这项研究的所有作者都致力于研究研究中的高标准和伦理学。本研究中使用的临床样本是作为常规诊断程序和用于研究的数据的一部分收集的。这项研究的发现是透明地报告的，并致力于准确性和完整性。所有数据和结果均未操纵，并且清楚地确认了研究的任何局限性。

　　本研究中使用的临床样本是由来自得克萨斯州九个受影响农场的野战兽医（农场1、2、4、5、6和7），新墨西哥州（农场8），堪萨斯州（农场9）或俄亥俄州（农场3）。在受影响的农场中，总共从奶牛（n = 323），家猫（n = 4），伟大的果酱（n = 3），鸽子（n = 1）和浣熊（n = 1）中收集了332个样品。包括牛奶（n = 211），鼻拭子（n = 46），全血（n = 25），血清（n = 15），粪便（n = 10），尿液（n = 10），尿液（n = 4）和组织（乳腺（n = 4），肺（n = 1），淋巴结（n = 1），淋巴结（n = 3），小intestine（N = 3），牛被提交给康奈尔动物健康诊断中心（AHDC），德克萨斯州A＆M兽医医学诊断实验室（TVMDL）或俄亥俄州动物疾病诊断实验室（OADDL）进行诊断调查。一只家猫，两只果酱和一只鸽子（农场1）被提交给AHDC，而三只猫（4和8农场），一只浣熊（农场8）和四头牛被提交给TVMDL进行尸检和测试（补充表1）。

　　从农场3中收集的动物（n = 15）的顺序样品（牛奶，鼻拭子和血液）用于研究病毒脱落的持续时间（补充表2）。此外，从表现出呼吸窘迫，牛奶产量下降和牛奶特征下降和改变的牛奶特征（临床； n = 25）的动物中收集的成对样品（牛奶，鼻塞，尿液和粪便）以及从农场3的表面健康的动物（临床； n = 25）（n = 25）（n = 25）（n = 25），用于从临床和非临床动物（扩展的数据表2）中比较病毒。

　　所有九个农场的临床历史都是从带有样本的样本提交表格获得的，这些表格与AHDC，TVMDL和OADDL一起发送。每个农场的其他相关信息都是通过实验室诊断医生进行的调查来参加兽医的。

　　从牛奶，鼻拭子，全血，血清，粪便，尿液和组织匀浆中提取病毒核酸。牛奶，鼻拭子，全血，血清和尿液，用于提取200 µL。在原乳样品中，直接使用或以1：3牛奶的比率稀释或稀释200 µL：PBS的PBS含有200 µL用于核酸提取的稀释度。将组织和粪便在PBS – BSA（1％; 10％w/v）中均质，通过离心清除，并使用200 µL上清液进行提取。按照制造商的建议，使用Magmax病原体RNA/DNA试剂盒（Thermo Fisher）和自动化的Fisher Fisher Flex核酸提取器（Thermo Fisher）进行所有RNA提取。使用VETMAX-GOLD AIV检测试剂盒（Thermo Fisher）和国家动物实验室网络（NAHLN）引物评估IAV RNA的存在，并针对靶向保守基因基因或H5 haemagglutinin Gene53的探针。在以下条件下，使用应用生物系统7500快速PCR检测系统（Thermo Fisher）进行扩增和检测：逆转录在45°C下为10分钟，在95°C下进行10分钟，用于聚合酶激活的95°C，在94°C下在94°C下为15 s的45个周期在94°C下为60°C，在60°C下进行60°C，以供60°C进行Nealing和Ennerening和Ennerening和Ennerement。计算相对病毒载荷，并表示为45 RRT – PCR循环减去实际CT值（45-CT）。正面和负扩增对照以及内部抑制对照与测试样品并排运行。还使用200 µL未稀释的牛奶和血清以及100 µL的全血，以基质基因进行测试。使用翠鸟屈曲（Thermo Fisher）上的Indimag病原体试剂盒（象征性生物科学）提取这些样品，然后使用PATH-ID多路复用一步一步的RT-PCR KIT（Thermo Fisher（Thermo Fisher）进行以下条件：在48°C下，在48°C下，在95°C的10分钟下，在95°C和40 cycles and 15 c in cat in 60 min和60 c cy cat in in New°C下进行10分钟。

　　在急性和康复期感染期间，从农场2的动物感染（n = 20）收集的配对血清样品用于确定血清转化到HPAI HPAI H5N1病毒，并使用血液凝集抑制测试。如前所述，使用BPL灭活的A/TK/IN/3707/22抗原（进化枝2.3.4.4b）确定血清血浆抑制活性。血凝抑制滴度表示为log2值，其中1 log2是最小滴度被认为是阳性的。

　　在1和2的农场的合并牛奶样品中进行病毒分离。从单个动物中汇集了大约5 ml牛奶，并在4°C下以1,700g的1,700g离心10分钟。将上清液丢弃，并将沉淀重悬于5 ml无菌PBS – BSA（1％）中，然后在4°C下以1,700g离心10分钟。再重复一次洗涤步骤，并将最终颗粒重悬于1 mL PBS – BSA（1％）中。病毒分离是在牛子宫上皮细胞（CAL-1；在AHDC病毒学实验室内开发的），在补充的最小​​必需培养基（MEM; corning）中培养，并补充了10％FBS和青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Sciention; 10 U ML – 1和100 µG ML – 1和100 µG ML – 1）。将细胞在T25烧瓶中培养，并从感染的母牛中接种1 ml牛奶颗粒重悬浮，并在37°C下孵育1小时（吸附）。然后除去接种物，然后将细胞用PBS洗涤一次，并用1 mL完整的生长培养基（MEM 10％FBS）补充。每天监测细胞，以开发细胞病作用（CPE），包括细胞肿胀，舍入和脱落。当CPE达到70-80％时，收集了感染的细胞，并在三个冻结 - 收盘周期后收集细胞悬浮液。通过使用抗核蛋白小鼠单克隆抗体（HB65，H16-L10-4R5，ATCC）和全基因组测序的RRT-PCR（一种免疫荧光测定）和全基因组测序，通过RRT-PCR（一种免疫荧光测定法）证实了分离的病毒的身份。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI; 62248，Thermo Fisher Scientific）染色。

　　通过病毒滴定，对牛奶和感染动物的组织的传染性病毒载量进行了定量。为此，在MEM中制备了RRT-PCR阳性牛奶样品和组织匀浆的连续十倍稀释液，并在96孔板中接种到Cal-1细胞中。在四倍的井中接种每个稀释。接种后48小时，吸气上清液，并在室温下用3.7％甲醛溶液固定30分钟，并使用抗NP（HB65）小鼠单克隆抗体进行免疫荧光测定。使用终点稀释液和Spearman和Karber的方法确定病毒滴度，并表示为TCID50 ML – 1。

　　收集了来自4个奶牛的25个组织样品，并在福尔马林中收集了来自1只家猫的12个组织。将这些福尔马林固定的石蜡填充（FFPE）组织以3 µm的厚度切片，用山马久氧化物和曙红染色，并检查了组织学变化。为了确定奶牛和受HPAI H5N1影响的奶牛和猫的病毒向向主义和组织分布，我们在FFPE组织上进行了原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC），如前所述6。简而言之，将组织切片用二甲苯脱蜡，用绝对乙醇洗涤，并用过氧化物酶阻塞，然后用抗原检索1小时。对于ISH，靶向H5NX进化枝2.3.4.4b病毒的V-InfluenzaA-H5N8-M2M1探针（高级细胞诊断）和根据制造商的说明使用了RNASCOPE HD 2.5分析。ISH信号用与碱性磷酸酶结合的多个放大剂放大，并在室温下与红色底物孵育10分钟，并用降血石蛋白抗染色。IHC遵循标准诊断IHC程序，在佐治亚大学兽医诊断实验室和USDA-ARS东南家禽研究实验室进行。具体地，将组织切片用蛋白酶K处理5分钟以进行抗原检索，并与1：100稀释度（UGA和VDL）或单克隆抗体的单克隆抗体（C65331M，子午线生物科学）一起孵育，或单克隆抗体，或单克隆抗体，或单克隆抗体，或单克隆抗体，以造成影响1：2,000稀释（SEPRL）持续1小时。洗涤载玻片后，加入了1：5,000稀释的二抗抗体抗体IgG（1070-04，南部生物技术），并与载玻片一起孵育1小时。所有载玻片均用血久毒素染色，以×40分辨率进行扫描，并检查了数字载玻片的病毒疗法和组织分布。

　　全血鼻拭子样品是从得克萨斯州农场1的十头牛那里获得的。样品于2024年3月16日将样品提交给康奈尔大学的AHDC。收到后，使用独立于序列的单季素扩增（SISPA）程序进行元基因组测序，牛津纳米孔测序化学和网格测序平台进行了如下所述。

　　使用Qiaamp Minelute病毒旋转试剂盒（Qiagen）在每个样品中从190 µL中提取核酸提取。在提取核酸提取之前，将样品接受酶鸡尾酒处理，由10倍DNase 1缓冲液，DNase 1，Turbo DNase，RNase鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific），基线零DNase（Lucigen），苯甲酶酶（苯甲酶 - 阿尔德里奇）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）和RNase onecorice onecore and reconcot and Prormege（Prormega）（promega and Oneforma）（PROMEGA）（PROMEGA）（prormega）（prormega and inotega）（纯化的核酸接受了SISPA，并根据先前报道的方案进行了修改54。简而言之，使用Superscript IV逆转录酶（Thermo Fisher Sciention），使用二型二型klensy（themo fisher contrandific），使用二链二型klen，将11μl用于与100 pmol的引物FR20RV-12N（5'-GCCGGGGCCTCTGCAGAGATATCNNNNNNNNNNN-3'）的逆转录反应。10 pmol的FR20RV-12N。使用Agencourt Ampure XP珠（Beckman Coulter）进行纯化后，使用10 pmol的底漆FR20RV（5'-GCCGGGGAGCTGAGCAGAGATATC-3'）使用Takara TAQ DNA聚合酶（Takara）进行SISPA PCR扩增。使用连接测序试剂盒（SQK-LSK109）和天然条形码套件96 V1将SISPA产物转换为测序文库，用于多重测序。使用网格测序仪（牛津纳米孔技术）在FLO-MIN106牛仔流动池R9.4.1上进行测序。进行了24小时的测序运行，通过使用高准确性基础呼叫，通过网格进行了FASTQ生成。调整设置以适合两端的条形码和过滤器中链条形码。然后，使用nanofilt55对FASTQ读数进行过滤，并使用Kraken（v2.1.0）56进行分类，其次是Bracken57。

　　在康奈尔大学（Cornell AHDC）的动物健康诊断中心（Cornell AHDC）和OADDL的动物健康诊断中心和OADDL进行了靶向流感，对HPAI H5N1测试阳性且CT值阳性的样品进行了测序。一组107个样本包括农场1（n = 19），农场2（n = 33），农场3（n = 54）和农场7（n = 1）的样本。一个完整的元数据表，在补充表1中提供了有关这组样品的详细信息。在康奈尔AHDC上使用高通量诊断提取方法的牛奶样品的初始靶向测序尝试失败了，尽管获得了CT值低的样品，但获得了全流胞菌A基因组序列。为了克服这一局限性，将多达50 ml的每个牛奶样品在4°C下以1,770g的含量为15分钟。如上所述，将颗粒洗涤两次，并重悬于1 ml的PBS – BSA中。然后将重悬的颗粒在PBS中稀释1：5或1:10，并将200 µL这种稀释度用于在翠鸟柔性提取物（Thermo Fisher）上与象征性的Indimag病原体试剂盒（象征性生物科学）提取。使用MBTUNI-12和MBTUNI-13 M-RT-PCR方法58生成整个IAV基因组序列。使用天然条形码套件EXP-NBD196和连接测序套件SQK-SQK109（牛津纳米孔技术）生成测序文库，并使用Griion平台在Flo-Min106 Minion Flow Cell R9.4.1上进行测序。

　　此外，使用Illumina DNA Prep Kit和Nextera DNA CD指数对OADDL进行靶向流感A的31个样本进行了靶向流感A测序。使用2×250碱基对化学的Miseq Reagent Kit V3（Illumina）在Illumina Miseq平台上进行了配对末端测序。

　　网格平台生成的测序数据经过了条形码的高准确基础调用和反复编码。设置配置为需要两端的条形码，并使用中读条形码排除读取。纳米构成软件（v2.8.0）55用于根据质量阈值过滤序列。质量得分低于12的读数，从进一步的分析中删除了较短的600个碱基对。将过滤的读取与从GenBank（a/gallus/gallus_domesticus/sonora/cpa-18486-23/2023/h5n1，ncbi登录号OR801090.1 – OR801097.1）的参考基因组下载。使用MEDAKA_HAPLOID_VARIANT和MEDAKA_CONSENSUS程序进行抛光（https://github.com/nanaporetech/medaka）生成共识序列。保留了读取深度大于20且质量得分超过20的序列。通过用三片（v0.39）59修剪读取，对Illumina miseq数据进行分析，并与Snippy（v4.6.0; https：//github.com/tseemann/snippy）进行对齐，调用变体并生成共识序列。使用Prokka软件（V1.14.5）注释基因组序列，以识别遗传特征和功能元素60。Genoflu工具（V1.03）评估了病毒基因组（https://github.com/usda-vs/genoflu）内的潜在重新分类事件。使用Geneious Prime软件（V2024.0）可视化基因组比对，突变，单核苷酸多态性和注释数据。通过Gisaid Epiflu获得的Flusurver工具被用来解释序列中确定的突变的效果，利用先前发布的数据（https://flusurver.bii.a-star.edu.sg/）。使用Geneious Prime软件中的蛋白质共有比对可视化其他突变数据。

　　The dataset consisted of HPAI H5N1 clade 2.3.4.4b genomes from samples collected between January 2023 and March 2024 in the American continent, downloaded from the GISAID Epiflu database33, and 91 complete genomes from the present study that include 50 genomes obtained from raw sequencing data, combined with another 41 complete genomes curated from the GISAID database that were obtained from the farms in our研究（农场1（n = 11），农场4（n = 3），农场5（n = 1），农场6（n = 4），农场7（n = 5），农场8（n = 6）和农场9（n = 11））。本研究中产生的基因组沉积在GISAID数据库中（补充表5），并且在Bioprojections登录号PRJNA1114404下的序列读取存档中可用原始读取。通过使用Augur V21.0.1在NextStrain62中实施的Augur V21.0.1进行系统发育分析。简而言之，使用MAFFT（V7.515）63进行了多个序列比对。使用智商（v1.6.12）64推断最大似然树，并使用Augur Refine Subcommand使用序列元数据来完善初始树。使用Treetime（V0.9.4）65进行离散性状分析。通过主持人可视化了所得数据集。系统基因组和植物学分析也对通过所有基因段的串联形成的完整基因组进行了。如上所述，使用NextStrain进行了分析，除了使用具有边缘连接分区模型的IQ-Tree推断出的最大样可能的系统发育树和1,000个Bootstrap重复。使用POPART软件包（v1.7.2）中的PB2基因序列（v1.7.2）中的中位加入树方法的pb2基因序列推断出农场之间的潜在传输网络，并具有Zero66的Epsilon。

　　从2020年1月至2024年5月，所有A型A型，奶牛和其他哺乳动物的A型流感序列（n = 3,620，北美）均从Gisaid33的Epiflu数据库中下载。仅使用完整的基因片段来推断每个片段使用具有广义时间可逆核苷酸取代的iq-Tree来推断每个片段的最大基因片段。HA系统发育用于使用TreeTort（V0.1.1；最大分子时钟偏差参数为2.5; https：//github.com/flu-crew/treesort）来识别重新分类事件。We implemented the Bayesian evolutionary analysis sampling tree (BEAST, v1.10) framework with BEAGLE library (v4.0.1) to estimate the most recent common ancestor (MRCA) for the individual gene fragments (generalized time-reversible gamma distributed site heterogeneity model, strict clock model, three independent Markov chain Monte Carlo sampling runs with 10 million iterations with sampling every 10,000 iterations)67.示踪剂（v1.7.2）68用于分析结果。使用中位节点高度和10％burn-In67生成最大进化枝可信度树，并使用figtree（v1.4.4; http://tree.bio.ac.ac.ac.ac.ac.ac.ac.uk/software/figtree/figtree/）生成最大进化枝。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。