双向睡美质粒编码了感兴趣基因的密码子优化cDNA（FLT3，KIT，CD123）或其突变变体的eef1a1启动子的下游克隆。相同的构建体包括一个包括荧光蛋白（分别用于FLT3和试剂盒的MCHERRY或MTAGBFP2）的报道盒，以及由P2A肽下游A RPBSA Chimeric启动子隔开的P2A肽隔开的P2A肽。CD123构建体包括人类CSF2RB（细胞因子受体共同亚基β）cDNA代替记者盒。Genewiz或IDT（IDT Gblocks）合成了用于克隆的DsDNA插入物。根据制造商的说明，使用Lonza 4D-核能系统系统对人类（K562，HEK293T）或小鼠（NIH-3T3或BAF3）进行电穿孔，除非具有500 ng psb100x transposase质粒的制造商说明（Addgene，34879），否则除非呈刺激性。细胞在电穿孔后3天开始接受嘌呤霉素的选择（1-5μgml -1），并在选择开始后7-14天通过流式细胞仪进行分析。

　　我们设计了一个组合质粒库，其中在16个位置中随机选择了人类或小鼠密码子（ASN354，Ser356，Asp358，Gln363，Glu366，Glu366，Gln378，Thr384，arg387，arg387，lys388，lys388，lys395，lys395，lys395，asp398，asp398，asp399，assn399，assn408，assn40，assn40，assn40，,, assn40，,, assn40，，His419）在FLT3 ECD4（Genscript）中。克隆该库以允许总理论复杂性为65,536（覆盖至少10次）。单殖的测序在68.75％的菌落中显示出n = 4个突变的速率，在18.75％的菌落中n = 5突变。在9,166个过滤读取中，在库中转导的K562细胞的NGS测序检测到4,375个独特的氨基酸序列，频率> 0.0001。如上所述，将K562细胞用5–15 ng的库质粒电穿孔，并用1μgml -1紫霉素选择。然后用抗FLT3对照抗体（BV10A4，Biolegend，313314）和FLT3治疗抗体（4G8，BD，563908）染色细胞。使用BD FACS ARIA SORETER对单个阳性（BV10A4+4G8-）和双阳性（BV10A4+4G8+）种群进行排序，并在培养中扩展。GDNA提取后，图书馆区域用带有Illumina Partial适配器的NGS测序的底漆（250 bp配对，Genewiz，Genewiz，Azenta Life Sciences）进行PCR扩增。使用针对密码子优化序列的外显子启动引物来确保集成转基因的扩增。读取对齐和修剪由Genewiz（Azenta）进行，然后将序列翻译成蛋白质序列，并丢弃indels。在编码相同蛋白质变体的读取的读取后，单个阳性和双阳性样品中的最小丰度> 0.001过滤序列，并将每个氨基酸的相对表示在排序的馏分中的每个位置绘制为序列徽标。使用R Studio 2022.07.0（R V.4.1.2）进行分析。

　　我们克隆了一个双向睡美的质粒，编码了密码子优化的人类试剂cDNA，其轴承构造了独特的限制位点，其两侧是每个ECD和一个由MTAGBFP2-P2A-P2A-螺霉素N-乙酰基转移酶组成的记者盒。为了引入随机氨基酸，我们通过PCR放大了350 bp的均衡ssDNA寡聚物（IDT Opools）生成了库插入，每个氨基酸（IDT Opools）都编码为KIT ECD4轴承退化基础（NNN）的Kit ECD4轴承，每个氨基酸位置在每个氨基酸位置上，在同型Armsology Armsology Armsology Armsology Armsbone for Backbone plasmid上侧翼。然后将凝胶纯化的插入物克隆到Hifi Cloning（NEB，E2621L）中，并将其镀到十个15厘米的琼脂菜肴上，以估计图书馆的复杂性。低质粒剂量（50–250 ng）的HEK293T细胞的电穿孔使我们能够选择以（〜5–10％）效率转导的细胞，从而获得每个细胞的大约1个变体积分。使用BD FACS Melody Sorter进行了套件对照抗体（104D2或AB55克隆）阳性细胞的分选，对Therapeutic Fab-79D克隆进行阴性分类，两种抗体的细胞呈阳性。提取了分类级分的gDNA，并使用带有Illumina Partial适配器的NGS测序的引物（Genewiz，Azenta Life Sciences）通过PCR扩增了图书馆区域。通过自动分析（Genewiz）进行读取对齐和修剪，然后将读取序列翻译成蛋白质，并丢弃indels。在编码相同蛋白质变体的读取的读数聚集后，每个样品中每个蛋白质序列的相对丰度以及单阳性与双阳性样品中的富集的富集被计算为log [折叠变化]。通过log [折叠变化]> 0.5过滤序列，并将单个阳性样品中的最小值分数> 0.0015> 0.0015绘制为序列徽标。使用R Studio 2022.07.0（R V.4.1.2）进行分析。

　　使用CRISPR -CAS核酸酶和基因阅读框上游完整的EEF1A1启动子的HDR整合产生了来自内源基因组基因源的过表达FLT3，试剂盒和CD123的记者K562细胞。通过PCR扩增（Promega Gotaq G2，M7845，M7845）编码质粒DNA模板的DSDNA供体模板，该模板是由50 bp同源臂（HA）侧两侧的EEF1A1启动子（HA）制备的。将K562细胞与100 pmol SPCAS9 GRNA（用于FLT3和KIT）或ASCAS12A SGRNA（CD123）与12μg相应的CAS蛋白（IDT; SPCAS9 V2，1081058;或使用ASCAS12A，10001272）以及donor rnnps以及10 donnps conseme rnps coss12a sgrNA（CD123）（CD123）。4D-核对象系统。在电穿孔后3-5天通过流式细胞仪和FACS分类（BD FACS Melody）评估编辑的细胞，以选择表达感兴趣基因的细胞。通过限制FLT3和CD123的稀释来分离具有最高表达的克隆，以进行最高表达，以进行随后的编辑实验，从而进行单细胞克隆。

　　人类FLT3L（Peprotech，300-19），HSCF（Peprotech，300-07）或HIL-3（200-03）以1 mg ML-1恢复，并与AF488或AF647共轭（Invitrogen AF-488或AF-647抗体或AF-647抗体ATBODY WEMERAD，AF-647 ATERMODY WEMERTION 12018181和A2018181818181818181）。将反应用1％1 M Tris-HCl pH 8淬灭。在室温下以AF488偶联的FLT3L，SCF或IL-3的存在在室温下孵育15分钟，用睡美人转座酶转导相应的细胞因子受体转导的细胞系，用PBS+2％FBS洗涤，并通过流量元素进行分析。

　　使用DRC R软件包（v.3.0）分析了从不同浓度的抗体和配体亲和力测定获得的数据。LL.4模型用于拟合亲和力曲线并估计感兴趣的参数，包括最大响应（ED50），拐点处的曲线斜率（山坡）（山坡），下部渐近线（下限）和上渐近线（上限）。使用固定参数（Model0）或抗体依赖性（Model1）的可能性比测试测试亲和力曲线之间的差异。

　　K562（用于FLT3）或NIH-3T3（用于试剂盒）细胞通过睡美人转座酶介导的积分过表达感兴趣的受体，在没有FBS的IMDM中饿死了一夜之间。第二天，以不同浓度（0、0.1、1、10、100 ng ml -1）在37°C下以不同浓度（0、0.1、1、10、100 ng ml -1）收集，洗涤，计数和刺激细胞。然后收集细胞，在冰冷的PBS中洗涤两次，并在细胞提取缓冲液（Thermo Fisher Scientific，FNN0011） +蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF）中裂解30分钟。然后收集含蛋白质的上清液，并使用BCA测定法测量浓度。然后将总共35 µg蛋白质裂解物与Laemmli载荷缓冲液（Bio-Rad，161-0747）混合，并补充了0.1倍2-甲醇的体积，并在95°C下孵育5分钟。将变性的蛋白质样品和预先的蛋白梯（Bio-Rad精度加上万花筒，1610375）被加载到4–12％Tris-Glycine凝胶（Invitrogen Novex Wedgewell，XP04125Box）上，以150分钟的速度运行90分钟，并转移到PDVFFFMBRANES 100 MA MA MA MA BROTTTING ATTINE pDVFFFFMBRANES上。然后用TBST+5％BSA挡住洗涤后的膜，用TBST洗涤3次，并在75 kDa标记处切割，以分离FLT3和KIT和KIT（110-140 kDa）和肌动蛋白（42 kDa）和（42 kDa），并在1：1,000浓度（PKIT Tyr568/570，48333）中与主要抗体一起孵育。Y589-591，单元信号，3464s）在室温下持续1小时。然后将膜洗涤3次，并与适当的二抗（抗兔IgG，HRP链接抗体，Thermo Fisher Scientific，31460）孵育，并用Thermo Scientific Socypersignific Socypersignal West Femto洗涤并开发。使用ImageQuant LAS 4000系统对膜进行成像。为了用抗FLT3或抗体的抗体重复相同的样品，将膜与Thermo Scientific Restore剥离缓冲液（Thermo Fisher Scientific，21059）一起孵育30分钟，被阻塞，阻塞， 用原代抗体（抗FLT3，Origene，TA808157;抗KIT，Invitrogenc MA5-15894）洗涤并孵育。然后将膜洗涤并用二抗（抗小鼠IgG，HRP链接抗体，Thermo Fisher Scientific，62-6520；或抗RAT IgG，HRP链接抗体，Thermo Fisher Scientific，31470），并在上面介绍。

　　在补充10％FBS，1％青霉素 - 链霉素（10,000 U ML -1），2％ - 谷氨酰胺（200 mM）的IMDM中培养人类K562细胞。为了进行基础编辑实验，收集K562细胞并将其重悬于电动溶液中51中，补充了500 ng的基础编辑器质粒和150-360 pmol的SGRNA（IDT），以20μl为单位。使用LonZA 4D-核生态系统对细胞进行电穿孔，并在通过流式细胞仪或GDNA收集评估之前培养72小时。

　　使用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen，69506）或Quickextract溶液（Lucigen，QE0905T）提取基因组DNA。使用GOTAQ G2聚合酶（Promega，M7848）进行围绕目标残基的450-600 BP区域的PCR扩增，并使用SV-Wizard PCR清理套件（Promega，A9282）或Sparq Pueremag磁珠（Magbio，95196）进行纯化。Sanger测序由Genewiz（Azenta Life Sciences）进行，并使用Editr v.1.08 R Package估算了基础编辑结果52。

　　通过从健康的献血者样品（用CD34+ HSPC匹配的非HLA匹配）中分离出外周血单核细胞。在IMDM中培养了总PBMC或纯化的T细胞（Pan T细胞分离试剂盒，Miltenyi，130-096-535），并补充了10％FBS，1％Penicillin-Streptypycin（10,000 U ML-1），2％-Glutamine（200 mm），200 mM-grutamine（200 mm），5 ng ml-lotech and pep ml-ilotech（200 mm）（Pep ml-ilotech）（Pep ML-7（Pep MLOTECH）（PEP ML-7）5 ng ml-1 IL-15（Peprotech，200-15）在CD3-CD28 Dynabeads（Gibco，11141d）的存在下为3：1珠子：细胞比率。On day 2–3 of culture, cells were counted and transduced with a third-generation bidirectional lentiviral vector encoding the CAR and an optimized version36 of the truncated EGFR53 marker at a multiplicity of infection (MOI) of 5 to 10. Dynabeads were removed at day 7 and the culture was continued for a total of 14 days before either vital freezing or in vitro/in vivo experiments.通过流式细胞仪评估了CAR T细胞表型和转导效率。

　　将靶细胞（K562细胞，AML PDX或CD34+ HSPCs）铺在平底96孔板中，在补充10％FBS的IMDM中，每孔10,000个细胞。在37°C下，新鲜培养的或解冻的汽车T或未转移的T细胞用黄色或紫色试剂（Invitrogen，C34567和C34557）标记15分钟，然后用完整的培养基洗涤。然后以多种效应子的形式将T细胞添加到目标细胞中：目标比（10、5、2.5、1.25、0.625、0），总体积为200μl，一式三份或四倍体。将板在37°C的加湿培养箱中与5％CO2孵育6小时（早期时间点）或48 h（较晚的时间点）。为了进行分析，将细胞转移到补充了10-15μl计数面板（Biolegend，424902）的V底板上，离心并重悬于含有人FC阻断试剂的染色混合物中（Miltenyi，Miltenyi，130-059-901），除非否则否则否则CD3（或CD4/cd8 cockt）和CD8 COCKTAIL和CD8 COCD117。在K562细胞实验中，FLT3 BV10A4和/或CD123 9F5或KIT 104D2抗体包括在染色混合物中，以评估共培养结束时残留的靶标表达。在CD34+ HSPC实验中，对CD34，CD90和CD45RA的细胞染色。在室温下孵育15分钟后，将细胞洗涤并重悬于膜联蛋白V结合缓冲液中（Biolegend，422201），其中含有膜联蛋白V FITC或Pacificblue（Biolegend，640945或640945或640918）和7-aad。使用BD Fortessa高通量系统（HTS）分析板，并使用BD FACS Diva（V.6）获得。使用CountBeads计算活的（膜联蛋白V-7-AAD- AAD-）目标细胞的绝对计数，并将其标准化为E：T = 0（无T细胞）条件（靶细胞的绝对计数除以E：T = 0重复的目标细胞中位数）。靶基因的MFI（FLT3，CD123，套件）以相同的方式进行标准化，以说明转基因表达的轻微差异。

　　基础编辑器mRNA通过T7径流在体外转录中制备，使用编码T7启动子的自定义质粒模板，最小5'-UTR，基本编辑器阅读框架，2×HBB 3'-UTR和110-120 bp poly（a）序列。通过BBSI-HF限制消化（NEB，R3539）线性化质粒模板，并通过苯酚 - 氯仿提取（Sigma-Aldrich，P2069）纯化。使用NEB Hiscribe T7试剂盒（E2040S）进行mRNA IVT，并与Arca（3'-O-ME-M7G（5'）PPP（5'）PPP（5'）G RNA Cap Abalogue，Neb，neb，s1411l）或Cleancap Ag（Trilink，N-7113）共转录。如指示，用N1-甲基伪-UTP（Trilink，N-11103）或5-甲氧基-UTP（Trilink，N-1093）进行了部分（75-85％）或总UTP取代。在IVT反应（37°C下30分钟）后，加入QuickCIP（NEB，M0525L）或DNase处理（NEB，M0303L）的去磷酸化。使用NEB Monarch RNA清洁套件（T2050L）或SPARQ PureeMag磁珠（Magbio，95196）纯化IVT mRNA，并将其重悬于无RNase的无RNase水中。使用Nanodrop-8000分光光度计对mRNA进行定量，并使用使用RNA Kit-15NT（Agilent，DNF-471）的安捷伦片段分析仪进行质量控制。

　　如前所述55，对动员的外周血衍生的人CD34+ HSPC进行了培养和电穿孔。简而言之，将冷冻保存的细胞解冻并在STEMSPAN SFEMII培养基（Stemcell，09655）中培养，并补充了1％青霉素 - 链霉素（10,000 U ML -1），1％-Glutamine（200 mM）（200 mm），125 ng ml -1 HSCF（125 ng ml -1 hscf（peprotech，300 -flt hscf），300 -fltht 300 -fltht，300 -105 HSLGT，（Peprotech，300-19），62.5 ng Ml-1 HTPO（Peprotech，300-18），0.75μmStemEgenin-1（Sr1，Stemcell，72344）和35 nm UM171（Sellekchem，S7608）。然后，解冻后48小时（除非另有说明），通过将细胞重新悬浮在P3溶液中（Lonza，V4XP-3024）中，收集并使用LonZA 4D-核型系统进行电穿孔，并补充了100-250 nm基础编辑器MRNA，15-20 –20μmSgrna（IDT）和1.2 U-1 rnase（PRNASE）（prnase in prnase in y insga insga in cro）。N2611）或1.5–3％（v/v）甘油。电穿孔后，将细胞在24小时后进行体内实验进行计数并移植，或在上面描述的同一培养基中以0.5 m ml -1的体外培养为5-7天，以用于体外实验。

　　Human patient-derived AML xenografts (PDX) were thawed and cultured in StemSpan SFEMII medium (StemCell, 09655) supplemented with 1% penicillin–streptomycin (10,000 U ml−1), 1% -glutamine (200 mM), 50 ng ml−1 hSCF (Peprotech, 300-07), 50 ng ml−1HFLT3L（Peprotech，300-19），25 ng ml-1 HTPO（Peprotech，300-18），10 ng ml-1 il-3，10 ng ml-1 g-csf，0.75μmStemregenin-1（sr1，sr1，sr1，stemcell，stemcell，72344），35 nm um171（sre and sregenin-ym171）10μMPGE2。用第三代LV载体转导细胞在HPGK启动子（Titre，〜2×1010 tu ml-1）下以100的MOI为单位，并在37°C下在37°C下在5％CO2以下的加湿孵化器中培养过夜。第二天收集细胞，并通过尾静脉注射将细胞移植到4-8周龄的NBSGW雌性小鼠中。通过外周血收集和FACS分析来监测植入。当PDX AML细胞超过总白细胞20％时，将小鼠安乐死。收集BM和脾脏，并进行性冷冻或FACS分类（BD FACS Melody Sorter），以分离Mneongreen+细胞，并将其转载到新的NBSGW受体中，以获得完全传输的PDX。

　　所有动物实验均根据美国实验室动物科学与机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案（DFCI，21-002）制定的法规进行。在标准的12 h – 12 h day -night光周期中，将小鼠饲养在无菌的单独通风笼中，并喂养高压灭菌的食物和水。女性点头cg-kitw-41jtyr+ prkdcscidil2rgtm1wjl/thomj小鼠（年龄为4-8周；称为NBSGW，Jackson，026622）被用100万人CD34+ HSPCs通过尾部静脉注射为100万人CD34+ HSPC。通过7-9周的外周血FACS分析来监测人类植入。在AML共晶实验中，随后，小鼠接受了0.75 m的人类患者衍生的AML异种移植细胞（PDX），该细胞先前用肉胶注射以前用mneongreen转导的小鼠。然后，在AML移植后10天，除非另有说明，否则小鼠通过尾静脉注射接受了2.5 m的CAR T细胞。通过外周血分析对小鼠进行监测，并在驾驶细胞施用后2周，然后安乐死。在安乐死，收集了骨髓，脾和外周血，进行FACS和基因组分析。

　　除非另有说明，否则CFU测定是通过将​​1,000个CD34+细胞用于体外CD34+ HSPC实验的1,000个CD34+细胞，或除非另有说明，否则每孔的总骨髓细胞为25,000个总骨髓细胞，除非另有说明。将细胞重悬于甲氧化H4034培养基（Stemcell，04034）中，并将其镀入无智能弯曲式六孔板。使用14天的骨髓设置使用Stemcell Stemvision System和StemVision软件对井进行成像和分析。为了进行流式细胞仪分析，用预热的PBS软化甲基纤维素培养基，在分析之前收集并洗涤两次。BM衍生的CFU中白血病细胞的百分比是通过绿红荧光确定的。

　　如前所述，CD34+ HSPC被解冻并编辑。At day 7 after electroporation, cells were placed into differentiation media as follows: myeloid culture (SFEMII, penicillin–streptomycin 1%, Q 1%, FLT3L 100 ng ml−1, SCF 100 ng ml−1, TPO 50 ng ml−1, GM-CSF 100 ng ml−1, IL-6 50 ng ml−1 and IL-3 10 ng ml−1),巨噬细胞（RPMI，FBS 10％，M-CSF 100 ng ml-1和GM-CSF 50 ng ml-1）在非组织处理的平板上，DC（rpmi，fbs，10％，GM-CSF 10％，GM-CSF 50 ng ML-1和IL-4 20 ng ml-1）和IL-4 20 ng ml-1），megakaryocycy – sfeminecyticy – sfemii – sfemii – sfemii – sfemii – sfemii – sfemii，Q 1%, SCF 25 ng ml−1, TPO 100 ng ml−1, IL-6 10 ng ml−1, IL-11 5 ng ml−1), granulocyte (SFEMII, penicillin–streptomycin 1%, Q 1%, GM-CSF 100 ng ml−1, then transitioned to RPMI + FBS 20% + G-CSF7天后50 ng ml -1）。通过流式细胞仪评估分化细胞的免疫表型。

　　收集细胞系，在PBS+2％FBS中洗涤，重悬于100μL中，与人或小鼠FC阻断试剂（Miltenyi 130-059-901和130-092-575）一起孵育，然后用指示的抗体在4°C和洗涤的4°C和洗涤时染色20-30分钟。生存力通过livedead黄色（Invitrogen，L34959）7-AAD（Biolegend，420404）或碘化丙啶（PI，Biolegend，421301）染色评估。Immunophenotyping of in vitro base-edited CD34+ HSPCs was evaluated by staining for 30 min at 4 °C with CD34 BV421, CD45RA APC-Cy7, CD90 APC, CD133 PE and, in some experiments, CD49f PE-Cy7 antibodies after incubation with Fc-blocking reagent (Miltenyi, 130-059-901).通过7-AAD或PI染色评估生存能力。

　　为了评估活性氧的产生，收集了来自髓样分化培养的细胞并与PMA（5ngμl -1）在37°C下孵育15分钟，然后在37°C的最终浓度下添加Cellrox绿色试剂（Invitrogen，C10444），并将样品保持在337分钟的30分钟（Ref。17°C）。然后用HFC块和HLA-DR PacificBlue，CD11b APC-Fire750，CD14 BV510，CD33 PE-CY7和CD15 AF700抗体染色，并洗涤和分析。PI被包括在内。为了测试吞噬作用，将体外分化的巨噬细胞与Phrodo绿色大肠杆菌生物颗粒（Thermo Fisher Scientific，p343666）在37°C下孵育60分钟，通过流式细胞术17°洗涤和分析。为了评估体外分化的髓样培养的信号转导，收集细胞，在SFEMII（不补充细胞因子）中恒定细胞因子，然后用GM-CSF 50 ng-ML-1，IL-4 50 ng-4 50 ng ml-1，IL-6 100 ng ml-1，IL-6 100 ng ml-iifnαa/ifnαa/d 5,000 ng 5,000 ng 5,000 ng 5,000 ng ml-1，离子霉素1μgml -1或LPS 100 ng ml -1在37°C下30分钟。然后用生物防治固定缓冲液（420801）固定细胞，并根据制造商的说明，用True-Phos Perm缓冲液（425401）通透。然后将细胞等分为两个分数，用以下抗体面板染色，并使用流式细胞仪进行分析：（1）PSTAT1 PE-CY7，PSTAT3 BV421，PSTAT5 PE和PSTAT5 PE和PSTAT6 AF647；（2）PERK1/2 BV421，PCREB ​​AF647，P38/MAPK PE和PRPS6 PE-CY7。In vitro differentiated dendritic cells were stained with hFC block, CD1c APC, CD33 PE-Cy7, CD303 APC-Cy7, CD141 KiraviaBlue520 and FLT3 PE antibodies and 7-AAD for viability.为了评估共刺激分子的上调，将树突状细胞与100 ng ml-1 lps孵育30分钟，在37°C下孵育30分钟，并用HFC块，CD1C APC，CD1C APC，CD303 APC-CY7，CD11C BUV666，FLT3 PC7，FLT3 PC7，HLA-DRACIFIC BLUE，CD80 BV80 BV6605和CD80 BV6605和CD80 BV605和CD80 BV605和CD80 BV605和CD8605和 加上PI可生存。为了评估巨噬细胞分化向M1样（CD80+CD86+HLA-DR+）或M2样（CD86-CD2200R+CD206+HLA-DR-）表型的体外分化巨噬细胞在96孔板上铺在96孔板上，并用LPS 100 ng-ml-4 20 ng刺激了巨噬细胞。然后将巨噬细胞拆下并用HFC块，CD11b APC-F750，CD33 BB515，CD200R PE-CY7，CD206 PE，CD209 AF647，HLA-DRADDRASDRA，CD80 BV605和CD86 AF700抗体，以及通过Flow556。如先前所述56，进行了分化粒细胞中嗜中性粒细胞外陷阱（Netosis）诱导。简而言之，将细胞播种在96孔板中，用PMA 50 ng ml-1在37°C刺激4小时，然后用HFC块和CD15 FITC，CD66B PE-CY7和CD33 APC抗体在室温下染色。然后将粒细胞洗涤并用PFA固定，并补充DAPI和PI染色溶液以染色外旋转核酸，并通过流式细胞仪进行分析。通过使用HFC块和CD41 PE，CD42B AF647，CD61 FITC，CD34 BV421和CD45 BV786抗体在4°C下染色30分钟，分析了体外分化的巨核细胞。对于巨核细胞倍性，用HFC块和CD42B AF647和CD61 FITC抗体对细胞进行染色，然后洗涤并重悬于500μlFxcycyPi/RNase染色溶液中（分子探针，F10797），并通过流量细胞仪进行分析。

　　使用ACK试剂（Stemcell，07850）在室温下从体内实验收集的周围血液两次裂解10分钟，用人和小鼠FC封型试剂（Miltenyi，130-059-901和130-092-575），并在室温下固定在室温下155 BD45 BD45545545545545545.5545.45545545.545545.4545.45 pe。除非另有说明，否则A​​F647，CD19 BV605和CD33 PE-CY7抗体。7-AAD被包括为可行性污渍。为了全面鉴定BM样品中的造血种群58，使用ACK试剂裂解收集的细胞，洗涤两次，并补充了CountBeads以进行绝对定量。The samples were then incubated with human and mouse Fc-blocking reagent and stained for 30 min on ice with hCD45 BV786, mCD45 PerCP-Cy5.5, CD3 PE-Cy5, CD7 AF700, CD10 BUV737, CD11c BUV661, CD14 BV510, CD19 BV605, CD33 PE-Cy7, CD38 BUV396,CD45RA APC-CY7，CD56 BUV496，CD90 APC，FLT3 PE或BV711，以及KIT BV711或CD123 PE抗体（取决于实验设计）（补充表2）（补充表2），每样品添加50μl每个样品亮STAIN BLIGHT BUFFER（BD，659611）。通过用HCD45 BV786，MCD45 PERCP-CY5.5，EGFR AF488，CD3 BUV396，CD4 APC，CD4 APC，CD8 Pacificblue，Pacificblue，CD62L BV605，CD669 pe69 pe69 pe69 pe69 pe69 pey775557，，将以T细胞为中心的面板应用于脾和BM样品30分钟。和lag3 pe抗体。分析前不久，将碘化丙啶（每100μl3.5μl）作为生存力染色包括在内。使用BD FACS Diva（V.6）在5射线BD Fortessa流式细胞仪上获取细胞，并使用FCS Express 6（Denovo软件）进行分析。

　　来自健康供体的CD34+细胞的基础编辑为FLT3，CD123，套件或AAVS1或未经处理的（仅电穿孔）。然后，在编辑后4天，为了使编辑受体的完全营业额，在没有细胞因子的SFEMII中饿死了细胞。在编辑后的第5天，根据编辑条件，使用FLT3L 500 ng ML-1，SCF 500 ng ML-1或IL-3 100 ng ml-1刺激CD34+ HSPC。AAVS1和仅电穿孔条件分为三个单独的孔，并与三种细胞因子一起孵育，以为每个供体和刺激提供适当的控制。刺激24小时后，收集细胞，并使用Qiagen RNAeasy迷你试剂盒（74104）提取RNA，并使用柱上DNase I处理（Qiagen，79254）。使用纳米体定量RNA并发送进行测序（DNBSEQ滞留的mRNA库，BGI）。在FLT3-，KIT和CD123编辑的样品，对照AAVS1编辑的样品和仅电穿孔样品中，比较了基因表达曲线对特定配体刺激的响应的变化。将原始测序文件过滤以进行质量控制，并使用Star Workflow59与参考人基因组HG38保持一致，从而获得基于基因的计数矩阵。根据初步主成分分析，我们将一个样本（HD-2，套件编辑，未刺激）确定为一个离群值，并将其从随后的分析中删除。我们还滤除了累积读数计数小于10或测量（读取计数> 0）的累积读数较差的基因，少于两个样品。使用DESEQ2软件包60在R软件中进行统计分析。使用阴性二项式模型对基因计数进行建模，使用WALD检验测试了特定系数的重要性， 使用HOLM MEDATIC61调整P值以进行多重性。我们使用完整的模型配置分析了每个基因的表达模式：FullModel：geneexpr_i = b_0+b_don。供体+b_edit。编辑+ b_stim刺激+ b_（edit.stim）编辑x刺激。然后，我们测试了以下参数的重要性：b_edit（ut vs aavs1）：相对于参考组AAVS1在UT中差异表达的基因；B_EDIT（FLT3 | KIT | CD123与AAVS1）：在使用FLT3，KIT或CD123 SGRNA编辑的样品中差异表达的基因相对于参考组AAVS1；B_STIM：相对于未刺激的组，在刺激样品（FLT3L，SCF或IL-3）中差异表达的基因；B（edit.stim）：刺激后以特定于组的特定方式差异表达的基因。

　　每个比较中鉴定出的重要基因的表达值在扩展数据中显示为热图图5C，e。这些数字是使用R软件包GGPLOT262生成的。

　　CD34+细胞的基础编辑为FLT3，CD123，套件或AAVS1。编辑后四天，细胞在没有细胞因子的SFEMII中饿了一整夜。在编辑后的第5天，将CD34+ HspC与FLT3L（500 ng ml-1），SCF（500 ng ml-1）或IL-3（100 ng mL-1）在37°C下孵育（根据编辑条件（根据三个细胞质中的每个细胞质中，AAVS1）。6小时后，收集细胞并在液氮中闪烁干燥的颗粒。将细胞颗粒在5％SDS，50 mM TEAB pH 8.5中裂解，蛋白酶抑制剂（Roche）和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich，磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3）裂解30分钟。蛋白质浓度由BCA（Thermo Fisher Scientific）确定。用250 U的苯甲酶处理蛋白质（30 µg）的等分试样，并在室温下孵育5分钟。然后用DTT（最终浓度，10 mm; 56°C持续30分钟）还原蛋白质，在室温下用碘乙酰胺（25 mm）烷基化30分钟，用12％的磷酸酸性化1:10，用12％的磷酸酸化，用6×6倍的6×磷酸（90％甲醇和100 mm teab toprap to s s-s-s-prap commicrap commicrap）进一步稀释6×磷酸。用150 µL的结合缓冲液洗涤色谱柱四次，并用胰蛋白酶在37°C的夜晚消化蛋白质。施加洗脱缓冲液（1-50 mM茶具，2–0.2％甲酸和3–50％乙腈）后，通过离心从色谱柱中提取肽，并通过真空离心干燥。Peptides were resuspended in 100 mM HEPES, pH 8.0, and treated with TMT-Pro isobaric labelling reagents for 1 h at room temperature using 8 out of the 16 possible reagents (126, 127N, 128N, 129N, 130N, 131N, 132N and 133N, or 127C, 128C, 129C, 130C, 131C, 132C, 133C and134n）。每个实验包括来自目标和对照编辑的蛋白质±配体刺激的2个单独供体。标记后，将反应用5％羟胺在50 mM茶具中淬灭，混合，干燥， 在0.1％TFA中重构，并由C18脱盐。然后，如先前所述63，通过Fe3+-NTA-IMAC富集磷酸肽，并通过纳米液相色谱与串联质谱法（LC-MS/MS）进行分析64。Peptides were loaded onto an analytical column with an integrated ESI emitter tip (75 µm internal diameter, fused, packed with 25 cm of 1.9 µm Reprosil C18, ESI Source Solutions), desalted and resolved with an LC gradient (1–5% B in 5 min, 5–18% B in 115 min, 18–27% B in 50 min, 27–39% B in 30 min,在15分钟内为39–80％B，其中A在水中为0.1％甲酸，B乙腈中的甲酸为0.1％）。用6个PASEF坡道（迁移率范围为0.8-1.4 V s cm -2，坡道时间100 ms），启用MS/MS步进启用，1.5 DA隔离宽度和目标强度为17,500的17,500。启用了主动排除，释放时间为30 s。使用MSFragger和前体和产品离子公差分别为25 ppm和0.05 DA，针对向前反向的人蛋白数据库（UCSG）搜索数据文件。搜索参数指定的蛋氨酸，可变磷酸化（Sty），半胱氨酸的固定氨基甲基化和肽N末端和赖氨酸残基的固定TMT-PRO修饰的可变氧化。自定义Python scripts65用于将搜索结果过滤至1％的FDR，并提取TMT记者离子强度并纠正同位素杂质。在滤除缺失TMT值的PSM之后，将报告基因的证据求和了相同修饰和电荷状态的肽，其值小于20计数为估计的噪声水平（20个计数）。然后将数据归一化的数据归一化，在中位报告的离子强度小于100个计数后，将数据归一化。我们使用完整的模型配置分析了每种肽的磷酸化模式：FullModel：Phosphopeptide_i = B_0+B_DON。供体+b_edit。编辑+ b_stim刺激； 并使用似然比测试和以下还原模型测试了B_EDIT和B_STIM的重要性：用于测试B_Edit的还原模型：Phosphopeptide_i = B_0 + B_DON。供体 + b_stim刺激；用于测试B_STIM的还原模型：Phophopeptide_i = B_0 + B_DON。供体 + b_edit。编辑。

　　鉴于该方法的高信噪比和有限的样本量，对结果进行了描述性分析。我们计算了两个编辑设置的未刺激和刺激条件下的磷酸化水平之间的平均值（跨供体）倍数变化。

　　在HEK293T细胞中进行了指南seq66。使用以下条件：在补充表1中提供了指南seq dsodn，通过退火解放纯化的寡素指南指南seq dsodn感应和反义（补充表1中提供了序列列表）：95°C 2分钟，慢速下降至25°C，每周循环为700 cycles，以-0.1°C的速度降低至25°C。使用SF细胞系4D核对器X KIT S（Lonza，V4XC-2024），用4 µg SPRY CAS9 mRNA，200 pmol的DSODN和600 pmol引导RNA对HEK293T细胞进行电穿孔。在滴定后选择DSODN浓度，以确定最大剂量允许通过电穿孔输送后24小时至少60％的细胞活力。电穿孔后4-6天收集基因组DNA。如前所述67，我们进行了一些修改，进行了指南seq库的构建。使用以下条件将适配器的寡聚（来自IDT）退火：95°C持续2分钟，慢速降至25°C，每周循环的增量为-0.1°C，为700个循环。我们将TN5-转培酶（86％的反应量）添加到预先退缩的寡中（14％反应体积），用于室温下的转座体组装1小时。我们通过在1×TAPS-DMF的情况下将组装的转座体滴定到200 ng的基因组DNA（GDNA）中来制备标记反应，在55°C下孵育7分钟。1×TAPS-DMF缓冲液在pH 8.5时含有50 mm Taps-NaOH（在室温下； Thermo Fisher Scientific，J63268AE），25 mm氯化镁（MGCL2； Thermo Fisher Scientific，AM9530G），50％Dimethylyformide（Thermo Fisher formamide（Thermo Fisher Scientific）（206673）。在室温下用0.2％SDS将转座体灭活5分钟。选择标记条件，以浓度为500-1,000 bp的DNA片段尺寸分布。分离标记的DNA后，我们进行了两步PCR扩增，第一步（PCR 1）进行了指南seq寡核特异性扩增，第二步（PCR 2）用于索引。PCR 1反应混合物含有50 mm氯化镁（MGCL2； Thermo Fisher Scientific，AM9530G），2×铂Superfi PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific，12358050），0.5 m氯化氯化铵溶液（TMAC; Sigma-Aldrich，T3411，T3411），10 µm指南寡素化学量表（10 µM指南） - 补充了10 µm-depperrary-deptrary-deplection-iDT（iDT）（IDT）（IDT）（IDT）（底漆（IDT，5'-AATGATACGGCGACCCCCGAGATC-3'）和标记的DNA。PCR 2反应混合物与PCR 1相同，但没有50 mM MGCL2，我们添加了10 µM i7条形码引物（IDT）而不是GSP。PCR 1产物用Ampure XP珠（Agencourt，a63882）的45 µL（0.9×原始反应）大小选择，并在无核酸酶的水中洗脱，然后继续进行下一步。The PCR 2 amplified product was double-size selected with 25 µl (0.5× original reaction) of AMPure XP Beads and then with 17.5 µl (0.35× original reaction) of the beads to isolate PCR products in the range of 200–500 bp, quantified using the Qubit dsDNA High-Sensitivity Assay (Thermo Fisher Scientific, Q32851), checked for size and purity using the在对样品进行等摩尔汇总并测序之前，贴纸（Agilent 4200系统）和KAPA QPCR（KAPA库量化套件Illumina平台）。使用以下参数在Illumina Miniseq系统上运行的配对端150 bp（约150万个读取），将库作为​​池进行深入序列：25–35％的phix和151 | 8 | 17 | 141（read1 | index1 | index1 | index2 | read2）。使用GS-Preprocess（https://github.com/umasstr/gs-preprocess）和Bioconductor套件Guideseq（v.1.4.1）68分析了指南seq实验的深层测序数据。GS-Preprocessing脚本基于索引信息将RAW Illumina FastQ文件取代，并将序列文件映射到参考基因组。它生成了输入文件（Plus和减链的BAM文件，GRNA FASTA文件以及每个读取的唯一分子索引（UMI）） 用于bioconductor套件GuidEseq。峰值聚合的窗口大小设置为50 bp。为Spry-Cas9设置了离心位点的识别参数，如下所示：pam.pattern =“ nnn”，max.mismatch = 10，包括bulge = true，max.n.bulge = 2l，上游= 50，下游= 50，下游= 50，max.mimmist.mismatch = 6 and washer.mismatch.mismatch.mismatch.mismatch.pam = 3。这些背景峰用于在Cas9 – Sgrna处理组中滤除潜在的热点或测序噪声。该分析提供了潜在的脱靶序列的列表，这些序列根据融合的UMI和适配器连接位置对独特的读数进行排名，该序列与每个序列上的Spry-Cas9活性相关（补充表16）。结果通过不匹配+凸起的数量过滤。< 6 to identify high-risk off-target sites.

　　Candidate in silico predicted off-target sites were selected on the basis of the CRISPOR online tool (top six intronic and top six exonic sites based on sequence homology for FLT3, CD123 and KIT sgRNAs when using a SpRY-Cas9 PAM (NRN). We amplified the off-target sequences by PCR on genomic DNA extracted from edited or control CD34+ cells, using three different healthy donors for each condition. PCR products were designed to be <400 bp in size. PCR amplicons for each condition were pooled together and sent for library preparation and NGS sequencing (300 bp paired-end reads, Azenta). One exonic and two intronic sites for CD123 sgRNA-R were eliminated from the final analysis owing to an insufficient number of reads. Reads were processed using the CRISPResso2 tool (CRISPRessoPooled), setting as the quantification window the amplicon interval overlapping with the sgRNA. We modelled the proportion of EditedReads over TotalReads (unedited + edited) using a binomial response generalized linear model (logistic regression) including the following covariates: DonorID, factor distinguishing cell donor; treatment, a binary variable having value treatment = 1 for edited and treatment = 0 for mock samples. Standard logistic regression estimation frameworks have convergence issues when the input data table is sparse (multiple samples with EditedReads = 0). To address this issue, we adopted a bias-reduction approach69, a second-order unbiased estimator that returns finite standard errors for the coefficients under all conditions. We performed the regression and analysed the results for each locus separately and calculated: (1) EditedReads proportion estimation and related 95% confidence interval for all samples; (2) the significance of the treatment coefficient (Wald test for the null hypothesis β = 0 and α = 0.05). Suppose the coefficient estimate is positive and significant. In that case, the expected EditedReads proportion in the edited samples (treatment = 1) is greater than in the mock samples, and therefore bona fide, off-target, base editor activity is detected. For the quantification of on-target indels proportion, a similar procedure was used by selecting from the edited reads (Unedited=“FALSE”) only those having either n_deleted > 0 or n_inserted >0。分析是使用R软件进行的。为了估计逻辑模型，我们使用了R软件包BRGLM2（参考文献70）。

　　使用ABE引起的非依赖性RNA编辑活性的存在和程度已通过在“编辑CD34+ HSPCS”部分中所述的RNA-Seq实验中产生的数据进行了验证。每个样本的R1和R2读取文件是使用Reditools271使用基本质量过滤阈值（-BQ 30）和HG38转录本注释数据库处理的。根据Reditools2产生的输出，对于每个样品，我们选择了参考基因组中的腺嘌呤核苷酸，其覆盖率最高（最高5％），读取了转录组学。然后，我们计算了检测到的A> G转变事件的百分比（A> G转型的数量）/A覆盖率）。使用扩展数据中的框图以图形表示每个样品中所有A核苷酸的A> G转变速率的分布。在补充表21中报道了样品特异性覆盖阈值和所考虑的核苷酸总数。

　　n值表示生物独立的样品，动物或实验的数量。数据总结为平均值±S.D.在有足够的样本量（n≥5）的情况下应用推论技术，否则仅报告了描述性统计。使用未配对的t检验进行了两组之间的比较。在适当的情况下，报告了FDR调整后的P值。当比较两组以上的一个变量时，使用单向方差分析。当比较两组以上的多个变量时，使用双向方差分析。报告了行或色谱柱效应的P值适当地描述所选参数对测量变量的重要性。组之间的多重比较是在适当的情况下使用Benjamini，Krieger和Yekutieli的两阶段升级程序进行的，以控制FDR（Q = 0.05）。在所有分析中，显着性阈值设置为0.05；NS，并不重要。使用GraphPad Prism v.9.4（GraphPad）进行分析。在每个方法部分中报道了基因组脱靶位点，MS，RNA编辑和抗体/配体亲和力曲线的统计分析方法的统计分析方法。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。