A549，BSC1，CACO2，HUH7，VERO E6和293T细胞被维持在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中，该培养基（DMEM）添加了10％热灭活的胎儿牛血清（FBS），100 U ML-1 Penicillin，100μgMl-1 crimillin和100μgml-1-g Ml-1-1骨横向霉素。将BEAS2B和CALU3细胞保持在补充10％热灭活FBS，100 U ML-1青霉素和100μgml-1链霉素的DMEM/F12中。将HFL保持在补充10％热灭活FB的最小必需培养基（MEM）中，100 U ML-1青霉素和100μgml-1链霉素。根据香港大学机构审查委员会批准的协议，从香港红十字会输血服务中收集的健康供体的人类外周血单核细胞（PBMC）获得了人类原发性单核细胞。将MDM与补充有10％热灭活FBS的RPMI-1640培养基中的单核细胞区分开如前所述45，菌落刺激因子（GM-CSF）（R＆D系统）。

　　MERS-COV（EMC/2012）的MERS-COV菌株由R. Fouchier提供。Mers-Covma是P. McCray的礼物。SARS-COV-2野生型HKU-001A46，Omicron BA.1（GenBank：OM212472）和Omicron BA.2（Gisaid：epi_isl_9845731）从实验室确认的患者中分离出与Hong Gong的Covid-19。SARS-COV-1 GZ50，HCOV-229E，HCOV-OC43，肠病毒A71和流感A/Hong Kong/Hong/415742/2009（H1N1）PDM09在香港Microbiology系在临床分离株。所有涉及MERS-COV，SARS-COV-2和SARS-COV-1的传染性实验均遵循香港大学微生物学系的BioSafety 3级设施的批准的标准操作程序47。

　　pan-caspase抑制剂Z-VAD-FMK获自Invivogen（TLRL-VAD）。caspase-1-1-Caspase-10抑制剂采样器试剂盒购自研发系统。caspase-6抑制剂，用于体外和体内实验的Z-VEID-FMK，从R＆D系统（FMK006）和Apexbio（A1923）获得。凋亡增强子STS（S5921）是从Sigma获得的。FILGOTINIB（JAK1抑制剂）（HY-18300），ruxolitinib（JAK1/2抑制剂）（HY-50856）和IFNα-IFNAR-IN-1-IN-1盐酸盐（HY-12836A）是从Medchemexpress获得的。poly（i：c）来自R＆D系统（4287/10）。

　　内部豚鼠免疫血清（1：100,000）检测到MERS-COV N。通过内部小鼠免疫血清检测到MERS-COV尖峰（1：10,000）。SARS-COV-2 N通过内部兔子免疫血清（1：10,000）检测到。SARS-COV-1 N通过内部兔子免疫血清（1：10,000）检测到。主要抗体，包括兔抗caspase-3（AB32351）（1：5,000），兔抗caspase-6（AB185645）（1：5,000）（1：5,000），兔子抗HA（AB9110）（1：5,000）（1：5,000），小鼠抗lag（AB49763）（AB49763）（1：5,000），鼠标鼠（1：3000），（1：3000）抗β-肌动蛋白（AB8226）（1：10,000）来自ABCAM。二级抗体，包括山羊抗小鼠辣根过氧化物酶（HRP）（62-6520）（1：5,000）（1：5,000），山羊抗兔HRP（65-6120）（1：5,000）（1：5,000）和山羊抗Guinea pick hrp（A18769）（A18769）（A18769）（A18769）（A18769）（A18769），来自Thermo Fishericific。

　　内部豚鼠免疫血清检测到MERS-COV N（1：2,000）。SARS-COV-2 N通过内部兔子免疫血清（1：1,000）检测到。IRF3由兔抗HA（AB9110）检测到（1：500）。次生抗体，包括Alexa Fluor 488山羊抗旋转猪（A-111073）（1：500），Alexa Fluor 488山羊抗兔（A-111034）（1：500）（1：500）和Alexa Fluor 568 Goat goat Anti Anti Anti-Rabbit（A-111036）（A-111036）（A-11036）（A-11036）（1：500）

　　在香港皇后玛丽医院接受手术手术的患者中检索了用于体内研究的人类肺组织。所有捐助者均由香港/医院管理局机构审查委员会批准的书面同意，香港西部集群。使用正常的非恶性肺组织片段过多地进行临床诊断。将新鲜获得的肺组织加工成小矩形碎片，并用原发性组织培养基冲洗，其中含有高级DMEM/F12培养基，这些培养基补充了2 mM HEPES（GIBCO），1×谷胱甘肽（Gibco），100 U ml -1 Penicillin，100μgml -1 prypyscin，20°1 pryptypomycils，20°CMolyscin，20°1 Pericillin，20μgml -1环丙沙星，50μgml -1 amikacin和50μgml -1 nystatin。样品以1×108 PFU ML-1的滴度感染MERS-COV。2小时后，除去接种物，并用一级组织培养基彻底洗涤样品。然后将感染的组织与补充有100μMcaspase-6抑制剂Z-VEID-FMK或DMSO的原代组织培养基孵育。在24 hpi的情况下，将组织与10％中性缓冲福尔马林进行免疫荧光染色或RL缓冲液（Takara）进行RT-QPCR分析。

　　使用活检的人类肠道组织从香港皇后医院进行手术手术的患者建立了人类肠癌。所有捐助者均已获得香港/医院管理局机构审查委员会批准香港西部集群的同意书。通过与分化培养基孵育5天，将人肠癌保持在膨胀培养基中，并诱导分化。将分化的肠道器机械剪切，并在1 MOI下用MERS-COV接种2小时。去除接种物后，用PBS冲洗肠癌并嵌入基质中，并保持在含有100μMZ-VEID-FMK或DMSO的分化培养基中。在接种后指定的时间点，收集肠癌，以定量细胞内病毒载量和免疫荧光染色，而使用标准斑块分析，将无细胞的母质和培养基合并，用于病毒滴定细胞外病毒体。

　　HDPP4-K小鼠由P. McCray17提供。使用动物符合所有相关道德法规的使用，并获得了关于现场动物在香港教学和研究中使用的委员会的批准。在感染当天，将HDPP4-KI小鼠在室内接种，并在20μLDMEM中预先稀释的2.5×103 PFU小鼠适应的MERS-COV（MERS-COVMA）接种，然后在腹腔内注射12.5 mg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-1 Z-veid-so稀释剂0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％0.3％。Tween-80/PBS每天一次，持续6天或直到采集样本。每天或直到将小鼠安乐死，因为它达到了实验的人道端点，每天监测小鼠的健康状况和体重。在指定的时间点安乐死了小鼠，并收集了来自治疗组的小鼠的肺组织，并收集对照组进行免疫荧光染色，RT -QPCR和斑块测定分析。

　　如先前所述，对金叙利亚仓鼠的感染进行了18。通过HKU比较医学研究中心（CCMR），从香港大学中国大学实验室动物服务中心（CCMR）获得了6-8周大的金叙利亚仓鼠。动物的使用已符合所有相关的道德法规，并获得了关于现场动物在香港教学和研究中使用的委员会的批准。在感染当天，在腹膜内氯胺酮（100 mg kg-1）和甲基嗪（10mg kg-kg-kg-1）麻醉下，在50μLDMEM中预先将每个仓鼠与3×103 PFU SARS-COV-2内接种。用12.5 mg kg-1天-1 Z-VEID-FMK或DMSO在600μl0.3％甲基纤维素/0.1％Tween-80/PBS中用12.5 mg-kg-1天Z-VEID-FMK处理4天。每天或直到动物安乐死，因为它达到了实验的人道端点，对仓鼠的健康状况和体重进行监测。将仓鼠安乐死在4个DPI上，并收集肺组织进行免疫荧光染色，组织病理学检查，RT – QPCR和TCID50分析分析。

　　在香港大学比较医学研究中心进行的HDPP4-KI小鼠背景上的Caspase-6-KO小鼠的产生。简而言之，三个从Synthego（5'-CCCTCATCTTCATCATCACGAGAGG-3'，5'-CTCCTGCTCAAAATCATCACGAGGG-3'和5'-TGGCGTCGTCGTCGTCGTATGCGTATGCGTAAAACGTGG-3'）中购买了靶向caspase-6 Gene-6 Gene exon 3，Exon 3，Exon exon exon exon exon 3，Exon exon exon exon exon 3 ,,4a）。Cas9蛋白购自Invitrogen（Truecut Cas9蛋白V2）。首先，将SGRNA（0.5μgμl-1）和Cas9蛋白（0.4μgμl-1）稀释在Opti-Mem（Gibco）中。核糖核蛋白（RNP）是通过涡旋混合物而形成的，然后在室温下孵育20分钟。其次，进行体外受精以产生通过电穿孔产生双重突变体所需的纯合HDPP4胚胎。腹膜内注射7.5 iu怀孕的母马血清促性腺激素（PMSG），然后在48小时后48小时，腹膜内注射7.5 IU怀孕的母马血清促性腺激素（PMSG），然后在腹膜内注射7.5 IU人类绒毛膜促性腺激素（HCG）。HCG注射十二小时后，将三个月大的纯合HDPP4螺柱雄性安乐死。精子从Cauda附睾释放到4孔板的一个孔中。在孵化器（5％CO2，37°C）中，允许精子在改良的人输注液培养基（MHTF）中45分钟。卵母细胞是从超含量雌性的产卵中收集的，并将其添加到精子中。体外受精后四个小时，用MHTF培养基两次洗涤胚胎，并用补充钾的单纯形培养基（KSOM）两次。将胚胎在孵化器中的KSOM中培养，直到电穿孔为止。第三，使用方波电器（CUY21编辑II，BEX）将RNP传递到核阶段胚胎中。用1 mm间隙（LF501PT1-5，BEX）将五个微量的RNP吸入了铂电极的腔室。将参数设置为遵循的五个孔隙脉冲：200 V，2毫秒长，间隔50 ms，4次，10％电压衰减， +极性，其次是五个转移脉冲：20 V，50 ms长，50 ms间隔，40％电压衰减，交替 +和 - 极性。通过将少量的Opti-MEM添加到间隙中，将阻抗调节低于0.17欧姆。将电穿孔的胚胎立即转移回KSOM，并孵育30分钟。将胚胎用新鲜的KSOM洗涤两次，并孵育过夜。第二天早晨，将2细胞的胚胎转移到孕后伪怀孕的ICR（CD-1）雌性的0.5天。胚胎转移二十天后，携带淘汰等位基因的幼崽出生了。幼崽在3周龄后断奶。收集耳孔样品进行caspase-6基因分型。在感染当天，HDPP4-KI caspase-6 KO小鼠和HDPP4-KI caspase-6野生型同胞对照同时通过2.5×103 PFU MERS-COVMA在20μLDMEM中预涂层的2.5×103 PFU MERS-COVMA，同时感染。在2 dPi和4个小鼠的4个DPI和4个小鼠的肺组织中，收集了小鼠，以进行RT -QPCR，斑块测定分析，H＆E染色和免疫荧光染色。

　　组装成PBAC（PBAC-SA-FL）的MERS-COV菌株EMC/2012（GenBank登录号JX869059）的cDNA被用作产生TKKA突变体（RMERS-COV/TKKA）的背景，并以TKKD型MERS-COV N GeneeeeNGeneE48。该突变通过红色重组49引入PBAC。通过桑格测序证实了该突变。具有突变位点的重组克隆转化为DH10B电位细胞，然后将质粒提取以获取超纯和高质量的全长cDNA克隆。通过使用Lipofectamine 3000作为转染试剂将BHK21细胞转染以5μg的全长cDNA克隆转染，从而回收传染性病毒。转染后6小时后，将转染的BHK21细胞重新种子并与HUH7细胞共培养。72小时后，上清液用于接种HuH7细胞以进行病毒。重组病毒被发送到下一代测序，以确认病毒基因组中所需的突变和不希望的突变。对于体外感染，将HUH7，A549和VERO E6细胞感染了RMERS-COV/TKKA和RMERS-COV/TKKD。分别从2、24和48 HPI的RT – QPCR和TCID50分别从感染细胞中收集细胞裂解物和上清液样品。此外，在1、24和48 hPi中收集了RMERS-COV/TKKA-和RMERS-COV/TKKD感染的HUH7细胞，以用于N蛋白表达的蛋白质印迹分析。对于体内感染，将HDPP4-KI小鼠室内用3.5×104 PFU RMERS-COV/TKKA或RMERS-COV/TKKD在20μLDMEM中预删除。在2 dPi和4个小鼠的4个DPI和4个小鼠的肺组织中，收集了小鼠，以进行RT -QPCR，斑块测定分析，H＆E染色和免疫荧光染色。

　　Caspase-6 CRISPR – CAS9 KO质粒购自Santa Cruz Biotechnology。根据制造商的方案（https://datasheets.scbt.com/protocols/crispr_protocol），通过与HDR质粒共转染HUH7细胞中caspase-6的敲除。简而言之，将HuH7细胞接种在6孔板中，然后用3μgcaspase-6 CRISPR-CAS9 KO质粒和3μgHDR质粒和非靶向对照质粒使用脂肪触及乳pent胺3000。在3000中进行转染，在3000。在转移后72 h caspase-6 Ountolycin inture Contrycin targeting targitinging Mistranting Mimed intering targitinging Mive intrys inture tartsing oftersing Mive intry targiting oftrycrantion。caspase-6敲除用蛋白质印迹验证。在感染当天，Huh7细胞在1 MOI处被MERS-COV感染。在2、24和48 HPI时，收集了细胞裂解物和上清液进行RT -QPCR定量和TCID50分析。

　　将细胞在RL缓冲液中裂解，并用最小的通用RNA提取试剂盒（Takara）提取。用最小病毒RNA/DNA提取试剂盒（Takara）提取上清液中的病毒RNA。使用转录器第一链cDNA合成试剂盒和Lightcycler 480 Master Mix从Roche进行RT -QPCR。通过LightCycler96（版本SW1.1）收集数据。所有引物和探针序列均在补充表2中提供。

　　用标准斑块分析确定MERS-COV和SARS-COV-2的传染性滴度46。简而言之，在实验前1天将Vero E6细胞接种在24孔板中。将收集的上清液样品连续稀释，并在37°C下接种到细胞2小时。接种后，将细胞用PBS洗涤3次，并用2％琼脂糖/PBS与2×DMEM/2％FBS混合以1：1的比例覆盖。在37°C孵育72小时后固定细胞。将固定的样品用0.5％晶体紫染色的25％乙醇/蒸馏水染色10分钟，以进行斑块可视化。在某些实验中，用标准TCID50分析确定冠状病毒的传染性滴度。简而言之，在实验前1天，将Vero E6细胞接种在96孔板中。将收集的上清液样品连续稀释，并在37°C下接种到细胞2小时。接种后，将细胞用PBS洗涤3次，并在37°C下孵育。在72 hpi之后，使用腹腔和芦苇方法计算病毒滴度。

　　targetplus caspase-6 siRNA获自Dharmacon（L-004406-00-0005）。使用Lipofectamine Rnaimax（Thermo Fisher Scientific）对MDMS上的转染。简而言之，连续两天用50 nm caspase-6 siRNA转染细胞。第二次siRNA转染后24小时，将细胞收集在RIPA缓冲液中进行蛋白质印迹分析。同时，在37°C下以1 MOI在1 MOI下用MERS-COV挑战siRNA转染的细胞。接种后，将细胞用PBS洗涤并孵育24小时。用RT – QPCR确定24 hpi处的病毒拷贝数。PLKO.1慢病毒caspase-6 shRNA质粒从佛法获得。在制造商的手册后，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）对293T细胞的caspase-6 shRNA质粒，PSPAX2包装质粒和PMD2.G包膜质粒转染。简而言之，在10 cm培养皿中，用6μgcaspase-6 shRNA质粒，4.5μg包装质粒和1.5μg的包膜质粒转染了10 cm的293T细胞，在FBS支持的DMEM培养基中进行了1.5μg的包膜质粒，然后在3 h后6小时，在转移后6 h替代FBS-FBS-FBS-FBS-FBS-FBS-FBS-FBS-FBS-FBS-FBES替换。第二天，收集了含有caspase-6 shRNA慢病毒颗粒的上清液，并用于转导A549和BEAS2B细胞。A549和BEAS2B caspase-6稳定的敲低细胞分别由0.5μgml-1和0.7μgml-1紫霉素选择。在37°C下以0.1 MOI在0.1 MOI下用MERS-COV挑战选定的细胞。用RT – QPCR确定1和24 HPI的病毒拷贝数。

　　HuH7细胞在1 MOI下以MERS-COV感染12小时。同时，用STS以1μM刺激HUH7细胞6小时。用caspase-GLO-6测定试剂盒（Promega）确定细胞裂解物中的caspase-6活性。使用多标签板读取器Victor X3（Perkin-Elmer）在制造商手册后测量caspase-6活性的发光信号。使用Kaleido（1.2版）软件分析数据。

　　感染的人和动物肺组织在10％福尔马林50中固定过夜。然后将固定的样品与TP1020 Leica半粘合台式组织处理器嵌入石蜡中，并以5μm切割。将组织切片钓鱼并干燥，以固定在37°C的Thermo Fisher Scientific Sc​​ientifific Superfrost和幻灯片上过夜。通过在抗原卸载溶液（载体实验室）中加热载玻片进行90 s进行抗原检索。分别用内部豚鼠抗蛋白毒素抗Mers-cov N免疫血清和内部兔子抗Sars-Cov-2-N免疫血清检测到MERS-COV和SARS-COV-2。用DAPI核酸染色（Thermo Fisher Scientific）标记细胞核。Alexa Fluor二级抗体是从Thermo Fisher Scientific获得的。使用Thermo Fisher Scientific的钻石延长抗抗激发剂进行安装。使用Olympus Cellens Dimension（版本1.17）和Zeiss（Zen 2）Microscope软件，在HKU的教师核心设施中，用Olympus BX53 BX53荧光显微镜（Olympus Life Science）或Carl Zeiss LSM 780共聚焦显微镜捕获图像。对于H＆E染色，用Gill的H＆E Y（Thermo Fisher Scientific）对小鼠和仓鼠肺组织切片进行染色。用奥林巴斯BX53荧光显微镜捕获图像。H＆E染色的肺组织切片因实验环境的身份而盲目，并由训练有素的组织病理学家检查。如先前所述的19，根据分级系统的评分为0（正常）至4（最严重）。

　　用蛋白酶抑制剂（Roche，巴塞尔，瑞士）用RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific）裂解细胞。通过SDS -PAGE分离蛋白质，并转移到PVDF膜（Thermo Fisher Scientific）。将特定的一抗在4°C下与封闭的膜一起孵育过夜，然后在室温下在辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗（Thermo Fisher Scientific）中孵育1小时。该信号是用Immobilon Crescendo Western HRP底物（Merck Millipore）开发的，并使用自动X射线膜处理器（Advansta）或Alliance Q9 Advanced Imager（UVITEC）检测到。使用Alliance Q9软件（V17-02）收集原始的Western印迹图像，并作为补充无花果提供。1–4。

　　Beas2b细胞在1 MOI下用MERS-COV感染。在24 HPI时，将细胞用10 mM EDTA在PBS中拆下，固定在4％的多聚甲醛中，然后用内部豚鼠抗毒剂抗蛋白 - 抗Mers-Cov N免疫血清和兔抗活性caspase-3抗体（560626，BD Biosciences）（560626，BD Biosciences）（1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：50000）。使用BD FACSCANTO II流式细胞仪（BD）进行流式细胞仪，并使用FlowJo（版本VX 0.7）（BD）分析数据。补充图5中证明了门控策略。

　　如前所述26,27进行IFNβ荧光素酶报道测定。In brief, 500 ng IFNβ luciferase reporter plasmid, 10 ng transfection efficiency control plasmid (pNL1.1.TK, Promega), 1 μg coronavirus N plasmids, 3 μg caspase-6 expression plasmid, together with or without 5 μg Poly(I:C) were co-transfected into 293T cells for 24 h.第二天，使用多标签读取器Victor X3（Perkin-Elmer），根据制造商的协议（Perkin-Elmer），根据制造商的协议收集了使用双酸酶报道测定系统试剂盒（Promega）进行荧光素酶测量的细胞。使用Kaleido（1.2版）软件分析数据。为了研究n个片段的作用点，将IFNβ荧光素酶报道质粒PNL1.1.TK和MERS-COV N（1-241）或MERS-COV N（242-413）共转染为293T细胞，与钻机，MAVS或TBK1的表达质粒一起共转染为293T细胞。转染后24小时，收集细胞进行荧光素酶测量。

　　HOMO SAPIENS（UNIPROT ID：P55212），MUS MUSCULUS（UNIPROT ID：O08738）和Mesocricetus Auratus（Uniprot ID：A0A1U7QNN7）的caspase-6蛋白序列。用肌肉进行多序列比对（v3.8.31）。caspase-6和Veid复合物的晶体结构从蛋白质数据库（PDB代码：3OD5）中获取。caspase-6在VEID中4Å之内的残基被定义为结合位点，并用Pymol可视化（版本2.5）。

　　MERS-COV N（NC_019843）的蛋白质序列用于CASPASE-6裂解位点分析。根据caspase-629的公开底物特异性确定了MERS-COV N上的潜在caspase-6裂解基序。搜索氨基酸模式[TVILENYF] .. D与N序列相对，其中“。”代表任何氨基酸。

　　数字中的数据是平均值±S.D.使用GraphPad Prism 9通过单向方差分析，双向ANOVA，Student t-tym-cox（Mantel-Cox）测试进行不同组之间的统计比较。在p <0.05时，差异被认为具有统计学意义。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。