与先前的报道31一致，评估多个序列比对中的潜在重组者，包括当前所有可用的全基因组PDCOV序列，都检测到一个重组信号。重组事件涉及属于中国猪的60个菌株，这些菌株属于与新人类分离株无关的序列簇。除去所有重组菌株后，使用其余完整基因组的对齐以及中国序列中鉴定的重组片段的对齐，对重组的成对同质指数（PHI）47测试未显示任何重组信号（p> 0.05）。此外，从全基因组推断出的邻居以及重组片段表明，来自海地个体的人类序列始终与中国（儿童1和儿童3）或美国（儿童2）或美国（儿童2）起源的非重组猪菌株聚集（扩展数据2）。人类PDCOV（HU-PDCOV）菌株0081-4和0329-4分别在儿童1和Child 3相隔4个月，同时上学A（表1），高度相似（99.97％）（99.97％）（99.97％），并且与一年后在Tianjin中发现的猪株密切相关（99.8％）。上学B的Child 2感染了一种变体0256-1，与2015年在美国阿肯色州检测到的猪菌株密切相关。

　　由于重组并不影响新的Hu-PDCOV菌株或最接近的进化亲戚，因此我们从所有全基因组PDCOV序列中推断出最大似然树，可以更详细地研究人类分离株的起源。这棵树清楚地表明，应变0081-4和0329-4，以及0256-1的应变分别属于两个不同的且支持良好的单系进化枝：中国猪的第一个进化枝聚类菌株和美国猪的第二个枝状聚类菌株（来自美国猪的第二个枝状聚类菌株）（扩展数据图3）。重要的是要强调，尽管最大似然树深部的系统发育关系不能被视为对主要PDCOV进化枝之间的进化关系的准确描述，但重组中的两个进化枝中的聚类不受重组事件的影响（扩展数据2）。在海地儿童中鉴定出的三个PDCOV序列是至少两次与可能发生在相似的时间范围内发生的相关非重组猪菌株的单独的人畜共患传播的结果。有两种可能的情况可以解释为什么两个海地儿童感染了遗传上相似的PDCOV菌株。可能有两个独立的人畜共患病，这些动物感染了高度相似的病毒。另外，可能是一个初始的人畜共患病，然后是人类到人类传播。由于没有两所学校周围猪的样本，因此目前不可能辨别哪种情况最有可能。无论如何，系统发育表明在学校A和B学校出现了两个不同的PDCOV谱系，这突出了三角洲病毒成功地溢出在人口中的能力。

　　我们的下一步是对分子钟的校准，以推断Hu-PDCOV的最新祖先（TMRCA）及其最紧密相关的猪菌株的时间。我们通过计算最大似然树中的根到尖端距离和采样时间之间的线性回归来测试序列数据集中存在时间信号。在去除麻雀外序序列和东南亚进化枝异常值之后，从剩余的（n = 94）序列推断的树显示了足够的信号以校准分子时钟（扩展数据图4）。使用严格的分子时钟获得的贝叶斯最大进化枝可信度树的拓扑证实了最大似然系统发育的发现（图2，扩展数据图5）。通过松弛的时钟模型获得了相同的结果。用严格时钟估计的平均进化率每年每年的核苷酸取代为7.3×10-4，高后密度（HPD）间隔95％为5-9×10-4，这略高于以前的估计值，但置信区间重叠间隔32。根据时钟校准，0081-4和0329-4 TMRCA的历史可追溯至2014年10月，HPD间隔95％基本上重叠（2014年10月至2015年1月），其菌株本身的采样日期（请参阅表1）本身。反过来，2014年7月在中国检测到的猪菌株（HPD 95％：2014年4月至2014年8月），海地发现的菌株从其MRCA发出了分歧。相反，在海地发现的分离株0256-1 TMRCA，在美国到2011年的分离株KR150443（95％HPD：2011年2月至2012年3月）。PDCOV菌株可能已经在海地的猪中循环了几年，正如其在最大似然树中相对较长的末端分支所暗示的（扩展的数据图3），在感染了人类患者之前，我们缺少沿着0256-1沿0256-1分支的几个中间链接， 来自猪或其他人菌株。不幸的是，鉴于最近牲畜进口到海地的详细信息以及缺乏监测农场动物病毒感染的监视系统，目前无法详细介绍PDCOV及其在海地引入海地的事件及其后来对人类的介绍。

　　Although the Hu-PDCoV strains belong to independent evolutionary lineages, introduced in humans through what would appear to be at least two separate zoonotic transmissions, a more in-depth analysis of the genomic changes shows that the three strains detected in Haiti share a signature of five conserved amino acid residues in the ORF1a/b polyprotein and two in the spike glycoprotein, unique among other currently known PDCoV sequences from猪（图3A）。唯一的例外是在中国发现的KY065120菌株，该菌株显示出相同的氨基酸特征，并且与学校A中海地发现的菌株最密切相关（表1，扩展数据图3），可能代表预先适应有效传播人类的猪菌株。实际上，沿不同系统发育谱系的相同氨基酸变化的收敛演化高度暗示了适应性反应。前五个ORF1A/B氨基酸中的突变是HU-PDCOV特异性特异性特异性标志（图3A）的突变，位于与已解决的晶体结构相对应的位点。非结构蛋白15（NSP15）中的其他ORF1A/B突变图：A30V（根据参考序列JQ065043编号氨基酸位置）。NSP15蛋白的羧基末端结构域具有尿苷酸特异性活性33。尽管该蛋白不是RNA合成所必需的，但在冠状病毒中有必要避免host34对双链RNA中间体的识别。PDCOV NS15通过防止干扰素调节因子IRF1的核易位（参考文献35）抑制干扰素-β（主要肠道抗病毒细胞因子）的诱导。峰糖蛋白中HU-PDCOV特异性签名图中的最后两个突变。在糖蛋白的氨基末端结构域中的第一个突变P8A在已知的晶体学结构中未能解决， 可能是因为该片段太灵活了，无法通过冷冻电子显微镜看到。第二突变V550a位于S1亚基（在S1和S2之间的受体结合域和裂解位点之间），在短β-折叠形成与相邻环的分子内接触的短β-折叠（图3B）上（图3B）。在Hu-PDCOV中观察到的V550a变化（去除两个甲基）在亚洲发现的其他PDCOV中的频率相对较低，这两种变化都没有显示出在海地检测到的菌株中观察到的其他氨基酸变化。这种变化（尽管很少）消除了特定的范德华接触（位于位置535的脯氨酸和位置532位的骨干羰基），可能会增强S1的蛋白质柔韧性和动态运动。由于已经观察到SARS-COV-2变体的S1和S2之间的分子间尖峰蛋白相互作用B.1.1.7的突变（A570D，D614G和S982A）36,37），V550a可能代表一种通用机制，可以增强动态运动，加速膜融合事件和传播病毒。