将受精的鳄鱼卵（从Seronera鳄鱼农场进口）被运送到日内瓦大学，并在31°C下以潮湿的果皮孵育。固定所有处理过的和未处理的鳄鱼胚胎，并保存在10％中性缓冲福尔马林（NBF）中。使用Keyence VHX 7000数字显微镜进行胚胎鳄鱼样品的所有非荧光成像。使用架空设置的尼康D800相机进行了孵化的鳄鱼样品的成像。日内瓦州伦理监管机构（授权GE10619B）批准了鳄鱼胚胎和少年的维护和实验，并根据瑞士法律进行。样本量在图传奇和补充信息中指定。不需要随机化和盲目。

　　使用Piuma纳米INDENTER（OPTICS11）来获取胚胎鳄鱼皮表面的刚度测量（有效的Young的模量，PA）。在比较两个皮肤样品中的测量值时，表皮角化作用的变化会导致表面刚度的变化，这很可能与整个多层表皮的有效总体模量的相同符号的变化相关。换句话说，表皮表面刚度的增加很可能伴随着整个表皮的刚度增加。新鲜解剖的上颌骨向上侧面放置，浸入PBS中。尖端半径为99 µm且刚度等级为0.48 n m -1的探针被用来缩进2,000 nm的深度。随后分析了来自HERTZIAN接触模型拟合的负载 - 位置曲线的测量值。胚胎纳米引导序列的每个生物学复制均为10次（图1C）或5次（图2F）。这些压痕点位于单行中，每个点分离为120 µm。图显示了每种生物学复制的平均有效Young模量值的图。提出。统计分析是在Prism 9（GraphPad）中进行的。

　　共聚焦显微镜用于根据整个胶原蛋白染色的方案25的方案，用快速绿色FCF染料（Sigma-Aldrich）染色的胚胎鳄鱼样品25。如先前所述的25，使用SP8显微镜（Leica Microsystems）进行图像采集，并具有×63的石油免疫物镜（数值孔径为1.4）。快速绿色在627 nm处受到激发，并在630–730 nm的范围内检测到信号。使用Imaris（牛津仪器）进行了图像重建。

　　如前所述24，剖析固定的胚胎鳄鱼样品并嵌入石蜡中。在用山马久氧化物和曙红（H＆E）染色之前，用RM2255的小型集团（Leica Microsystems）将石蜡切片切成10 µm。使用自动幻灯片扫描仪（3Dhistech）对载玻片进行成像。

　　注射鳄鱼卵是根据我们先前出版的工作20,21（https://youtu.be/qcywsgbffny）进行的。将鳄鱼卵孵育至适当的发育阶段，然后用70％的乙醇清洁。将鸡蛋蜡烛以识别出合适的注射静脉，并使用细节锯（Micromot 50/e，proxxon）去除壳，同时保持下面的膜完整。然后使用细镊子除去蛋壳，并用棉芽将矿物油施加到膜上，从而提高膜透明度，以清晰地可视化下面的静脉。将样品注入30 µL的PBS作为对照，或30 µL含有重组鼠EGF（Peprotech）的PBS。注入不同剂量的EGF（0.625 µg，1.5 µg或2 µg）。还将专利蓝色添加到溶液中，以实现注射过程中进入静脉的溶液的可视化。使用附着在微型手持剂（MM33右，Marzhauser）上的汉密尔顿注射器进行注射。注射后，清洗了鸡蛋以去除多余的矿物油，并用胶带覆盖蛋壳窗口。然后将处理的胚胎返回其孵化器。在每个实验的10天的过程中，将样品注入三次（图2A）。在收集时，用静脉注射EDU治疗胚胎以标记增殖细胞（baseclick）；EDU注射后3小时进行胚胎收集和固定。在实验结束时，使用了一些EGF处理的胚胎进行纳米识别，另一些则孵育直到孵化。随后在4°C下将胚胎固定在10％NBF中，并使用键VHX 7000数字显微镜成像。注射EGF的每个胚胎都表现出修饰的头尺度图案。这些实验中的所有重复都在补充图4中显示，并在补充表1中进行了总结。

　　我们在这里使用的药物（EGF）具有特异性促进表皮生长和分化的显着特性，而没有在体内胚胎发育的其他方面表现出强烈的有害作用。进一步验证鳄鱼头尺度图案的压缩折叠过程中涉及的参数将需要确定其他当时会特别影响一个参数的药物。例如，在开发鳄鱼胚胎中胶原蛋白的3D结构在药理上尤其有趣，以研究对背部和侧颌骨表面皮肤折叠的相应影响。不幸的是，目前已知会影响胶原蛋白组织的药物（例如β-氨基替代剂，BAPN）在体内剧毒，因为它们强烈影响了多种结缔组织的发展，例如皮肤，骨骼和血管。鉴于鳄鱼胚胎实验的很大困难，可以在皮肤中一次特异性地影响一个机械参数的药物筛选，最初可以在更古典的模型（例如鸡肉）中以更可靠的胚胎来源进行。

　　解剖固定胚胎鳄鱼样品的上下颌，将脱水成甲醇，并用过氧化氢漂白，然后再用Triton X-100（Sigma-Aldrich）在PBS中补液和透化（PBST）（PBST）。对于核染色，将样品在TO-PRO-3碘化物或Yo-Pro-1碘化物（3：1,000，Thermo Fisher Scientific）中孵育6小时。使用EDU检测套件制造商的指南（baseclick）检测到EDU阳性细胞（EDU+）。然后将样品脱水成甲醇，并在无水条件下进行胶原蛋白，并具有相同的快速绿色方案25与共聚焦显微镜相同（见上文）。然后根据IDISCO+协议37清除样品。使用浅层显微镜（超显微镜大火，Miltenyi Biotec）分别成像上颌骨样品。在氢氧化钾（KOH）中，将选定的标本与艾他林红色静止下，并重新成像以可视化发育​​中的钙化骨基质（扩展数据图1B）。在使用Houdini（SideFX）和虚幻引擎（Epic Games）的红移引擎（Epic Games）渲染之前，使用ImageJ38处理图像堆。补充表5中显示了用于LSFM的重复的摘要。每个样品都包括上颌和下颌，我们分别扫描了下颌。

　　使用我们定制的成像系统39，将机器人臂，高分辨率摄像头和发光二极管的照明篮结合在一起，我们将“光度立体立体声”和“从运动中”结合在一起，重建精确的3D表面网眼和孵化的鳄鱼头的颜色纹理（图5B – E和Extered Data图）。为了比较个体之间的多边形大小，我们首先计算网格的最小原理曲率。然后，通过应用骨架化算法40来计算每个样品的折叠网络，然后在网格的负曲率区域上进行图形简化（使用MATLAB R2021A）。使用网格的颜色纹理，使用Houdini（SideFX）手动完成折叠网络。

　　Using TO-PRO-3, YO-PRO-1, EdU, Alizarin Red and Fast Green staining (see above), we segmented the light-sheet microscopy data to extract (in both the upper and lower jaws) the geometry of the epidermis, dermis and bone tissues (Supplementary Video 6), as well as the dominant orientations of the dermal collagen fibres, and the distribution of proliferating cells in the dermis and表皮。分段数据用于构建鳄鱼头的有限元模型（FEM，见下文）。

　　细胞核染色信号可以从真皮对表皮进行精确分割，因为前者表现出较高的细胞密度（图3A）。更具体地说，LSFM根据TO-PRO-3/YO-PRO-1荧光信号产生的3D图像受到MATLAB-R2021A中的3D Canny的边缘检测41受到3D二进制图像，从而产生了一个非零素数，其中非零体素形成点云与两个3D表面相对应的表面：epidermis和epidermis和epidermis的表面。对于这两个表面中的每一个，我们在每个点计算表面正常矢量与强度梯度。The position of points and their corresponding normal vectors are then fed to a screened Poisson surface reconstruction algorithm42 in Meshlab43 to reconstruct triangular surface meshes, which effectively represent the initial point clouds in a much lighter format: 3D meshes are much easier to manipulate, for example, with the Laplacian smoothing algorithm to filter out the artifactual stair-step patterns in the original素化数据格式。表皮表面和表皮– Dermis边界可以计算每个对照的表皮厚度，并在不同的发育阶段进行处理的样品。

　　胶原蛋白网络3D结构可能会在生物力学模型中发挥作用25,26，因为它赋予组织具有独特的机械性能，例如对同质应激的各向异性反应。因此，我们评估了脸部真皮中胶原蛋白纤维的方向和发展的鳄鱼胚胎的颌骨（图3B）。为此，我们使用了最近发布的全安装快速绿色染色方法，该方法通过共聚焦或灯页显微镜提供了3D胶原网络体系结构的无与伦比的可视化。简而言之，（1）通过确定13,000个同质分布的皮肤样品（50×50×50×50 voxels的立方体斑块）中的每一个中的每个主要的3D快速傅立叶变换系数来确定胶原纤维纤维种群的两个最主要方向（S）。（2）使用光纤轴错配函数实现精确优化程序实现纤维方向的空间变化（补充注释2）；（3）使用光谱最小二乘近似值插值的两个显性纤维取向，两者都与真皮中间平面相切。

　　在标准的EDU标记和检测（补充视频3）之后，我们使用了3D主曲线接近36（在荧光信号上）来分割E51处胚胎鳄鱼的颌骨中的增殖细胞，即头尺度出现时（图3C）。该方法在分组时（即接触）时单独分割细胞时非常有效。由于信号强度嵌入了3D域中，为每个体素计算了三个信号主曲线K1,2,3（以MATLAB为单位），并以Ks> kthreshold（ks> kthreshold）为特征的体素（在其中存储）。连接体素的质心被认为是EDU+细胞的位置。然后，我们通过在相应的分段组织层中选择采样点来分别计算真皮和表皮的EDU+细胞的密度。每个采样点周围的空间仅限于一个由层边界夹住的80×80×80素体的盒子。将采样点的EDU+细胞的密度计算为剪切盒中的单元数除以其体积。在我们的数值模型中，增殖细胞的密度表示为依赖空间的生长功能。我们使用光谱最小二乘近似方法将此信息传输到3D模型，以在目标网格的空间模式上插值数据（补充注释3中提供了详细信息）。

　　为了分割骨组织，我们要么使用3D Canny的边缘检测（非常强的）艾他林红色信号或半自动程序，用于（较弱）快速绿色或EDU信号的样品。在后一种情况下，我们（1）在x，y和z方向上选择几个部分，并手动标记真皮和骨头之间的分离，（（2）将所有轮廓点的坐标存储为3D点云，并用变量隐式点SETS44和（3）使用筛分的Poisson Surface Replatsimention42与Meshlab43 s surface Surface 44和（3）将其正常。

　　我们使用分段数据来构建3D有限元数值增长模型。在头尺度图案开始之前，在表皮，真皮和胚胎的表面边界上生成了三角形网格（用于上颌骨，真皮和骨骼的表面边界）（图1B，请参见上文）。平滑表皮表面和表皮 - dermis界面，以去除与样品制备相关的任何人工局部变形，包括脱水成甲醇。这三层中每一层的3D体积被表示为使用Tetgen45生成的四面体网格（扩展数据图8A）。

　　在模拟生长过程中，四面体元素的变形是通过有限 - 应变理论实现的，在该理论中，当前时间t在当前时间t表示为矢量变量x = x（x，t）的点的空间坐标表示为x的空间坐标，其中x是这些点的空间坐标，该点是在参考配置上的图8 = 0（at is at is at is at t = 0。电流和参考构型之间的坐标是通过变形梯度图F-（即二阶张量）连接的，它结合了弹性和生长变形。然后，根据新霍克材料模型计算出每个四面体元件中存储的弹性能和机械应力，该模型已知在较大的变形下表现适当地表现，并允许掺入各向异性材料，例如胶原蛋白纤维47（补充注释4）。纤维的方向以及细胞增殖密度的空间模式，都是从LSFM数据推断的（图3B，C），均供应到机械模型。但是，弹性模量，纤维刚度和最终生长量被认为是未知参数。请注意，刚度的绝对值与数值模拟无关，因为模型关键参数是相对于真皮和表皮模量的纤维刚度，以及表皮与真皮刚度的比率（Young的模量）。

　　为了执行数值模拟，上述机械模型公式使用FEM离散为四面体元素，并与接触和粘性力集成（补充注释5）。然后，在使用NVIDIA GPU进行高性能计算的内部应用程序中实现了最终模型。为此，我们使用CUDA编程语言来开发密集计算内核，而C ++用于数据管理，几何处理，输入/输出操作和图形用户界面。我们的申请集成了以下开源库：Dear Imgui（https://github.com/ocornut/imgui，MIT许可），用于图形用户界面，CUDA C ++核心库（https:///github.com/nvidia/nvidia/cccl，apache-2.0，apache-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig-eig forgess，（https://gitlab.com/libeigen/eigen，MPL-2.0，BSD许可），用于线性代数和libigl（https://github.com/libigl/libigl/libigl/libigl/libigl，gpl-3.0，mpl-2.0，MPL-2.0许可证）用于几何处理。仿真输入是四面体网状，该网格定义了鳄鱼头的几何形状（表皮，真皮和骨层）。此外，还使用了一组模型参数：除了真皮胶原纤维方向和刚度外，我们还包括表皮和真皮，Young的模量和Poisson的比例，增长率功能和细胞增殖模式。然后计算皮肤的变形，并将最终几何形状作为四面体网格产生。

　　机械模型与贝叶斯优化过程（带有并行采样的MATLAB R2021A的贝叶诺斯库）集成在一起，即一种机器学习的全局最小化算法。最佳标准包括稳态模拟几何形状与LSFM获得的网格之间的指标（整合多个拓扑和几何特征，见下文）之间的距离。为了计算折叠网络的指标，我们首先计算代表表皮边界的相应表面网格的最小原理曲率。然后，我们通过应用骨架化算法40，然后将图形简化（使用MATLAB R2021A）划分皮肤折叠。接下来，我们计算网络的以下几何和拓扑特征：域数（周期），域周围，边缘长度，边缘的曲率，边缘的曲率和不完整的边缘长度。最终指标是一个矢量，其组件是这些特征的手段，将其归一化为其边界框的对角线长度。鉴于指标矢量中的组件之间的组件之间可能会有很大差异，因此我们需要正确地将它们正常化。为此，我们使用LSFM数据来计算E64处E64处的对照指标（2μgEGF）E64。然后，我们计算个体（即在所有个人中）和S.D.每个组件（图2E）。最终，我们通过减去个体平均值并除以个体间的s.d。

　　为控制和处理的目标找到最佳参数值以两个步骤执行。首先，我们使用E64控制目标网格并对六维参数空间进行优化，包括表皮杨的模量EEPIDERMIS（保持换人器= 1）；表皮和真皮泊松的比例，vepidermis/真皮；真皮切向生长值（保持真皮值的80％）；和纤维刚度K1（K2设置为0）。其次，使用2μgEGF处理的目标，我们对包括表皮相关参数（即eepidermis，vepidermis and vepidermis and（由EGF诱导的附加表皮切向生长），对三维参数空间进行了另一种优化。有关参数值的完整列表，有关参数和补充表4的定义，请参见补充注释4和6。为了最小化模拟与LSFM目标几何形状的指标向量（对照或处理过）之间的距离，我们使用高斯过程（即，在优化循环中多元正态分布的多元正态分布的概括）以近似于后的均值和变异功能，从而使目标函数函数近似于目标函数。根据贝叶斯推断，在每次迭代时进行后函数进行更新，然后使用此信息来计算改进函数的期望，这衡量了观察目标（即模拟和观察之间的距离）的机会，小于到目前为止观察到的最小目标小的机会（补充注释7）。通常需要进行数千次迭代的优化过程一直持续到最后500次迭代中不再有改进为止。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。