细胞系RPE1-htert（FLP-in）（来自P. jallepalli实验室的礼物），Caco-2（来自H. Clevers实验室的礼物），Hela，Hela（M. Vermeulen M. Vermeulen实验室的礼物），HT-29，HT-29，HT-29（H. Clevers的礼物，来自H. Clevers的礼物）在DMEM/F12和Glutamax补充剂（Gibco）中培养，补充了9％的胎牛血清（FBS，Sigma-Aldrich）和1％青霉素/链霉菌素（Sigma-Aldrich）。细胞系U2OS DAMID，U2OS CENPA和BJ-HERT（R. Medema实验室的礼物），HCT116（H. Clevers实验室的礼物）和HT1080在DMEM，高葡萄糖谷氨酸葡萄糖补充剂（Gibco）中培养，并补充10％FBS和1％consirin/contercin和1％consirin/contect。如前所述，人类的小肠十二指肠和回肠器官（来自H. Clevers实验室的礼物）进行了培养51。使用Wnt替代介质而不是Wnt条件培养基（0.15 nm，U蛋白Express）。DLD1细胞（来自D. cimini的礼物）在RPMI和Glutamax补充剂（Gibco）中培养，并补充了9％FBS和50μgml -1 Penicillin/链霉菌素。为了产生RPE1-HERT FLP-IN H2B-MNEON细胞，用含有H2B-MNEON-MEN-MEN-IRES-PUROMYCIN构建体的慢跑病毒转导细胞。选择10μgml– 1紫霉素（Sigma-Aldrich）进行48小时。没有选择的相同构造转导器官。通过用62.5 nm CPD-5的原始RPE1-htert细胞处理每7天48小时，在4周中，将四倍体RPE1-htert细胞产生，此后四倍体菌落越来越多22周。单克隆RPE1-HETT DCAS9-3×GFP和DLD1 DCAS9-GFP-3×FKBP FRB-MCHERRY-LAMINB1系列通过DCAS9-3×GFP或DCAS9-GFP或DCAS9-GFP-3-3×FKBP Lentivirus的转导产生。接下来，在DLD1细胞中引入了FRB-MCHERRY-LAMINB1。HT1080细胞，该细胞包含11号染色体中的laco-array （来自W. Bickmore的礼物）用LACI-GFP-FKBP和FRB-MCHERRY-LAMINB1转导，并用单细胞分类克隆。测试细胞系的支原体污染，未经认证。

　　将RPE1-HERT FLP-IN细胞铺在40％汇合的六孔板（康宁）中，并用palbociclib（250 nm; Selleck Chemicals）处理。24小时后，用温暖的培养基洗涤细胞3次，并用RO-3306（5μM； Tocris Bioscience）处理。16小时后，将细胞用含有DMSO，CPD-5（62.5 nm; R. Medema的礼物）或Monastrol（200μM； Sigma-Aldrich）的温暖培养基在37°C的37°C洗涤3次。收获前将CPD-5处理的细胞再培养4小时。用含有62.5 nm CPD-5的温培养基洗涤单骨处理的细胞3次。通过摇动收集有丝分裂细胞，并将其在六孔板的新井中镀淀粉4小时。将BJ-HERT细胞以40％融合的六孔板将其铺在六孔板中，并用31.25 nm CPD-5处理16小时。所有细胞均被胰蛋白酶胰蛋白酶和储存在-20°C下以进行进一步加工。如先前所述，对RPE1-HERT FLP-IN细胞的单个G1核或BJ-HERT细胞的单核进行了排序。在处理前1天将人肠癌用5μMZM447439（Selleck Chemicals）或10μMEDU（Thermofisher）进行3小时，持续3次，用温暖的培养基孵育3次，用62.5 nm CPD-5孵育16小时，并使用70％冰质纤维乙醇固定。通过用PBS洗涤一次将乙醇除去乙醇，并将细胞与Click-It反应鸡尾酒（Click-It Edu扩散测定法）一起孵育10分钟。将反应鸡尾酒洗掉，并用PBS/DAPI混合物代替。在ZM447439或EDU阳性G1细胞的情况下，将单个G1核分为384孔板。将四倍体RPE1-htert细胞以40％的汇合度铺板，并用62.5 nm CPD-5处理24小时。分类G1核。如RPE1-HTERT细胞所述，使用monastrol使用monastrol同步HCT116细胞16小时，并用CPD-5进行处理。将板存储在-20°C下。如前所述进行了基于Nlaiii的库准备 有几个修改8。将细胞裂解在55°C下用8 mg ml – 1蛋白酶K（Fisher Scientific）在1倍切割（新英格兰生物群）中进行，并在80°C下进行10分钟。在1×T4 DNA连接缓冲液（新England Biolabs）中，用100 nm的100 nm条形码，双链的Nlaiii适配器和400 nl的圆环NLAIII适配器（新英格兰Biolabs）连接适配器，并补充了3 mm ATP（Invitrrogen），在16°C中补充了1×T4 DNA连接缓冲液（新England Biolabs）。分别以1×75或1×100碱基对（BP）分别在Illumina NextSeq500或2000上测序样品。测序后，手动确定了整个染色体和部分染色体的绘图（bwa aln 0.7.12和Python 2.7.5）和Aneufinder（V.1.2.0）的绘图和副本编号变化。人类肠癌的8染色体没有被量化，因为该染色体在对照条件下是异质性的。

　　将细胞铺在12毫米的圆玻璃盖玻片上（Marienfeld上级）。为了验证SCKARYO-SEQ分离误差偏置，如上所述将细胞同步并用CPD-5处理。从RO-3306释放后45分钟固定细胞，用75％甲醇和25％乙酸在-20°C下固定细胞。为了确定染色体与细胞核中心的距离，将细胞在固定前1天铺路。为了确定单轴处理的有丝分裂细胞的核染色体区域，如上所述同步细胞并在单骨中孵育4小时，然后固定。固定后，将盖玻片在室温下用2×盐酸盐（SSC）孵育2分钟。将盖玻片串联以70％，85％和100％乙醇和气干洗涤。接下来，将1.2μl的红色和绿色卫星枚举探针（Cytocell）和1.6μl的每盖杂交溶液在载玻片上发现。将盖玻片倒置在探针溶液上，并在75°C下孵育2分钟。将盖玻片在室温下孵育4-16小时，然后在72°C下与0.25×SSC（pH 7.0）孵育2分钟。在室温下用2×SSC 0.5％TWEEN-20洗涤盖玻片30 s，并用DAPI孵育，并使用延长金抗抗FANTIFADE（分子探针）安装。

　　图像采集是在Deltavision RT系统（Applied Precision/GE Healthcare）上进行的，该系统以0.5μm的间隔为Z-stacks×1.40/100/100数值孔径（Na）uplansapo物镜（OLYMPU）。对于反卷积，使用软沃尔克斯（Applied Precision/GE Healthcare，v.6.5.2）。使用Fiji ImageJ（V.2.0.0）进行图像分析和定量。

　　通过计算错误分离的鱼类阳性染色体的数量并将其除以错误分离的染色体的总数来确定鱼类分离误差频率。

　　当鱼阳性染色体与中期板物理分离时，低剂量诺科唑中的染色体被认为是未对准的。然后将该数字除以鱼阳性染色体的总数。

　　为了测量染色体与细胞核中心的距离，我们确定了三种不同阈值通道（DAPI，红探针和绿色探针）的质心X和Y坐标。使用自定义ImageJ脚本确定了单轴处理的细胞中心，该脚本测量了阈值DAPI颗粒的质量中心。

　　到了有丝分裂阶段，将RPE1-HERT FLP-IN H2B-MNEON细胞铺在黑色的玻璃底，96孔板（CORNING）的40％汇合度中，并如Sckaryo-Seq所述同步。用×0.75/20 na干燥物镜透镜（Nikon）在Andor CSU-W1旋转盘（50 µM磁盘）上成像。使用488 nm激光进行样品激发，过滤器在540至50 nm带通供发射。使用Andor IXON-888 EMCCD摄像头获取图像。每1分钟将9个Z线成2μm。在广泛的染色体运动之前，NEBD被定义为一个框架。使用NIS元素（Nikon，V.5.30.04）获取图像。

　　为了确定从冷凝水到后期发作和隔离误差的时间，我们使用了配备了Zyla 4.2MPX SCMOS摄像机（Andor）和×1.3/40 NA机油物镜（Nikon）的Nikon Ti-E电动显微镜。使用Spectra X LED照明系统（Lumencor）和Chroma-ET过滤器组进行荧光激发。每4分钟将9个Z线成2μm，持续4小时。相同的视频也用于确定细胞存活。

　　为了检查Mn-Seq的细胞存活，将RPE1-HERT FLP-IN和BJ-HERT细胞以40％的汇合为单位。在用于测定分离误差的相同显微镜上成像细胞。DIC和A×0.45/10 Na物镜（Nikon）每3-5分钟可视化细胞16小时。

　　如先前所述，对人肠癌进行成像。8。

　　为了确定用低剂量诺科唑处理的细胞中的错误分离，将RPE1-HTERT H2B-EYFP细胞在成像前1天以40％汇合的状态进行铺板。接下来，用Nocodazole（48 nm; Sigma-Aldrich）处理细胞，并在Andor CSU-W1旋转盘（50 µM磁盘）上成像，并用×1.45/100 NA机油物镜（Nikon）进行了成像。488 nm激光用于样品激发和540至50 nm带通滤波器进行发射。使用Andor IXON-888 EMCCD摄像头获取图像。每3分钟将9个Z线成2μm。

　　To compare the behaviour of polar and non-polar chromosomes, RPE1-hTERT cells stably expressing both CENPA-GFP and Centrin1-GFP (a gift from A. Khodjakov) were imaged on the Expert Line easy3D STED microscope system (Abberior Instruments) using Prairie View (5.4.64.500) and Imspector (Abberior Instruments, v.16.3) with 485 and640 nm激光器使用×60/1.2 UPLSAPO 60×W水物镜（Olympus）和雪崩光电二极管（APD）检测器。添加了低剂量（1：100,000）间谍595-DNA，以检测核包膜分解的时刻，而添加了低剂量（1：50,000）间谍640-微管蛋白（Spirochrome，ag）以区分POLES和动力学，并在Centrin1信号无法轻松地检测到特定特定框架时启用Pole pole tracking，并启用杆子跟踪。每20 s服用六个z链1μm。核包膜崩溃后，立即手动绘制核的边缘，以通过将核分为三个均等的同心区域来确定轨道染色体的相对核位置。如果染色体居住在两个最内向的贝壳中或接触第二多数外环，则将其视为中心。还确定了两个中心体的位置。每个动力学对以最大强度投影手动跟随。在斐济（V.1.53F51/1.53S30/1.53R）以及Imaris 3D Viewer（v.9.8.0）中，在Z-stack的单个Z-stack（v.1.53F51/1.53S30/1.53R）的单个Z-stack（V.1.53F51/1.53S30/1.53R）中还验证了动力学对的位置和轨迹。从同一细胞中选择了一对具有与中期板相同距离的极性和非极性外周染色体。

　　用稳定表达CENPA-GFP，MCHERRY-α-微管蛋白和光活性GFP-α-微管蛋白的U2OS细胞系（来自M. Barisic M. Barisic和H. Maiato的礼物）进行U2OS动力学跟踪实验。如前所述52，使用Bruker Opterra I多点扫描共聚焦显微镜系统对细胞进行成像。以1μm间距为15片的Z堆栈以1分钟的间隔进行图像采集。当Prometaphase纺锤的伸长峰达到峰时，未对齐的动力学包括从中期板中排出的所有动力学对，这被定义为两个中心体的分离表明两个连续帧>1μm的纺锤长度持续增加。如前所述53，使用低光跟踪工具（v.0.10）（v.0.10）（v.0.10）在每个时间范围内提取未对齐的动物学的空间X和Y坐标，如前所述53。在单个成像Z平面上进行了X和Y平面中动力学的跟踪。在所有框架中都无法成功跟踪未对齐的动型对的10–15％，这主要是由于细胞和主轴运动随着时间的推移而导致的。手动跟踪主轴杆，将点放在极点结构的中心，在Z平面中，其中微管蛋白信号最高。对齐的动力学对在二维中手动跟踪。使用3D Imaris查看器，将NEBD框架中的所有未对齐对均仔细检查为“主轴杆后面”。滞后的染色体被定义为单个动力学，在早期后期期间的动力学分离质量之间被卡住并伸展。染色体桥包括具有良好分离的动力学对的细胞，但在早期后期期间保持了动脉化合物的分离质量。未对准包括在后期期间在极点至少有一对动力学的细胞， 并且“无误差”表型被定义为没有上述表型的细胞。分析中未包括多极细胞（190中的一个）。使用定制MATLAB（MATLABR2021A 9.10.0）脚本对所有参数进行定量分析。

　　为了实时跟踪单个染色体，用含有单个螺旋的RNA靶向1染色体1（ATGCTCACCT）和9（TGGAATGAATGGAATGGAATGGAATGGAA）的​​慢病毒（TGCTCACCT）（ATGCTCACCT）（ATGCTCACCT）（atgctCacct）转导RPE1-HERT DCAS9-3×GFP。转导后24小时，将细胞以50％汇合的光学质量，塑料，八片载玻片（IBIDI）铺板。16小时后，将异步有丝分裂细胞用62.5 nm CPD-5处理，并在Zeiss细胞观察者显微镜上使用×1.4/40 Na机油平面型焦点透镜立即成像，配备有AxioImager Z1支架，Hamamatsu orca-Flash 4.0摄像头和Colibri 7 LED LED LED。每2.5分钟获取4.2小时的图像。随后使用ZEN软件（Zeiss，v.3.3）对视频进行处理和分析。

　　如前所述，在旋转盘系统上进行了9个跟踪和绑扎实验，并进行了几种适应。在DLD1细胞成像之前，添加了500 nm Rapalog（Takara），并在成像之前立即添加62.5 nm CPD-5。我们使用×1.20/60 NA水相浸入油镜，每3分钟对16 Z线进行1μm的成像。

　　在5％CO2中，将细胞在37°C下成像，以进行所有成像实验。

　　将RPE1-HERT FLP-IN细胞以40％汇合的六孔板将其铺在六孔板中，并用CPD-5或Nocodazole处理16小时。癌细胞系以类似的方式铺板，但未用任何药物处理。FACS的准备与以前描述的方法相似33。简而言之，将细胞与PBS/2％FBS和12.5μgml -1 EMA（热泡）在光线下在冰上孵育30分钟。使用PBS将EMA洗涤四次，并从具有相同的核染色缓冲液的细胞中收集（微）核。将EMA阴性和HOECHST阳性（微）核在包含矿物油的PCR带中分类，并存储在-20°C下以进行进一步加工。图书馆的准备与SCKARYO-SEQ相似，但进行了几次修改。每5μL分类的（微）核与5μl裂解缓冲液（最终浓度，0.02 U蛋白酶KμL -1（NEB）在1倍切割剂缓冲液（NEB）中）在55°C和80°C下的10分钟。通过将（最终浓度，0.5 unlaiiiμl -1（新英格兰biolabs）在1×切割玛丽特缓冲液中）在37°C下孵育（最终浓度，0.5 u nlaiiiμl -1（新英格兰生物群），在37°C下孵育（最终浓度为0.5 u nlaiiiμl -1），在37°C下，在37°C下，在65°C下在65°C下，在37°C下，在65°C下，在65°C下，在37°C下孵育2 h，在65°C下，在37°C下孵育2 h，在65°C下孵育2 h，从而消化了基因组DNA。随后通过添加20μL的连接混合物（最终浓度为20Uμl -1 T4 DNA Ligase（New England Biolabs），0.5 mM ATP（热泡）和25 nm的适配器，在0.5×T4 DNA Ligase Buffers（New Grouds）中，将ligriation（新英格兰生物脂蛋白）（新英格兰生物ATP）（新英格兰生物脂蛋白）（新英格兰生物片）（新英格兰生物ATP）（新英格兰生物脂蛋白）（新英格兰生物脂蛋白）（新英格兰生物片）与New Grouds（New Grouds in Ind in New Indland incrigation in Inccience）如SCKARYO-SEQ所述进行的剩余图书馆制备，测序和分析。染色体分为三本。

　　U2OS DAMID测序数据是从稳定表达大坝laminb1或不固定的DAM蛋白的克隆细胞系中产生的。通过转染DAM-LaminB1或DAM构建体（克隆到Pptuner IRES2载体（Clontech，Takara）），通过转染DAM-LaminB1或DAM构建体来得出来自Shield1诱导的DAMID U2OS细胞的DAMID数据，具有500 µg ML – ML – 1 G418（g418（Gibco））以及随后的单元细胞种群的抗生素耐药性选择。如前所述，选择合适的克隆的选择是基于已知的LAD或ILAD基因组区域的甲基化浓度，如先前所述54，通过基于MBOI的PCR和DAMID测量。大坝蛋白的稳定化是通过在500 nm的终浓度下在细胞培养基中添加Shield1配体（Aobious）在细胞收集前18-24小时来实现的。如先前所述54进行了多重DAMID，并在Illumina NextSeq 500平台（1×50 bp）上进行了测序。原始读取被其图书馆特异性索引和样品特异性的DAMID条形码，Universal Damid适配器序列与CustAdapt（v.1.16）修剪，并使用Bowtie2（v.2.3.4）对准基因组HG19。计数到注释的GATC位点的读取图并在100 kb的基因组箱中进行了汇总。如前所述55进行了观察到的超过每个箱预期值的计算。

　　使用GraphPad Prism软件（V.8.4.3）进行统计分析。超级图在每种颜色代表复制的许多图中都使用，小点单个测量值和大点的平均值。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。