所有传统的小鼠实验都使用了两个月大的C57BL/6J小鼠（Jackson Laboratory和Charles River）。所有Gnotobiotic小鼠实验都使用了欧洲分子生物学实验室（EMBL）的两个月大的C57BL/6J小鼠。将动物保存在具有高压灭菌（Mucedola）的单独通风笼中，具有12小时的光线周期，受控温度（21-24°C）和湿度（30％–70％），并弹性地获得食物（γ-辐射，Ssniff-Sniff-Sniff-spezialldiiätentente）和自动coccaled and Autoclaveed。除非另有说明，否则在所有实验中使用雄性小鼠。所有老鼠实验均由当地机构动物护理和使用委员会（分裂大学，医学院，动物福利委员会和EMBL机构动物护理委员会）和国家监管机构（克罗地亚农业，兽医和食品安全局；525-10/0543-21-8，525-09/566-22-2和21-002_HD_MZ）。将所有小鼠随机分配给实验组。除了病理组织学分析外，没有进行盲目。未进行样本量计算。监测了动物的一般状态，包括行为，外观和体重。如果观察到疼痛，痛苦或体重减轻超过20％的迹象，则应用人道的终点。在任何实验中，这些限制均未超过。对于使用常规小鼠的离体BBN转换实验和16S rRNA测序，从每种性别的五只小鼠中收集了小肠，闭，大肠和直肠三个部分的含量。在20％的甘油中将每个样品的一半在-80°C冷冻，另一半在-80°C下冷冻，并用于16S rRNA扩增子测序。用于液相色谱耦合质谱法 （LC -MS）定量，收集的组织在-80°C下直接冷冻直至进一步加工。

　　在补充表49中列出了本研究中使用的化学品。

　　雄性常规小鼠被随机分配到ABX -BBN或BBN组。ABX – BBN组接受了100 µg ml-1新霉素，100 µg ml-1甲硝唑，50 µg ml-1链霉素，67.7 µg ml-1青霉素（全部来自Sigma-Aldrich）和50 µg ml-1 vancycin（pharma vancycin swancys swancs swanss），饮用水。治疗2个月后，将ABX混合物更改为1,000 µg mL-1链霉素，170μgml-1庆大霉素（KRKA），125μgml-1 ciprofloxin（MCE）和1,000 µg ml-1 µg ml-1杆菌杆菌蛋白酶（Sigma-Aldrich），预防性抗性和抗性33.ABX – BBN组在开始BBN治疗前2周接受ABX，并在其余的实验中保留在ABX上。

　　对于gnotobiotic小鼠的实验，用100-250 µL微生物群落培养或单个细菌分离株培养4天，通过口服烤雄性小鼠接种雄性细菌小鼠。ABX – BBN组将接受第一个ABX混合物2周，然后开始BBN治疗10天。在BBN处理过程中，第二种ABX混合物用于ABX – BBN组。

　　使用菌落形成单元（CFU）计数和16S rRNA扩增子测序（微生物组组成）的组合对ABX处理对肠道菌群的影响进行监测。对于CFU计数，将两组的粪便颗粒稀释（1 g in 10 ml）在PBS中，并通过涡旋均质。在有氧运动和用气体包制备的有氧和厌氧条件下，制备了十进制稀释液（10-1至10-9），并在37°C的血琼脂（TSA，10％血液）上生长，并在37°C下生长。使用两个连续稀释液计算CFU。对于16S rRNA测序，从小鼠中收集粪便颗粒，并使用Powersoil试剂盒（Qiagen）提取DNA。测序是在Illumina平台上产生V4区域的250个基准对（BP）配对序列的。

　　在检查了ABX的作用后，我们将两组小鼠授予硝基胺（0.05％BBN和2.87 mM EHBN，DBN和PBN）在饮用水中。将BBN施用12周，然后将化学物质从饮用水中除去8周。施用PBN 17周，而EHBN和DBN进行了20周6,24周。

　　为了收集组织，通过吸入CO2和肠含量，肝脏，肾脏，膀胱和血浆来安乐死，以-80°C冷冻，直到进一步分析。将膀胱组织切成一半，将一半的一半用于代谢组学定量，另一半被固定以进行组织病理学分析。

　　为了监测尿液和粪便排泄，使用代谢笼（Techniplast）收集了用所有化学物质处理的小鼠的24小时尿液和粪便样品。将小鼠放置在笼子里，供应食物和水（补充有或没有ABX的硝基胺为各组的硝基胺补充）24小时，并从收集管以及笼子表面收集粪便。称重样品并在-80°C下存储直至进一步分析。

　　两性的五十只传统小鼠被随机分配到ABX – BBN或BBN组。在接受BBN之前，将ABX – BBN组与上述浓度相同2周，将ABX（新霉素，甲硝唑，链霉素，青霉素和万古霉素）混合在一起。两组小鼠均通过口服饲料给予单剂量的BBN（每公斤体重50 mg），并在1、3、6和9小时（每组五只小鼠）和肠含量（每组五只小鼠）和肠含量，肝脏，绞死，肾脏，肾脏和等离子体（液体含量）中，在液体nItrorgogen和80中分析cy -8000000000000000。

　　在2020年3月至2020年8月之间，从分裂大学医院的胃肠病学系招募了患者。该研究得到了分裂大学医院伦理委员会的批准（许可证号2181-147-01/06/M.S.-20-20-20-20-20-4）和分裂大学医学院（University of Split School of School of School of Split）（BR。1181-198-198-03-03-04-204-20-20-20-20-20-20--20--20-204-20-20-4-00400）批准。

　　从12例接受胃肠病学分析的患者中收集粪便样品，以针对不同的医疗状况进行。研究中所有患者的排除标准是：在收集样本和分析组织的恶性病理学之前一个月使用ABX。

　　将样品体积的一半与甘油混合（最终浓度20％），并在-80°C下储存，以节省可行的微生物，以进行随后的体外BBN转换测定。剩余的样品体积直接存储在-80°C下进行DNA提取（Powersoil Kit，Qiagen）和16S rRNA测序。

　　对小鼠安乐死后，收集了膀胱，并使用手术刀将内侧切成相等的一半。一半立即在液氮中冷冻并保存以进行后续分析。另一半浸入中性缓冲的福尔马林（10％）24小时。固定后，使用一系列乙醇稀释液（75％，90％，95％和三倍100％）脱水，每个二倍，分别为1小时），用二甲苯（每个三个系列30分钟）清除，最后嵌入石蜡中（浸入两个系列石蜡中1 h中1 h，并在第三系列中掺入中）。然后将嵌入的组织切成5μm切片，并用微型布（RM2125 RTS，Leica）切成5μM，并用甲莫妥蛋白（Sigma）和eosin（Merck）染色以进行微观检查。盲目的组织学评估是由研究人员和训练有素的病理学家进行的。

　　HEP-G2细胞与BBN（0.05％）或BBN（0.05％）加上ABX混合物（含有万古霉素，链霉菌蛋白霉素，甲硝唑，新霉素，新霉素和青霉素和青霉素（在小鼠实验中的浓度相同）（sigma-aldrictor）（在Sigma-Aldrich中）（在小鼠实验中）（在小鼠实验中）（在SIGMA-Aldrich的浓度相同）（sigma-aldrich）中（在sigma-aldrich中）（在sigma-aldrich中）（在小鼠实验中）（在sigma-aldrich的浓度相同）。将细胞颗粒（300 rcf，3分钟），上清液用于BBN和BCPN测量，如先前所述，高性能液相色谱（Perkinelmer Series 200）。HEP-G2（ACC-180）细胞是从DSMZ（德国微生物和细胞培养物收集）中获得的。

　　如上所述，确定了体内微生物群落的CFU。为了隔离单个离体群落，将不同稀释稀释液的细菌培养在脑心脏输注（BHI）血板上，并在厌氧，微氧和有氧氧状况下孵育，并在37°C下孵育24-48 h。然后在可能的情况下从稀释板中随机挑选24至48个单个菌落之间。使用27F（5'-AGAGTTTTGATCATGGCTCA-3'）和1492R（5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）引物配对，并发送了Sanger sequenc sequenc sequencing（Eutemonformy the Euthoreofins; Expelecon;补充餐厅，使用27F（5'-AGAGTTTGATCATGCCA-3'）和1492R（5'-TACGGTTACCTTTACGACTT-3'）使用27F（5'-AGAGTTTTGATCATGCCA-3''）进行PCR扩增。从德国文化中心（DKFZ）或美国型培养物收藏（ATCC）中的类型菌株被划分为BHI血板，并在使用前允许生长1-2天。

　　随着体内微生物群落和单一细菌分离株和菌株的生长，肠道和人类获得的肠道和粪便样品是在0％（厌氧菌，coy室），10％（微型熟食，coy，coy室）和21％（coy comber）和21％（gerobic，gerobic coxy coxy bhhi bhhi）中种植的肠道和单一细菌群落和单一细菌分离株和菌株的生长。肉汤，5 g的酵母提取物，在1 L蒸馏水中补充了 - 半胱氨酸HCl，Haemin和Vitamin K1）或改性GAM（MGAM）肉汤（Hyserve，目录5433），共2小时，以防止微生物社区中的菌株过度生长或过夜，以防止轴文化过度生长。然后将培养物与同样体积的两倍降低的BHI-S培养基混合后，用10μMBBN处理，以允许进一步的指数生长。在0、4、8、12和24小时的BBN孵育后收集了20 µl体积的处理培养物，并立即冷冻在96孔V-Bottom储物板中（Fisher Scientific，Cateer，目录编号10304513），并用铝材料密封在-80°C下进行储存，直到进一步加工。为了确保在微氧和有氧条件下每个孔中的氧气分布，在600 r.p.m.

　　使用Qiagen Powersoil套件从小鼠和人类样品中分离DNA，并在量子位（Thermo Fisher Scientific）上进行量化。如前所述，进行DNA文库的准备和测序26。简而言之，对于第一个PCR反应，用KAPA或Q5或Q5（Biolabs）主循环放大了5-20 ng的DNA，并与16S rRNA基因的可变区V4的引物（fortht：5'-GTGCCCGCCGCGCGGCGGCGGCGGTAA-3';反复：5'-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTATA）一起进行25至30个循环。对于第二个PCR反应，根据凝胶上的PCR产物带宽度为1μL或2μL，将第一个PCR产物的PCR产物与引物（NextFlex 16S V1-V3 Amplicon-Seq Kit，PerkinElmer）和Kapa或Q5（Biolabs）（Biolabs）混合混合在一起，用于25个cycles。合并后，根据制造商的协议，使用Ampure XS套件（Beckman）的Ampure XS套件（Beckman）清洁图书馆。所有样品均在EMBL Heidelberg的基因组核心设施的Illumina Miseq平台上配对250 bp读取长度。

　　使用FASTQC V0.11.5评估原始数据质量，并在QIIME2 V2020.8中进口原始数据以进行下游分析28。检查样品是否对Casadapt29进行了适配器污染，并将其传递给DADA230进行降解，消除和嵌合体过滤；创建了一个描述每个样本中读取的读数的特征表，并为每个ASVs的代表序列创建了一个特征表。使用SEPP31鉴定的代表序列用于创建片段插入树。特征表和内置插入树用于分别用于小鼠和人类的α-和β多样性指标。

　　还将通过Sanger测序获得的分离细菌的整个16S rRNA基因（V1 – V9）的DNA序列进口到Qiime V2020.8，以及它们的相应分类法，源自ACT Service32。在可能的情况下，只有使用BLAST33将完整序列与16S/其参考数据库直接对齐，只有在最低700 bp的一比对长度上才能检测到> 99％的百分比身份时，ACT分类法（如果尚未存在）。使用vSearch34与以下参数对这些全长16S rRNA序列对齐ASV代表序列：-P-MaxAccepts“ all”，-p-perc-nidentity 0.98， - -P-Query-CORY-COV 0.98， - P-P-Top-hits-hits-intly true。未与任何Sanger序列保持一致的代表性序列被分类为基于Sklearn的Pressifier35的分类法，在Greengenes 13_8 99％的操作分类单元全长序列上进行了训练。因此获得的功能表和分类学被导出到普通的TSV文件，将导入R 4.0.0（https://www.r-project.org/）。

　　在小鼠和人类样品中发现的所有ASV分别与MAFFT36对齐，并用于用FastTree237构建系统发育。系统发育树以Newick格式导出，并进口到Itol38中进行可视化和树注释。

　　将细菌分离株在液体培养中生长过夜，并用Powersoil试剂盒（Qiagen）提取DNA。使用具有40μl100ng DNA的MagicPrep NGS系统制备全基因组测序的库。使用Miseq试剂盒V2微型进行高通量测序，导致155 bp长的配对末端读取。使用FastQC V0.11.939和MultiQC 1.1240评估样品质量；使用Trimmomatic 0.3941对质量和长度进行样品读数，并具有以下选项：去除Truseq适配器序列；修剪滑动窗口，将窗口中平均质量（4 bp）的平均质量（4 bp）下降到20以下；最后，如果读取短于38 bp（补充表35），则将其丢弃。随后，使用Spades v3.15.342对读数进行了从头组装，并使用Quast v5.0.243评估了组装质量。

　　使用三种不同的方法来评估物种分配：使用Kraken v2.0.744的基于K-MER的方法；使用GTDBTK v2.1.145的标记基因方法；一种基于16S的方法，使用MTAGS v1.0.446。所有三种方法都同意将所有分离株归类为大肠杆菌或大肠杆菌 - shigella。

　　因此，使用prokka v1.1347将所有组件都带有带有大肠菌作为生物体细节的prokka v1.1347。注释结果传递给繁荣v3.7.048进行pangenomic分析。这7个分离株在总共7,606个基因上共有3,277个核心基因（补充表36）。使用Phandango V1.3.049可视化pangenome的结果，并使用Itol V650可视化与附件基因组存在所建造的树。

　　如先前所述5进行了LC -MS测量的样品制备。简而言之，对于液体组织（即尿液和血浆），在添加100 µL乙腈/甲醇（1：1）和5 µl 8 µm的内标，WARFARIN的WARFARIN之前，将20 µL样品进行冻结周期。将样品在-20°C下孵育30分钟，然后在4,500 r.p.m下以4°C离心。15分钟。在LC -MS测量之前，用10 µL的水稀释10 µL上清液。对于固体组织（即肠道，肾脏，肝脏和膀胱），样品与300-400 µl乙腈/甲醇（1：1）中的300-400 µL含300-400 µL的320 NM内标准均在320 nm内标准agen agen agen agen-ii n egen-ii n geia的乙二醇/甲醇（1：1）中与300-400 µl乙腈/甲醇（1：1）中的样品均质。30分钟在-20°C和15分钟在4°C和10,000 RCF下离心后，在LC -MS测量之前，用1：1或更多的水稀释10 µL上清液。

　　在3.0 mm×10 cm的Poroshell120 HPHC18色谱柱上进行色谱分离，其粒径为1.9 µm粒径（Agilent Technologies），该粒径安装在Agilent 1290 Infinity II LC系统上，并耦合到6550 IFUNNEL QTOF质谱仪。柱温度保持在45°C。流动相由A：甲酸0.1％的水组成；和B：甲醇，甲醇为0.1％甲酸。以0.6 ml min -1的流速从5％流动相B开始注入5μl的每个样品，然后在5.5分钟内将线性梯度从线性梯度开始到95％。在每次样品注入之前，允许该色谱柱重新校准为启动条件1.1分钟。质谱仪在负和正扫描模式（50-1,700 m/z）中以以下源参数进行操作：VCAP，3,500 V；喷嘴电压，2,000 V；气温为275°C；干燥气体，13 l min -1;雾化器，45 psi；鞘温度，275°C；鞘气流，12 l min -1，碎片，365 V.使用第二个电离源和参考质量溶剂的恒定流量源和恒定流量（2 ml min -1）（Purine m/z = 121.0509和hexakis m/z = 922.0098，用于正模式，BETAINE M/z = 112.9856和HEXAKIS MOUNTIS 92.98856和HEXAKIS MOUNT 3.模式）。通过将每种化合物从10 µm到4.9 nm的两倍降低到水中，获得了BBN和BCPN的标准曲线。

　　Masshunter定性分析软件（Agilent Technologies，v10.0）用于确定所有化合物的保留时间以实现目标分析和定量。在Masshunter定量分析软件（Agilent Technologies，v10.0）中进行了峰值积分，并具有以下设置：质量公差= 20 ppm;信噪比= 2的峰值滤波器；保留时间公差为0.5分钟。从MassHunter定量分析软件中导出数据文件后，在RSTUDIO（v4.2.0）中进行了所有统计分析和绘图。使用记录的校准曲线和内标信号计算BBN和BCPN浓度。简而言之，每个样品中的内标华林的面积除以华法林的中位面积在同一组织中的所有样品中，以获得每个样品的校正因子，然后将其用于将每个样品中靶向化合物的区域归一化。使用相应的总样品重量计算每个肠室中的总药物量。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。