C57BL/6（野生型）和K18-HACE2转基因（K18-HACE2）小鼠是内部繁殖或从Charles River或Jackson Laboratory购买的，并在内部设施中维护。所有小鼠都保持在没有特定的无病因条件下。所有程序均根据北莱茵 - 韦斯特法里亚伦理委员会批准的道德方案进行。所有使用的小鼠均为6至20周龄之间的雄性和女性。将小鼠随机分配到对照组和生酮饮食组或对照组和酮酯组。动物实验并未以盲目的方式进行，因为研究人员需要设计和进行实验并分析数据。

　　来自中等共发生的19或ARDS患者的血清样品是由流感，COVID-19或细菌性肺炎引起的，从大学医院BONN（n = 79），Radboud大学医学中心Nijmegen（n = 35），大学医院ESSEN ESSEN（n = 21）和Hannover医学院（n = 20）。根据柏林定义定义了ARDS。在波恩大学医院收集了健康捐助者和BALF样品的血液。从所有患者那里获得了知情同意，并由每家医院的机构审查委员会批准方案。使用Ficoll Paque Plus（Millipore Sigma）密度梯度离心分离外周血单核细胞（PBMC）和单细胞悬浮液。从每个患者和供体中收集血清，用于分离RNA和细胞因子的定量。Before fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis, BALF samples were collected, washed and fixed with 4% paraformaldehyde, and lysis of red blood cells with ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer was performed for blood samples according to the manufacturer’s instructions.

　　通过多重免疫测定分析（Luminex Xponent Software（Thermo Fisher scientific）和Legendplex（Biolegend）（Biolegend），collocinchonic Assay（collain Contble Assay），通过多重免疫测定分析（Luminex（R＆D），在血清中测量了细胞因子，激素，促蛋白，总蛋白和胶原蛋白，总蛋白和胶原蛋白，总蛋白和胶原蛋白。（胶原蛋白）根据制造商的说明。

　　将左肺叶固定在10％甲醛溶液中，并嵌入石蜡块中。用Picrosirius Red染色部分，使用Zen 3.1蓝色版（Zeiss）评估胶原蛋白沉积。如前所述48，使用偏振光显微镜对胶原纤维的颜色色调的函数进行了定量。根据先前发布的协议49，使用MATLAB软件（Mathworks）创建了一种改编的算法。该算法将所有图像从RGB转换为HSV颜色模型。红色成分的分离为2-9和230–256。胶原蛋白含量被量化为每个图像的红色面积。从Picrosirius染色的肺切片中的RGB图像的绿色通道用MATLAB软件进行了二进制，如先前报道的50，以量化浸润物。计数黑色像素，并显示密度为每个图像的像素计数。如前所述51,52确定肺损伤评分的计算。简而言之，两名盲目研究人员评估了牙槽和间质空间中白细胞流入的组织学证据的总和，蛋白质碎屑，透明膜的形成和肺泡间隔增厚，然后根据反射肺损伤的相关性加权变量。随后，将变量归一化为四个评估的葡萄球菌和曙红（H＆E）染色（Sigma-Aldrich）的肺部的肺切片，该肺部被SARS-COV-2或流感A/Puerto Rico/8/1934病毒感染的小鼠。

　　RNA分离后，根据制造商的说明，使用Quantseq 3'MRNA-Seq库预备试剂盒（Lexogen）使用100 ng总RNA进行库制备。之后，将样品在Novaseq 6000 Sequencer（Illumina）上进行测序，其单端读数为1×100 bp，平均覆盖率为1000万个原始读取。数据通过Qlucore软件（https://qlucore.com/）分析。

　　用异氟烷麻醉C57BL/6小鼠，并用5×103斑块形成单位（PFU）在50 µL PBS中进行50 µL PBS的5×103斑块形成单位（PFU），在第4天，第4天进行了分析。通过通过40 µM细胞滤网进行网状切丁的肺碎片获得肺匀浆，并将无细胞的上清液存储在-80°C下进行细胞因子分析。后来，将一块肺和肝组织放置在RNA中，并存储在-80°C下，以进行随后的RNA提取和QRT -PCR分析。

　　K18-HACE2小鼠用氯胺酮 - 健康嗪麻醉，并在第0天，在30 µL PBS中用60 µL PBS的60 PFU SARS-COV-2（临床分离式野生型菌株分离）在鼻内感染。小鼠在临床终点达到临床终点后，损失了比两天的临床终点20％或最初的启动重量的20％。在感染后的第8天，将小鼠安乐死，收集BALF，并去除肺部以进行进一步分析。将一块肺和肝组织放置在Trizol中，并在-80°C下储存，以进行随后的RNA提取和QRT -PCR分析。

　　将肺组织切成切，并用0.25 mg ml -1 liberase TL（Roche）和1 mg Ml -1 DNase I（Sigma）在37°C下消化1小时。使用37.5％的Percoll梯度进一步纯化了分离的肺细胞，然后用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。

　　分别使用Accu-Check Aviva（Roche）和自由式预选NEO H仪器（Abbott）测量血浆和肺匀浆中葡萄糖和BHB的浓度。

　　在含有2％胎儿小腿血清（FCS）（FACS缓冲液）的PBS中，用表面抗体和可固定的生存力染料（僵尸紫外线，Biolegend）染色30分钟，在人（Biolegend）或小鼠（Bioxcell）FC块的情况下，在4°C下染色。对于涉及细胞因子细胞内染色的实验，将T细胞刺激3 h（小鼠）和6 h（人），用佛波尔12-麦芽孢子13-乙酸盐（PMA; 50 ng ml-1）（Biogems）（Biogems）（Biogems）和离子菌素（1 µg mL-1）（1 µg mL-1）（Biogems）（biogems）（biogems）（1 µg mLG）（1-1-grugems a（1-grug groug）（1-grug groug and）（1-grug groug groug in a（1-grougems a）生物科学）。用FACS缓冲液洗涤细胞，然后根据制造商的说明用FOXP3固定/透化试剂盒（EBISOSCIENCE）固定，并在4°C下用细胞内抗体染色60分钟。

　　Single-cell suspension was stained with anti-CD16/32 (BioXcell, 1 mg ml−1, 1:100) and conjugated antibodies against any combination of the following surface antigens: CD4 (RM4.5, 1:400), CD8 (53-6.7, 1:400), CD45 (30-F11, 1:400), TCRβ (H57-597, 1:200)和PD-1（29F.1A12，1：200）。为了检查细胞因子和细胞增殖，使用了针对以下细胞内抗原的任何组合的共轭抗体：TNF（MP6-x122，1：200），IFNγ（XMG1.2，1：200）和KI-67（KI-67）（16a8，1：1：1,000）。

　　用人信任FCXTM（Biolegend，1：100）染色的细胞染色，以与以下表面抗原的任何组合结合：CD4（RPA-T4，1：200），CD8（SK1，1：200），CD45（HI30; 1：1：400）和PD-1（EH12.2H7; 1：1：200）。为了检查细胞因子和细胞增殖，使用了以下抗体：TNF（MAB11，1：200），IFNγ（4S.B3，1：200）和KI-67（Ki-67，1：400）。

　　分别使用磁性阳性选择与生物素人抗CD4或抗CD8抗体从PBMC中纯化CD4+ T细胞或CD8+ T细胞，然后与链霉亲和素偶联的磁微粒（Biolegend）和阳性选择孵育。使用抗CD4（RPA-T4，1：400）抗体和抗CD8（RPA-T8，1：400）抗体在BD LSRFortessA上通过流式细胞仪评估纯度。Cells were plated on 48-well plates, coated with anti-CD3 (1 μg ml−1) and anti-CD28 (10 μg ml ) antibodies, in RPMI medium or DMEM, supplemented with 10% FCS, penicillin, streptomycin, HEPES, glutamine, pyruvate, nonessential amino acids and β-mercaptoethanol diluted with PBS（1：1），在IL-2（10 ng ml-1，peprotech）和IL-12（10 ng ml-1，peprotech）（Th1条件）的情况下，有或没有氨基酸。人CD4+ T细胞培养物在第0、1和2天用5 mM NaCl或5 mM BHB补充，并在培养6天后收集。在Brefeldin a（1μgml -1）（Golgiplug，Biosciences）的存在下，用PMA（50 ng mL -1）（Biogems）和离子霉素（1 µg mL -1）（Biogems）刺激培养的细胞6小时，以固定固定（Zombie UV固定）（diviabiabie divia）用3.7％甲醛（Sigma）和0.1％NP-40透化，并染色用于细胞内细胞因子。

　　根据制造商的说明，使用磁性阴性选择试剂盒（Mojosort小鼠CD4 NAIVE T细胞分离试剂盒，Biolegend; CD8+ T细胞分离试剂盒，Miltenyi）从小鼠脾脏中纯化幼稚的CD4+ T细胞或CD8+ T细胞。使用抗小鼠CD4（RM4-5，1：400）和抗小鼠CD8（LY-3，1：400）抗体在BD LSRFORTESSA流式细胞仪上通过流式细胞仪评估纯度。Cells were plated on 48-well plates, coated with anti-CD3 (1 μg ml−1) and anti-CD28 (10 μg ml−1) antibodies, in RPMI medium supplemented with 10% FCS, penicillin, streptomycin, HEPES, glutamine, pyruvate, nonessential amino acids and β-mercaptoethanol diluted with PBS（1：1）在IL-12（3 ng ml-1，peprotech）的存在下（Th1条件）。在第0、1和2天，用5 mM NaCl或5 mM BHB补充培养物。在培养的第3和第6天收集小鼠CD4+ T细胞。通过僵尸UV固定活力染料（Biolegend）评估生存能力，并用PMA（50 ng mL -1）（BioGems）（Biogems）和离子霉素（1 µg ML -1）（1 µg ML -1）（1 µg MLG -MLG MLG）（Biogems）（Biipl -Elpipl el grugipl ins a（1 -gipl）（1 -g m fipl ins bd），通过细胞内细胞因子的染色来测量细胞因子的产生。生物科学）。将细胞染色以使其生存力和表面标记物用3.7％的甲醛（Sigma）固定，用0.1％NP-40透透，并染色用于细胞内细胞因子。

　　在培养中激活脾小鼠CD4+ T细胞三天。将细胞在无葡萄糖培养基中的37°C下用5 mm的C13标记的葡萄糖孵育3小时，或用5 mm的C13标记的BHB孵育12小时。培养后，将约200万细胞用无钙和无镁汉克的平衡盐溶液（HBSS）洗涤。液相色谱 - 质谱检测包括一步有机溶剂提取细胞，并在35分钟的循环中在1 mm×150 mm的Hilic特异性柱上分离。校正了靶向代谢物的同位素富集的天然丰度，并报告为m，m+1，m+2，m+3等（Masshunter Profinder软件）。提取，运行和最终分析是通过创意蛋白质组学完成的。

　　C57BL/6 mice were anaesthetized with isoflurane and infected intranasally with 5 × 103 PFU of IAV in 50 µl PBS on day 0. For the in vivo tracing experiment, 300 mM C13-labelled BHB (Eurisotop) was injected intraperitoneally for 20 min on day 7 before euthanizing the mice.将肺组织切成切，并用0.25 mg ml -1 liberase TL（Roche）和1 mg Ml -1 DNase I（Sigma）在37°C下消化20分钟。使用28％的Percoll梯度进一步纯化了分离的肺细胞，然后用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。根据制造商的说明，使用磁性阴性选择试剂盒（Mojosort小鼠CD4 T细胞分离试剂盒，Biolegend）纯化CD4+ T细胞。对于离体追踪实验，将从未处理小鼠分离的CD4+ T细胞在用C13标记的BHB的稀释培养基中进一步培养2小时。通过在BD LSRFTRESTESA上的流式细胞仪评估纯度和细胞死亡，并将细胞合并至每个样品总计1.5×106个细胞，用HBSS洗涤并重悬于甲醇中。通过气相色谱 - 质谱法（GC – MS）进行分析。

　　如前所述，制备样品并处理样品53。Cell pellets (1.0 or 1.5 × 106 cells) were mixed with 400 or 600 µl of a methanol and water mixture (1:1; v/v) and 200 or 300 µl chloroform and subsequently vortexed for 20 min at 1.200 rpm at 4 °C on a thermomixer (Eppendorf) and centrifuged (Eppendorf 5415R) at 17,000g for 5 min在4°C。将上极相（200 µL）转移到GC小瓶中，并在真空离心机（LabConco Corporation）中在4°C下蒸发至至少3小时。样品在线衍生并通过Gerstel多用途采样器自动制备。用15μl甲氧胺盐酸胺（Sigma-Aldrich）在吡啶（20 mg ml-1）中在55°C下进行30分钟进行衍生化，然后进行15μlN-甲基N-（tert-butylyldimethylsilyl）trifluoroacetamide（Machereynagel）（Macherey Nagel）的15μlN-甲基N-（Tert-Butyldimethylsilyl）。GC – MS测量在具有5977b MSD（Agilent Technologies）的7890B GC的合并设置上进行。在分析柱前（Agilent J＆W GC柱）的30米DB-35ms毛细管柱（内径，250 µm；膜，0.25 µm）和5米的Duraguard毛细管用于分离代谢物。将样品（1 µL）注入270°C的GC入口，并将氦气用作载气（流速为1 ml min -1）。将GC烤箱温度保持在80°C，持续6分钟，然后以每分钟6°C升高，直到达到280°C并保持10分钟。电子电离能将设置为70 eV。在230°C和150°C下分别设置了MS源的温度和四倍体的温度。Full scan (70–800 m/z, 3.9 scans per second) and with a second injection, selective ion chromatograms were recorded for lactate (261, 262, 263, 264, 265, 266, 267; 10 scans per second), citrate (591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600; 10 scans per第二），谷氨酸（432、433、434、435、436、437、437、438、439、440; 10扫描每秒），苹果（419、420、421、421、422、422、423、423、424、424、425、425、426; 10扫描 419、420、421、422、423、424、425;每秒10次扫描）。使用代谢轨道软件进行了原始MS数据处理，包括离子色谱反卷积，峰积分和自然存在同位素的校正。

　　For real-time measurement of the oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR), 2 × 105 in-vitro-polarized TH1 cells were washed with Seahorse XF RPMI medium (pH 7.4) supplemented with 5 mM glu​​cose (or without), 1 mM pyruvate, 2 mM glu​​tamine, 100 μg ml−1 linoleic or oleic acid and 5 mMNaCl或BHB。将四倍氧化物接种在聚赖氨酸（0.01％）预涂层的海马XF96细胞培养微层中，并在37°C下将板保持在非碳化孵化器中30分钟。使用Wave Desktop软件（Agilent）用XF96细胞外通量分析仪分析细胞。在基础条件下获得了三个或更多的连续测量，然后添加1.5μM寡霉素，该寡霉素抑制线粒体ATP合酶。1.5μMFCCP（羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯基氢氮酮），这使ATP合成不消耗氧气；以及0.5μm鱼藤酮和抗霉素A的组合，分别通过阻断复合物I和III抑制电子传输链。这些用于这些测定的所有化学物质均从Agilent获得。备用呼吸能力被计算为加入FCCP后基底OCR和最大OCR之间的差异。

　　Single-guide RNAs (sgRNAs) targeting human BDH1 (mC*mC*mG* rUrArC rUrGrC rArUrC rArCrC rArArG rUrUrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArA rUrArG rCrArA rGrUrU rArArA rArUrA rArGrG rCrUrA rGrUrC rCrGrU rUrArU rCrArA rCrUrUrGrArA rArArA rGrUrG rGrCrA rCrCrG rArGrU rCrGrG rUrGrC mU*mU*mU* rU) and mouse Bdh1 (mA*mC*mG* rCrArG rGrCrA rUrCrU rCrArA rCrGrU rUrUrG rUrUrU rUrArG rArGrC rUrArG rArArA rUrArG rCrArA rGrUrU rArArA rArUrArargrg rcrura rgrurc rcrgru ruraru rcruru rgrara rgrara rarara rgrurg rgrcra rgrcra rcrcrcrg rargru rcrgrg rurgrg mu*mu*mu*mu*mu*mu*ru）购自IDT（m，2'o-methyl base;*，磷酸基础；通过将1μLSGRNA（0.3nmolμl-1）与0.6μlAlt-R S.P Cas9核酸酶V3（10 mg ml-1; idt）孵育10分钟，在室温下孵育1μLSGRNA（0.3nmolμl-1），形成SGRNA – CAS9 RNP。将天真的CD4+ T细胞重悬于20μLP3缓冲液中（P3初级细胞4D-核对象X KIT S; Lonza），与SGRNA – CAS9 RNP混合，并使用LonZA 4D-核对象系统（用于人CD4+ T细胞和DN100的EO115）使用LonZA 4D-核对象系统（用于人类CD4+ T细胞的EO115）。将细胞在37°C下休息2小时，将细胞分开并转移到新板上，以5 mM NaCl或5 mMβHB的进一步处理。

　　为了抑制人T细胞中的Oxphos，使用浓度增加的烤面包酮，抗霉素A和寡霉素（10 nm，100 nm和1μM）分别阻断呼吸链中复合物I，III和V的活性。

　　对照饮食AIN 93G（17.6％蛋白质，7.1％脂肪和11％的糖）和生酮饮食TD.130659（15％蛋白质，72％脂肪和2.4％糖）购自SSNIFF。在感染IAV前一周，将小鼠放在生酮或对照饮食上，并在整个实验研究中维持这些实验饮食。

　　酮酯（-β-羟基丁酸 - （R）-1,3丁二醇单酯）是K. Clarke的礼物。从IAV或SARS-COV-2感染开始，在实验研究的持续时间内，从饮用水中补充了20 mg ML-1酮酯。

　　使用Trizol（Thermo Fisher Scientific）从纯化的T细胞或整个BALF细胞中提取RNA，并根据制造商的说明与还原套件（Thermo Fisher Scientific）进行反向转录。根据制造商的说明，使用Dynabeads mRNA直接试剂盒（Thermo Fisher Scientific）提取全肺或肝组织的RNA。该cDNA充当放大感兴趣基因的模板。为了分析表达的基因，Taqman对人IFNG，IFITM3，IFI27，IFI44L，IFIT1，IFIT1，MX1，ISG15，MX2，RSAD2和SIGLEC1，MOUSE NDUSF8，SDHA，SDHA，SDHB，SDHB，SDHC，SDHC，SDHC，SDHC，TXNRD1，fn1，fn1，fn1，got1，fn1，fn1，fn1，fn1，ccc1，ccc，使用MMP2和MMP12或病毒N1和N2（SARS-COV-2）（IDT）。使用以下引物通过基于SYBR绿色的QRT-PCR测定法对PB1（IAV）进行分析：正向：5'-ACACAACAAGGCCGACAGACCTA-3''及反向：5'-ATGCTGTGCTGTGTGCAGGGGGTGGTGGTGG-3'''和ACTB（QIIAGEN and ACTB（QIAGEN; QT0111111113672）通过QuantStudio实时PCR软件（Thermo Fisher Scientific）确定目标基因表达，并使用比较方法计算出对HPRT/HPRT或18S基因表达时相对定量的相对定量。使用以下引物通过基于SYBR绿色的QPCR对PB1（IAV）进行分析：正向：5'-ACACAAGGCCGACAGACCTA-3''和反向：5'-ATGCTTGCTGCAGCAGGGGGTGGTGGTGG-3''and ACTB（QIAGEN; QIAGEN; QT01136772）or nounderewecking Genee。

　　将小鼠和人类细胞在37°C，5％二氧化碳中孵育30分钟，然后在37°C下进行15分钟，5％CO2用对照，2-DG（100 mm; Sigma-Aldrich），寡霉素（1μm； Sigma-Aldrich）或两种药物组合。在37°C下添加嘌呤霉素（10μgml– 1; ABCAM）30分钟。如上所述，用原代抗体染色后，按照制造商的说明，使用FOXP3固定/透化试剂盒（EBISOSCIENCE）固定细胞并通透了透化。通过与抗puro单克隆抗体（1：1,000，Cclone Mabe343，Merck）孵育60分钟，在4°C中孵育蛋白毒素的细胞内染色。该协议是根据原始场景套件（http://www.scenith.com）和R.Argüello开发的协议进行了改编的。

　　使用Prism软件（GraphPad）分析数据。所有统计分析都使用了非参数单向方差分析（Kruskal – Wallis测试）或两尾学生的t检验：不显着（NS）P> 0.05；*p <0.05;** p <0.01;*** p <0.001;**** p <0.0001。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。