Bloodstream形式的Brucei Lister 427，P10和N50（参考文献35），2T1T7（参考文献40）和2T1T7 Cas9 Cas9锥虫及其衍生物在37°C和5％CO2中维持在HMI-11的HMI-11中，含有10％的胎儿Calf Calf Calf Calum Calum Calum Calum Calum和适当的药物41。细胞保持在每毫升2.0×106个细胞以下。如先前所述42，对细胞进行电穿孔。2T1T7 CAS9细胞系是通过用PRPACAS9质粒转染2T1T7细胞生成的，该细胞将其集成到标记的核糖体DNA（rDNA）间隔区域40中。用1 µg ML -1强力霉素诱导Cas9表达。对于SL-SMART-SEQ3XPRESS切换测定法，在整个时间过程中都保持了CAS9感应。为了在诱导DSB后产生VSG切换细胞的克隆种群，将诱导的种群稀释至HMI-11中的每ML 8-10个细胞，并在100 µl体积的96孔板的孔中散布。将板持续5天，以使细胞恢复。用贝克曼·库尔特细胞计数器计数细胞。

　　根据制造商的说明，使用Nucleospin RNA试剂盒（Macherey＆Nagel）从5.0×106个细胞中提取RNA。RNA存储在-80°C下。根据制造商的指示，使用上标II逆转录酶（Invitrogen）（Invitrogen）和12-18底漆从5 µg提取的RNA合成第一链cDNA。第一链cDNA存储在-20°C下。PCR使用特定于SL序列（5'-GACTAGTTTCTGTACTAT-3'）的前启动器从第一个链cDNA和一个反向引物（5'-CCCGGGTACCGTGTGTGTGTGTGTGTTAAAAAAAAAAATATC-3''）的反向引物从PCR上放大了表达的VSG转录本。对于每个PCR反应，使用1 µL的1:50稀释的第一链cDNA。根据制造商的说明，使用Nucleospin凝胶和PCR清洁套件（Macherey＆Nagel）从琼脂糖中纯化了琼脂糖的VSG扩增子，可视化PCR产物。使用VSG扩增PCR中使用的任何一个引物，通过Eurofins基因组学对至少100 ng纯化的PCR产物进行了Sanger测序。

　　使用lister 427 2018基因组组装（参考文献10，https：//tritrypdb.org/）用Protospacer WorkBench44（V.0.1.0 beta）设计SGRNA目标序列作为参考数据库，并优化用于SPCAS9。根据其Bowtie评分（脱靶Cas9活性的度量）和Doench-root-Activity评分（SGRNA活性的度量）选择SGRNA目标序列。如参考文献中所述。43，将“ AGGG”添加到正向引物序列中，而“ CAAA”添加到反向引物序列中，以创建BBSI克隆位点。如前所述，将目标序列克隆到PT7SGRNA质粒中，并转染到2T1T7 Cas9细胞系中。43。PT7SGRNA质粒整合到随机的rDNA间隔区域中。

　　将来自2.0×106个细胞的总蛋白质提取物在1×裂解缓冲液中煮沸（1：3 4×Laemmli：1×Ripa，2 mM Dithiothreitol（dtt），1％β-莫碱乙醇），并在12.5％SDS-PAGE-PAGE-PAGE GEL上分离。根据制造商的说明，使用生物RAD MINI TRANS印迹细胞将分离的蛋白转移到甲醇平衡的PVDF（聚乙烯基二氟乙烯）膜上。为了可视化转移的蛋白质，用0.5％amido黑色溶液（在10％乙酸中）染色膜。用1倍的销毁溶液（25％异丙醇，10％乙酸）进行破坏。在阻塞之前，根据预先的蛋白梯子将印迹的PVDF膜切成三个：用于检测SPCAS9的70 kDa以上，在70至25 kDa之间，用于检测EF1α载荷控制和低于25 kDa的γH2A检测。在室温下，CAS9和EF1-α印迹在5％的牛奶/PBS-T中被阻塞，γH2A印迹在3％BSA/PBS-T中被阻塞。将膜用1×PBS-T洗涤3次，并在4°C下过夜进行一抗孵育。在以下稀释液中使用了主要抗体：抗Cas9（1：1,000牛奶/pbs-T，活性基序，克隆7A9-3A3）；抗EF1α（1％牛奶/PBS-T中的1：20,000，EMD Millipore Corporation，Clone CBP-KK1）和抗γH2A（来自L. Glover，Institut Pasteur）（1：200 in 1％牛奶/PBS-T）。在用PBS-T洗涤膜三次后，使用了以下辣根过氧化物酶偶联的二抗：对于Cas9，抗小鼠（1：10,000 intim抗小鼠，1％牛奶PBS-T，GE Healthcare，代码NA931V）；对于γH2A，抗兔（1％牛奶/PBS-T，GE Healthcare，Code Na934v）和EF1-α，抗小鼠（1：10,000 in na934v）（1：10,000 in 1％牛奶/PBS-T，GE Healthcare，Code NA931V）。继发孵育后，将膜用PBS-T洗涤3次，并再次用PBS洗涤。对于信号检测， 根据制造商的说明，使用了Immobilon Western化学发光辣根过氧化物酶底物。该信号在Chemidoc MP成像系统上可视化（V.3.0.1.14）。

　　如先前报道的45，对γH2A表达进行了免疫荧光分析。每个样品分析至少250个细胞。使用Leica DMI8倒荧光显微镜以Leica Application Suite X（LAS X）软件（v.3.7.6）获取图像，并使用斐济（V.2.0）处理。

　　对活细胞进行了VSG-2表达的荧光激活细胞分选（FACS）分析，因此在4°C下进行所有步骤，以防止VSG-2抗体的内在化。细胞在分析前立即染色。对于每个重复，通过离心收集1.0×106个细胞，并与荧光偶联的抗VSG-2（参考文献46）在黑暗中稀释1：500。将细胞用1×TDB洗涤3次，并重悬于400 µL的1×TDB中。用1 µg mL -1碘化丙啶染色细胞，以鉴定死细胞。在FACS CANTO（BD Biosciences）上处理样品，并捕获10,000个事件。使用FCS Express软件（v.7）处理数据。将门应用于去除细胞碎片（FSC-A与SSC-A）并删除双重功能（FSC-A与FSC-H）。

　　将单个细胞分为384孔板，以使用FACS Fusion II细胞分选仪（BD Biosciences）和安全柜内的100 µm喷嘴，以通过流式细胞仪制备SL-Smart-Seq3xpress文库。在收集细胞之前，根据制造商的方案对分类器进行校准，以减少分类之前的时间单元，从而减少细胞死亡。安装了一个384孔板适配器，并预先填充到4°C。通过将空液滴排序到每个盘子之前，通过将空液滴排序到盖上的384孔板上，可以在视觉上进行正确的液滴定位。接下来，通过在4°C下离心收集5.0×106个细胞，并在无菌过滤的冰冷1×TDB中洗涤两次。将细胞重悬于1 ml冰冷的1×TDB中，用1 µg ml-1碘化丙啶染色，并立即将其带到冰上的魔术器上。如上所述，将种群门控以去除细胞碎片，双重和死细胞。由于我们紧密的门控策略（扩展数据图7），我们可能富含G1中的细胞，并排除G2中的较大细胞。用裂解缓冲液制备的板在分类之前立即分别解冻并放置在预先冷的适配器中。使用“单细胞”纯度选项对单个细胞进行排序，并将板立即用铝箔密封，然后在-80°C的长期存储之前移至干冰。在图书馆准备之前，排序的板未存储超过1个月。

　　从标准的ERCC RNA SPIKE-IN组成的92个序列中，选择了10个尺寸约500 nt和大约50％G+C含量的10个，并从IDT订购了合成的SPIKE-IN DNA片段，为克隆添加了一个同源区域，用于Cloning，T7启动子序列和5'Entology and sl序列的SL序列，并在5'和一个同源区域上用于3英寸的End n'。将这些片段克隆到使用Saci和Bamhi（Neb）消化的PBSIIKS+质粒中，并使用输注（Takara）转化为恒星细胞。然后提取质粒，用BAMHI线性化，并根据建议的程序，使用NEB的Hiscribe T7 Arca mRNA试剂盒（带有尾巴）进行多腺苷酸化。将从十个尖峰序列中的每个序列中的每个中获得的RNA混合，并产生尖峰混合物的等分试样稀释，并将其存储在-80°C下，直到使用。使用Biopython（v.1.81）模块使用Python（v.3.10.8）脚本生成基于SPIKE-IN FASTA文件的注释。

　　所有步骤均使用无RNase无RNase试剂，并定期用RNASEZAP（Sigma）处理所有表面。384孔板的每个孔都使用Integra Assist Plus Optetting机器人填充3 µL每井硅油（Sigma）。将板用粘合剂PCR板密封密封，并短暂离心以在井底收集液体。到每个井，0.3 µL裂解缓冲液（0.1％TX-100，6.67％W/V PEG8000，0.0417 µm寡素（DT）（5'-抗蛋白素-Agagacagatgcgcaatg [n8] [t30] [t30] vn-3'），0.67 mm的dntp，0.4 u lim and-inbise and-inmib ins in in-in-llim and-inbies in ground in in in in in in in in in in in in in in in-in lyl-lly-lly-inm in ground（使用i.dot液体分配器（Cytena）添加1,364个转录本）。将板短暂离心，放在冰上并带到细胞分落者。如上所述，将单个细胞分类到每个孔中。

　　对于裂解细胞，将反应板解冻，离心并在72°C下孵育10分钟。对于每个井，0.1 µl的逆转录混合物（100 mM Tris-HCl PH 8.3，120 mm NaCl，10 mM MGCl2，32 mM DTT，0.25 U µl-1 RNase抑制剂和8 U µL-1 Maxima H-Minus逆转录酶的82 maxima plate and in I.在85°C下反应失活5分钟。Immediately following the reverse transcription reaction, the reaction plate was centrifuged and 0.6 µl of PCR amplification mix (1.67× SeqAmp PCR buffer, 0.042 U µl−1 SeqAmp polymerase, 0.83 µM SL primer: 5′-CTAACGCTATTATTAGAACAGTTTCTGT*A*C*-3′, and 0.83 µM Reverse primer:使用i.dot液体分配器将5'-GTCTCGTGGCGTGCGTCGGTGCGGATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCATTGTAGG-3'添加到每个孔中。在以下条件下进行PCR反应：95°C持续1分钟，16个循环（98°C 10 s，65°C，30 s，68°C 4分钟），72°C 10分钟。反应后，将PCR板离心，然后通过在板的每个孔中添加9 µL DH2O来稀释放大cDNA。如果没有立即使用，则将板存储在-20°C下，直到下一步。

　　在新的384孔板的每个孔中，使用Integra移液机器人加入1 µL每个易感的cDNA。在每个井时，加入了1 µL的标记混合物（10 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM MGCL2、5％DMF，0.002 µL TDE1），并在55°C下孵育10分钟。为了停止反应，立即将0.5 µL的0.2％SDS添加到每个孔中。将板离心并在室温下孵育5分钟。从每个井产生的单个文库用Illumina i5（5'-aatgatacggcgacgccacccaCgagatCtacac [8 bp index] tcgtcggcggcgcgtc-3'）和i7索引引物对双重索引。对于每种索引引物，将0.5 µl（2.2 µm）与1.5 µl PCR混合物（3.33×3.33×Phusion HF缓冲液，每个DNTP的0.67 mm，Tween-20 0.083％，0.033 U µL-1 phusion -1 phusion HF DNA Polymase）分配到每个反应孔中。对于图3E（右）中显示的测序文库，量为以下：每种索引引物的0.8 µl（2.2 µm）和3.9 µL PCR混合物，最终反应体积为8 µl。在以下条件下进行PCR反应：72°C持续3分钟，95°C 30 s，14个循环（95°C持续10 s，55°C，30 s，72°C 1分钟），72°C，持续5分钟。通过将放置在200克定制的三维印刷板支架中的板上离心30 s，将所有井中的反应量汇总到机器人储层（Nalgene，Thermo Scientific）中。使用Ampure XP珠以1：0.7的比例纯化合并的库。在45 µL DH2O的总体积中从珠子中洗脱了库。为了进一步降低游离无缘适配器的浓度，在4％的非换一个页面凝胶上运行库，并根据标准的聚丙烯酰胺凝胶纯化协议进行纯化。在NextSeq 1000测序平台上对库进行了测序，以产​​生101 nt（cDNA读取）和19 nt（TAG+UMI读取）的配对末端读数，而索引读数为8 nt。

　　在收集文库制备之前，建立了N50和P10细胞的培养物29和保持为0.5–1.0×106个细胞。通过将相等数量的N50和P10细胞组合在一起来制备混合种群样本。通过以400g离心10分钟收集混合细胞，在补充1％葡萄糖和0.04％BSA的冰冷的1×PBS中洗涤两次，并重悬于1 mL的缓冲液中。然后用35 µM细胞过滤器（康宁）过滤细胞，并调节至每µL 1,000个细胞。使用下一个GEM单细胞5'GEM KIT V.2（10XGENOMICS）制备库，并在NextSeq 1000平台上测序，每个单元格的深度约为50,000。生成了26 NT（读取1）和122 NT（读取2）以及10-NT索引读数的配对末端读数。

　　将包含索引的两个读数（每个）和标签+UMI（19 nt）串联为35 nt读取。使用castadapt47（v.4.3）滤除了包含cDNA读取中的标签序列（或其反向补体）的文物读取。使用SEQTK（v.1.4）“示例”功能（https://github.com/lh3/seqtk）完成了方法基准测试的读数。用Starsolo48,49（Star v.2.7.10a）映射读数，以结合T. Brucei Lister 427应变基因组（TB427V11，Ref。5）和Spike-In序列的混合Fasta文件，并产生转录本计数矩阵矩阵和一个比对（BAM）文件。然后，使用索引跳过过滤管线SCSWITCHFILTER（在下一节中进行描述）纠正计数矩阵，使用BAM文件作为输入。

　　scswitchfilter（https://github.com/colomemaria/scswitchfilter）使用RAW BAM文件而不是Count Matrix50纠正在多重测序库中跳跃的索引。校正过程涉及三个主要步骤：（1）BAM到SAM转换；（2）读取提取和解析以及（3）负校正计数矩阵计算。在第一步中，管道使用Samtools51（v.1.17）将BAM文件转换为SAM文件。在步骤2中，使用快速的bash脚本从SAM文件中提取和解析有效读取，选择使用单元格代码，UMI条形码和Gene Nametags进行选择读取，以及分裂的单元格代码标签，以进行后续分析。然后，将所选的读取符合单个.TSV文件。根据测序实验（运行）中板的数量（单个库），该脚本可以将细胞条形码标签拆分为板– library-i5-i7或i5-i7条形码组合。在步骤3中，Scswitchfilter计算了开关索引的读数，假设UMI条形码，基因名称和一个索引的组合可能性低。在具有切换指数的人中，读取的总数超过80％（默认阈值）仍然没有过滤。该工具生成一个残基计数矩阵，该矩阵应从初始计数矩阵中减去以获得过滤的计数矩阵。

　　使用以下模块使用ipython（v.7.31）使用jupyterlab（v.4）笔记本处理计数矩阵：和Seaborn（V.0.12.2）。检测到少于500个基因的细胞，过滤了1,000个基因UMI转录物计数和50个尖峰-IN UMI计数。对于基因表达分析，通过峰值计数将每个细胞的转录计数归一化。为了定量表达每个VSG的单元格，我们将一个单元定义为表达给定VSG，如果转录物计数该VSG代表该单元中所有VSG的转录物计数的80％以上。如果没有VSG达到这个阈值，我们将该单元定义为“没有主导VSG”。最终数字是用GraphPad Prism（V.9）创建的。

　　对于Smart-Seq2和Sl-Smart-Seq3Xpress数据，对读取进行了次采样以匹配铬10倍的平均每个细胞的读数（Briggs等人的每个单元格大约75,000个读数为26，而每个细胞的读数约为100,000个细胞，则该研究的铬10x数据读取了大约100,000个。所有测序数据均用具有相同设置的Starsolo映射。为了进行灵敏度比较，转录端坐标注释被扩展到下一个转录本的开始，与Briggs等人使用的条件匹配。使用带有Perl-Bioperl（V.1.7.8）模块的Perl（v.5.32.1）脚本。为了进行特异性比较，将检测到基因的细胞，总成绩单计数或总VSG转录本计数低于细胞中位数的一半以下。此外，仅考虑了超过十个VSG UMI计数的细胞。

　　使用特定于单元格的单元格编码：z属性（存储索引和标记序列）从starsolo输出BAM文件中提取单细胞BAM文件，以在BAM文件中读取。仅考虑从0 h，96 h和10天的诱导后时间点具有显性VSG的细胞。使用DeepTools52（v.3.5.4）BAMCoverage函数为每个单个单元生成覆盖范围文件（Bigwig文件），并具有“ - normalizeused rpkm”和“ - minmappingquality 10”选项。使用PygenoMetracks53（v.3.8）绘制覆盖轨道。为了确定开关类型（重组或转录）以及在BES1中的转录信号终端位置的识别，以及在BES中的转录信号的开始，最初在bes中位于新现有VSG的位置，最初在综合基因组视图（IGV）54（v.2.2.16.0）中对单细胞覆盖轨道进行了视觉检查。

　　通过BLAST（V.2.14.0）鉴定了TritryPDB55中的Lister 427基因组组装的VSG-2，VSG-8和VSG-11的同源物。将大于1,000的BITSCORE的命中被选为高度相似的同源物和推定的“供体”，以进行分段基因转换。对于VSG-2，VSG-8和VSG-11，分别有零命中，五次命中和1次符合此标准。

　　使用默认设置的DEML56（v.1.1.13）将FASTQ文件通过DEML56（v.1.1.13）的单细胞FASTQ文件进行了反复。然后为每个单个单元使用Trinity57（v.2.15.1）生成从头转录物组件，将输出限制为大于1 kb的重叠群。为了确定哪些组装转录本为活性VSG，将从头组装的重叠群与Blast58（v.2.14.0）与VSG-8对齐，并使用Python（V.3.10.8）脚本（V.3.10.8）和Rebeaded sequens（V.3.10.8）（V.3.10.8）seequess（V.3.10.8）（V.3.10.8）提取具有高相似性的重叠群（BITSCORE大于2,000）。那些没有重叠群达到阈值的细胞被丢弃。每个实验中所有单细胞组装的VSG和推定的“供体” VSG的Multifasta文件均与MiniMAP2（参考文献59）（v.2.10）一起构建并与VSG-8构建。最后，在IGV和重组的起始和终点位置和每个细胞的推定供体中可视化对齐。

　　表达不同VSG的细胞系-VSG-2，VSG-8，VSG-11和用于ATAC-SEQ实验的细胞系保持在收集前的0.5–1.0×106个细胞。如前所述60进行RNA-Seq库制备。使用Qubit双链DNA HS分析套件和Agilent Tapsestation System以链特异性RNA-Seq库浓度进行了重复测量。根据制造商的协议对图书馆进行量化，并在Illumina NextSeq 1000平台上进行排序，以生成配对端读取。

　　对于李斯特427血流的大量转录组分析，形成野生型细胞（VSG-2 Expresser）和已切换到不同VSG表达的克隆（VSG-8或VSG-11），映射到Lister 427基因组组装V11的Lister 427基因组组件V11（v.2.2.7..10a）。生成覆盖范围的文件，并以与SCRNA-SEQ数据相同的方式（“开关分析类型”部分）绘制。为了分析转录开关时间课程，用BWA-MEM61（v.0.7.17）映射读取，并用PICARD（V.3.2.0）“ Markduplicates”功能过滤PCR重复项。每个基因的计数均通过子读（v.2.0.1）“特征伦敦”功能进行计算，从而过滤较低的置信映射读取（'-Q 10'）。然后将基因计数归一化为千倍酶，每百万映射的读数。

　　ATAC-SEQ库是按照Müller等人10进行了几次修改的Müller等人制备的。简而言之，收集了26.7×106个细胞（在1,800G时10分钟），并在30 mL冰冷的1×TDB中洗涤。将这些细胞重悬于200 µL透化缓冲液（100 mM KCl，10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM DTT，25 mM EDTA）中，并提供了蛋白酶抑制剂。加入2 µL 4 mM digitonin后，将细胞在室温下孵育5分钟。接下来，将细胞在4°C下以1,200g的含量为1,200g，持续10分钟，重悬于400 µL的等渗缓冲液（100 mM KCl，10 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM CaCl2、10 mM CaCl2、5％甘油）中，并再次使用蛋白酶抑制剂并再次粘贴。通过将50 µL的标记混合物（25 µL 2×反应缓冲液，24 µL DH2O，1 µL TDE1）添加到标记，并在37°C下孵育30分钟。然后使用Qiagen Minelute PCR纯化试剂盒纯化DNA，在10 µL洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0）中洗脱，并使用2.5 µL指数引物（每个，25 mm）在50 µL中使用2.5 µL的指数高效DNA聚合酶放大13个循环。使用Ampure XP珠以1.8×比率纯化所得的文库，并在20 µL无核酸酶的水中洗脱。在NextSeq 1000平台上对图书馆进行了排序，以生成60 nt的配对读数，每个读数为4亿读。

　　读取映射到使用BWA-MEM61（V.0.7.17）的Lister 427基因组组件V.11。用“ BAMCOVERAGE”计算每25 nt垃圾箱的每百万范围覆盖范围的计数，而过滤的读数低映射质量（“ -Q 10”）。每个BES的平均覆盖范围是通过DeepTools52（v.3.5.1）的“ Multibigsummary”功能计算的。对于每个BES和样本，计算了与初始静音状态的Log2比率。

　　如前所述进行了幸福感（如下所述的修改）。此外，根据先前的锥虫体39中的幸福实验，调整了开始细胞浓度。通过在收集细胞之前将2×108细胞与强力霉素孵育4小时，可以诱导Cas9。将细胞在800g下颗粒10分钟，并将其重悬于17.5 mL温暖的1×TDB中，然后在2％无甲醇的甲醛在室温下固定在2％的2％无甲醇甲醛的情况下进行固定10分钟。甲醛通过将甘氨酸添加到终浓度为125毫米，并在室温下旋转5分钟，在冰上旋转5分钟。将交联的细胞固定并在20 ml冰冷的1×TDB中洗涤，转移到1.5 mL蛋白质叶叶管（Eppendorf）中，并再次用冰冷的1×TDB洗涤。使用Neubauer腔室对交联细胞进行计数，并在4°C下保持长达两周的时间，然后开始制备幸福模板。接下来，将5×107的交联细胞在200 µl的裂解缓冲液1（10 mm Tris pH 8.0，10 mm NaCl，1 mm EDTA，0.2％Triton X-100）上裂解1小时，并在200 µl的前裂解液裂解2（10 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm ph）上，并在200 µl中固定并在200 µl中加油。37°C，以400 rpm摇动。将细胞用200 µL预热的CSTX缓冲液（1×RCUTSMART缓冲液与0.1％Triton X-100）洗涤两次。使用快速钝化试剂盒（NEB）在25°C下以400 rpm的振动在25°C下进行1小时进行样品的DSB钝，然后用200 µL CSTX缓冲液洗涤两次。使用T4 DNA连接酶（Thermo Fisher）将四个微量的样品特异性10 µm退火适配器连接至16°C的钝DSB。在100 µL的尾巴缓冲液（10 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，50 mM EDTA，0.5％SDS）中用10 µL的蛋白酶K（NEB，800 U ML -1）重悬于100 µL的尾巴缓冲液（10 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，50 mM NaCl，800 U ML -1）中，将结扎的样品洗涤两次。将样品在55°C下孵育过夜，以800 rpm摇动， 然后再添加10 µL蛋白酶K（NEB，800 U ML -1），再孵育又持续了一个小时。通过在95°C下孵育样品10分钟，将蛋白酶K停用。使用苯酚 - 氯仿 - 异醇混合物提取模板DNA，然后进行乙醇沉淀，并在130 µL的TE缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mm EDTA）中洗脱。使用Covaris S220和以下设置将提取的模板DNA在微管中超声处理80 s：占空比10％，PIP 140 W，每爆发200个周期。然后用0.8×Ampure XP珠纯化剪切的DNA，并在15 µL无核酸酶的水中洗脱，并在贴纸上进行分析。为了准备幸福的文库，使用Megascript T7转录试剂盒（Thermo Fisher）（Thermo Fisher）使用50-100 ng纯化的DNA在模板DNA的体外转录，并在37°C下孵育15小时。接下来，用涡轮DNase I（Thermo Fisher）降解DNA模板，并用1×Ampure XP珠纯化放大的RNA，并在6 µL无核酸酶的水中洗脱。在挂接上分析了放大的RNA。之后，使用T4 RNA连接酶2截断（NEB）将10 µM RA3衔接子的1 µL连接到纯化的放大RNA，然后用2 µL 10 µM RTP和10 µM Superscript IV反向转录酶（Thermo Fisher）进行逆转录。使用库特异性的RPIX索引引物和RP1共同引物，将库通过PCR与Nebnext Ultra II Q5（NEB）进行索引并通过NEBNEXT Ultra II Q5（NEB）进行放大。通过将每个样品分成八个不同的PCR管来进行PCR。双面清理在图书馆上使用0.45–0.75×Ampure XP珠子进行。在挂接上分析了最终库，并使用KAPA库定量套件（Roche）对库池进行了量化。在NextSeq1000（Illumina）测序平台上，对库进行了配对末端（用于读取1和52个周期的80个循环），每个库的深度为4000万个读取。

　　对前读数进行修剪以使用Castadapt47（v.3.5）删除库条形码和UMIS，最多允许一个不匹配。然后，使用可用的Python脚本39添加了修剪的序列。此外，为了避免在目标位置上对导RNA（GRNA）衍生的序列进行交叉映射，用custadapt丢弃了包含GRNA支架的读数。然后将读取与默认参数与BWA-MEM61（V.0.7.17）的Lister 427基因组组装V.11对齐。然后，使用UMI_Tools64的函数“ defup”（v.1.1.2）的函数在前读的标头上重复进行对齐的读数。将重复实验的过滤对齐文件与SamTools51（v.1.20）合并为“合并”功能和向前读取开始的归一化覆盖范围，标记了10-nt bin的DSB位置，用DeepTools52的BAMCoverage功能与DeepTools52（V.3.5.1）的BAMCoverage功能计算出来（V.3.5.1）（V.3.5.1）（V.3.5.1）（V.3.5.1）‘ - samflaginclude 66'和“ - 标准化cpm”。最后，用深层工具的“ bigwigcompare”功能计算了与Lister 427血液形成野生型细胞的比率覆盖率，并针对具有PygenoMetrackS53的特定区域绘制了（v.3.8）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。