现的功率谱的部分（傅里叶空间中的3 px递增），然后将其量度为数字（均为图表）。从扩展数据中可以看出，随着源图像中凝结信号的比例增加，在较大直径的环中发现了较大的功率谱（换句话说，高空间频率成分越来越多地出现在图像中）。对于给定条件的各种样本，这是高度一致的（扩展数据图9A（左下））。由于前两个环主要包含图像背景（低空间频率），因此我们在傅立叶空间中设置了6个px的阈值，并将凝结比定义为频谱高频部分中总功率谱的比例（即在傅立叶空间中> 6 px）。这个6个PX阈值有效地将冷凝信号与非传递信号和背景区分开（扩展数据图9b，c）。

　　我们在显微镜图像中进行客观评估活细胞测定的凝结程度的管道显示在扩展数据中。由于必须在特定的利益区域（ROI）而不是完整的图像中测量细胞中的冷凝，因此我们无法使用上述缩影比，因为计算是在可以制作ROI的傅里叶空间中完成的，而不是可以制作ROI的真实空间。

　　简而言之，处理了原始图像以进行均匀背景减法，然后计算FFT，然后使用圆形掩码施加高通滤波器，然后进行反FFT。对于所有图像，该面具保持恒定（所有源数据都裁剪为相同的大小）。接下来，我们将粒度比作为S.D.之间的比率计算。以及高通滤波图像中信号的平均值。由于粒度指数是在实际空间中测量的，因此可以在特定的ROI中进行（例如，核）。在下面的专用部分中描述了使用我们为本报告开发的临时神经网络的自动核分割。

　　重要的是，我们证实了凝结比（在傅立叶空间中测量）和颗粒度指数（在实际空间中测量）都使用GFP凝结的输入图像在体外（扩展数据图6B，C;用于颗粒度指数，整个图像用作ROI）。

　　为了定量酵母热敏突变体（图1D，E和扩展数据图2），使用斐济的自定义脚本进行了半自动分析。Z-stacks通过SDCM在稳定的温度下（ΔZ=0.5μm，ΔT= 1分钟）获取。将强度阈值手动应用于每个细胞，并将阈值区域转换为感兴趣的区域。将这些区域平滑并填充，并将最高的3个PX分割，并用于测量膜结合的GFP强度。其中的区域用于胞质强度。然后为每个细胞计算均匀背景减法后的中间膜结合和胞质信号的比率。

　　对于自动分割，用HOECHST（5分钟，13.6μm）染色了瞬时表达FUSLC-GFP的SH-SY5Y细胞，并使用SDCM成像。然后根据HOECHST信号将最大强度的Z-projections阈值建立阈值。在这132张FUSLC – GFP图像上对网络进行了初步训练后，对预测进行了精制，以将训练数据集的大小提高到598张图像。然后，该数据集用于重新培训网络。通过将图像拆分为四个重叠的瓷砖，对每个瓷砖（90°，180°和270°）进行翻转或旋转，并重复图像并随机重置这些重复图像的对比度，从而在训练数据集上进行了图像增强。

　　所使用的网络体系结构是剩余的卷积U-NET82，在扩展数据中描绘了图7a，b。它包括一个残留的卷积网络83，在网络的向下采样层和向上采样层之间具有串联步骤。网络的每一层都包含两个残留块，每个块都包含两个2d 3×3卷积层，具有批处理归一化和一个relu激活函数。2×2最大池层用于降低网络的维度，然后随后使用转置2D卷积层对图像进行更新。最终的1×1 2D卷积层和Sigmoid激活输出了每个像素为核的概率，并且这些概率被阈值以输出二进制分割。第一个和卷积/残留块和最后一个反向卷/残留块的辍学率设置为0.25，所有其他块的撤离率为0.5，使用了8个图像的批次大小。使用ADAM优化器，学习率为1×10-4。最终的训练大约需要两天的NVIDIA TITAN V GPU。最终网络用于对所有用×100物镜成像的所有细胞冷凝数据的自动分割（扩展数据图7E）。对于图3D，使用×60物镜成像，并扩展数据图8a，使用斐济手动分割了核。

　　通过测量使用Zeiss软件AIM v.4.2在视野中所有细胞上的Fluo-4探针的强度来进行荧光分析。

　　为了定量单极主轴发生（扩展数据图2G – I），使用斐济生成了每个堆栈的最大投影。单极和双极纺锤体的数量在每个视频的60-180分钟内手动评分（每个实验中每种情况下都获得了6-10个视频）。

　　在补充10％海克隆III和青霉素 - 链霉素的DMEM中，将原发性小鼠肺成纤维细胞在10 cm的菜肴中生长至汇合，并在重复的条件下转移了以下条件两周：对照（37°C，37°C，350 Mosm l -1介质），培养基1培养基（350 MADES），培养基1，37550倍率（3750）。（37°C，250 MOSM L -1培养基），低温（32°C，350 MOSM L -1培养基）和高温（40°C，350 MOSM L -1培养基），每3-4天更改培养基。用水或蔗糖调节中渗透压。将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，然后在室温下以1 ml准备好的裂解缓冲液（8 m尿素，20 mM Tris，pH 8）裂解20分钟。裂解后，将盘子刮擦，并立即在液氮中闪烁液体，然后在-80°C下储存。同时将所有样品分解并超声处理2分钟，然后使用BCA分析（Pierce）测量蛋白质浓度。

　　每个样品（500 µg）在56°C下用5 mM DTT还原30分钟，然后在室温下在黑暗中用10 mM碘乙酰酰胺烷基化30分钟。然后使用MS级Lys-C（Promega）以蛋白质：Lys-C比为100：1（w/w）在25°C下消化它们。接下来，使用20 mM HEPE（pH 8.5）将样品稀释至1.5 m尿素，并在30°C下用胰蛋白酶（Promega）以70：1（w/w）的比例消化过夜。通过将甲酸（FA）添加到终浓度为1％，从而消化消化。通过以16,000克离心10分钟来除去任何沉淀物。使用自制的C18阶段尖端将上清液脱盐，其中包含3 M empore提取盘（Sigma-Aldrich）和8 mg Poros R3树脂（Thermo Fisher Scientific）。用30–80％的乙腈（MECN）在0.5％甲酸中洗脱结合的肽，并冻干。

　　将每个样品的冻干肽重悬于100 µL的2.5％MECN和250 mM碳酸氢铵中。然后，添加了每种TMT10PLEX试剂（Thermo Fisher Scientific）的60 µL（1.2 mg），根据制造商的说明在无水MECN中重构。每个时间点的肽在室温下用独特的TMT标签标记60分钟。通过与11 µL 5％羟胺孵育30分钟，将标记反应淬灭。将10个标记的肽（5个条件，重复）组合成单个样品，并部分干燥以在SpeedVac（Savant）中删除MECN。然后将样品酸化并以16,000克离心10分钟。使用SEP-PAK加短TC18墨盒（Waters）将上清液脱盐。用60％乙腈在0.5％乙酸中洗脱结合的肽并冻干。

　　使用TIO2滴虫 - 纹章（GL Science）富含磷酸肽。将冻干的肽在含有2 M乳酸（加载缓冲液）的50％MECN中分辨出来，并与TiO2珠（1：4，肽：TiO2（W/W））一起孵育，这些珠子已预先洗涤，并用加载缓冲液预热。1小时后，将TIO2珠以10,000克离心2分钟，将上清液添加到新鲜的Ti​​O2珠中，以进行第二轮富集，并第三次重复该过程。孵育后，将带有富集磷酸肽的TiO2珠加载到C8阶段尖端（3 m empore）上，并用加载缓冲液洗涤两次，一次用50％MECN，0.1％TFA洗涤。用0.4 m氨溶液顺序洗脱磷酸肽，在0.4 m氨溶液中30％MECN和0.1％TFA中的50％MECN。用甲酸酸化洗脱液，并使用Speedvac（Savant）部分干燥。然后使用C18阶段尖端（3 m empore）对样品进行脱盐并冻干。

　　使用XBRIDGE BEH130 C18、5μM，2.1 mm x 150 mm的柱与Xbridge beh C185μmvan Guard Cartridge cartridge（Waters），使用XBRIDGE BEH13，2.1 mm x 150 mm柱，将TMT标记的肽和磷酸肽进行离线高性能液相色谱（HPLC）分馏，使用Xbridge Beh130 c18，2.1 mm x 150 mm。将肽混合物在溶剂A（5％MECN，95％10 mM碳酸氢铵，pH 8）中分解，并在60分钟内以1-90％的溶剂B（90％MECN，10％MECN，10％10毫米碳酸氢铵，pH 8）分离，以250毫米−150μl -1 mm -1μl -1μl -1分钟。每分分1分钟收集洗脱的肽，合并成18个部分进行蛋白质组学实验，14个用于磷酸蛋白质组学的分数和冻干。对于仅蛋白质组学实验，使用C18级尖端对馏分进行脱盐，并通过真空离心在使用液相色谱法（LC）–MS/MS进行分析之前通过真空离心进行部分干燥。

　　使用完全自动化的Ultimate 3000 RSLC Nano系统（Thermo Fisher Scientific）通过LC -MS/MS分析分级肽，该肽配备了100μm×2 cm Pepmap100 C18 Nano Trap柱和A75μm×25 CM Nanoease M/Z HSS C18 T3列（WATERS）（WATERS）（WATERS）。使用由缓冲液A（2％MECN，0.1％甲酸）和缓冲液B（80％MECN，0.1％甲酸）组成的二元梯度分离样品，并在300 nl min -1下用乙腈梯度洗脱。纳米柱的出口通过纳米喷雾离子源直接连接到Q精确加上质谱仪（Thermo Fisher Scientific）。质谱仪以标准数据依赖性模式运行，在380–1,600的M/z范围内执行MS全扫描，分辨率为70,000。接下来是MS2以35,000的分辨率为15个最强烈的离子，并归一化碰撞能量为33％。使用了1×105的3×106和MS2目标值的MS目标值。将前体离子的隔离窗口设置为0.7 DA，并将测序的肽排除在40 s中。

　　使用集成的仙女座搜索引擎（v.1.6.6.0）使用Maxquant84处理了从LC -MS/MS获得的RAW文件。通过TMT10PLEX实验对记者ION MS2定量MS/MS光谱，并针对Mus Musculus Uniprot FastA数据库进行了搜索（2019年3月）。将半胱氨酸的氨基甲基化设置为固定修饰，而蛋氨酸氧化，N末端乙酰化和磷酸化（STY）（仅适用于磷酸蛋白质组学组）作为可变修饰。将蛋白质定量需求设置为1个独特的和剃刀肽。在“标识”选项卡中，未选择第二肽和匹配。最大值中的其他参数设置为默认值。

　　然后使用Perseus（V1.6.0）处理最大输出文件。将蛋白质组表的记者离子强度上传到珀尔修斯。对数据进行了过滤：从反向数据库中删除了识别，仅通过位点识别，去除了潜在的污染物。然后，将强度小于或等于零的所有列转换为“非数字”（NAN）并导出。还使用Perseus软件（v.1.6.6.0）处理了带有Phospho（STY）站点表的最大输出文件。对数据进行过滤：从反向数据库中进行识别，去除电污染物，我们仅考虑具有定位概率≥0.75的磷酸肽。然后将强度小于或等于零的所有列转换为NAN并导出。

　　使用R Studio V.1.2在R v.3.6.1中进行数据处理。对于蛋白质组学数据，将报告基因的强度标准化以进行输入（均衡总强度）和log2变换。为了确定随温度或外部渗透压显着变化的蛋白质，使用Limma Package85（分别用于温度和渗透压数据）进行了使用经验贝叶斯方法的线性模型拟合，并用被视为连续变量的预测因子进行了。Benjamini – Hochberg调整的P值为0.05，用作显着性阈值。Geneoverlap R Package86用于帮助确定不同蛋白质组之间的重叠意义。使用Gorilla online Tool87进行基因本体学富集，并具有两个未分配的基因列表（重叠与所有检测到的蛋白质）。相分离蛋白的列表是从PhasePDB（v.1）88获取的，使用了注释为相分开和/或属于高通量屏幕的不同MLO的蛋白质列表。

　　对于磷酸蛋白质组学数据，将每种磷酸盐材料的报告剂强度标准化为其各自的蛋白质丰度（从原始蛋白质组学数据中获得）。如上所述进行了Limma分析。对所有检测到的磷酸蛋白进行查询D2P2数据库89，以确定其预测IDR，作为数据库中使用的不同预测指标算法之间的共识。每个磷材料的位置用于确定是否预测其在IDR中。然后，使用比例的z检验来确定与背景相比，随着外部渗透压和/或温度与IDR磷酸化相同或不同的IDR磷酸化水平是否显着变化。通过计算Phosida Database90中存在的25种激酶的图案，对可能磷酸化的激酶进行了可能磷酸化的磷酸肽进行磷酸化的预测。

　　使用GraphPad Prism v.9.4.0（673）进行统计分析。数据表示为平均值±S.E.M.除非另有说明。在本研究中未使用随机方法。在这项研究中没有进行盲目实验。使用Kolmogorov – Smirnov检验验证了变量的正态性。进行参数测试时，始终验证变量的均匀性。除非另有说明，否则对多次比较没有调整（在比较两个以上的样本时，进行了ANOVA测试，并在其各自的图中指示了足够的调整后的事后测试）。除非另有说明，否则n值表示独立的生物学重复。以下统计检验是双面的：图2。1a，f，g，2c，3b，d和4c，e，h和扩展数据图。2i，3d，f，4b，f，h，6c，8a，b，d，h，9g，i和10f，l。除非另有说明，否则p值由星号表示：*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001;NS，p> 0.05。

　　当显示代表性图像/面板时，重复次数的详细信息如下：图1d：n = 30（wt）和n = 16（MSS4TS）（在图1E中进行了量化）；图3a：n = 7（GFP）和n = 12（FUSLC – GFP）（在扩展数据中进行了量化图8a）;图3E：n = 1（在图3D中量化n = 10-42个细胞）；图4a：n = 10个条件；图4b：n =每个条件10（图4C中进行了量化）；图4d：n = 10每个条件（在图4E中进行了量化）;图4G：n = 10（在图4H中进行量化）；扩展数据图2b：n = 30（32°C）和n = 41（39°C）（在扩展数据中进行了量化图2C）;扩展数据图2E：N = 13的每个样品（在扩展数据中进行了量化图2F）;扩展数据图2H：在扩展数据中的定量中指示了各自的样本量图2i；扩展数据图3b：n = 20（对照），n = 20（+100 mosm l -1）和n = 18（-17°C）（扩展数据图3D）;扩展数据图3G：n = 9分析的每个条件分析的视野。实验代表3个生物学重复；扩展数据图4E：n = 9分析的每个条件分析的视野。实验代表2种生物学重复；扩展数据图4G：n =每个条件的15个单元格（在扩展数据中进行了量化图5H）；扩展数据图6b：n = 10（在扩展数据中进行了量化图6c）;扩展数据图6d：n = 1（仅出于说明目的显示）；扩展数据图7E：n = 46个验证集中的图像（最佳模型精度= 0.996；损失，0.065）;扩展数据图8c：n = 9–23（在扩展数据中进行了量化图8d）;扩展数据图8E：n = 8（在扩展数据中进行了量化图8f）;扩展数据图8G：n = 10–11（在扩展数据中进行了量化图8H）;扩展数据图8i：n = 9–12（星形孢菌素）和n = 7-9（Calyculina）（在扩展数据中进行了量化图8J）；扩展数据图8K：n = 2（两个独立的生物重复序列）；扩展数据图9c：n =每个条件的10张图像；扩展数据图9d：n =每个条件的10张图像； 扩展数据图9E：n =每个条件的10张图像（图4C中进行了量化）；扩展数据图9f：n =每个条件的10张图像（在扩展数据中进行了量化），请注意，这与扩展数据相同的量化图6C（左图）；扩展数据图9H：n = 8（GFP）和n = 10（GFP+GBP）（在扩展数据中进行了量化图9i）;扩展数据图10i：n = 2;扩展数据图11a：在2个独立实验中包含n = 17个单元的数据集；图11b：n = 4（WNK1）和n = 2（GCN2）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。