人（CH17-203N23，CH17-449P15和CH17-339H2）和小鼠（RP23-51O13，RP23-75P20和RP23-204E8）BAC购自BACPAC资源中心。Mitchell基于先前的研究28，米切尔（L. Mitchell）修改了酵母菌 - 基础班车载体PLM1050。PWZ699是通过插入包含PPGK-ΔTK-SV40PA转录单元和ACTB基因的盒式盒子来构建的。使用MC1的Gibson组装构建了用于Syntrp53和ACE2基因座的标记盒1供体质粒，并在PUC19载体中构建了两个同源臂。从相应的BAC中扩增了〜750 bp的左右同源臂。当使用微型学介导的末端连接进行MC1插入时，底漆上携带20 bp的微型学臂。PX330质粒购自Addgene（42230）。

　　C57BL/6 J小鼠ES细胞系（MK6）是从NYU Langone Health啮齿动物基因工程核心获得的。在此描述的MK6及其衍生物被广泛使用。它的许多基因座在我们的实验室中进行了测序。它已测试了支原体污染，被发现为阴性。在这项研究中，使用饲养者依赖性和依赖喂食者的培养条件是不同目的的。依赖进料的小鼠ES细胞培养基由85％（V/V）敲除DMEM（Fisher Scientific，10829018），15％（v/v）胎牛血清（Hyclone，sh30070.03），0.5 mg mg mg ml-1 penicilcillin-sttreptlycin-glutycin-glutamine（gibco，1016）2-羟基乙醇（Sigma-Aldrich，M6250），0.1 mM MEM非必需氨基酸（Gibco，11140050）和1,000 U ML-1 LIF（EMD Millipore，ESG1107）。首先将组织培养处理的板用0.1％明胶溶液（EMD Millipore，ES-006-B）覆盖，然后在MEF培养基中播种7.5×104 cm-2的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞（MEF）细胞（Cellbiolabs，CBA-310）MEF培养基（Gibco，11965118），10％，bofcine，10％，bovine bogco，fibco，10％，bovin0.1 mm内存非必需氨基酸，2 mM-谷氨酰胺，1％青霉素 - 链霉素）。将小鼠ES细胞铺在MEF单层上。馈线独立培养基由2i基底培养基补充剂中的80％和3 µM CHIR99021和1 µM PD0325901组成，其中20％的依赖小鼠ES ES细胞培养基（如上所述）。使用前，将组织培养处理的板用0.1％明胶溶液涂覆。所有细胞均在37°C的加湿组织培养培养基中生长，供应5％CO2。VEOE6细胞（来自非洲绿色猴子的肾上皮细胞，ATCC，CRL-1586）在12孔板中培养，DMEM补充了4％FBS，1％青霉素 - 链霉素 - 抑制霉素 - 抑制霉素和0.2％琼脂糖（Lonza，50100）。BY4741酵母菌菌株用于所有有效载荷组件。

　　SARS-COV-2菌株USA-WA1/2020（NR-52281）从NIAID的Bei Resources，NIAID，NIH获得。SARS-COV-2病毒在Veroe6细胞中扩展41。用Amicon Ultra Ultra-15离心滤清器（Millipore Sigma）纯化收集的病毒。SARS-COV-2病毒量滴定是通过在VEROE6细胞中进行牙菌斑测定来确定的。

　　将工程的小鼠ES细胞注入C57BL/6J-Albino（Charles River Laboratories，第493号应变）胚泡，或B6D2F1/J（Jackson Laboratories，No。100006）四倍体胚泡的产量。小鼠住在NYU Langone Health BSL1屏障设施中。从杰克逊实验室获得了野生型C57BL/6 J（应变号000664）和K18-HACE2（应变NO。034860）小鼠。金仓鼠是从查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）获得的（第049号应变）。将十五周龄的小鼠和十二周大的仓鼠转移到NYU Langone Health BSL3设施中，以感染SARS-COV-2。所有小鼠在感染前至少两天定居。将类似的老鼠或仓鼠随机分为不同的笼子。选择动物样本量以实现明显的统计能力，同时最大程度地减少不必要的浪费。动物在12小时的光中饲养：12小时的黑暗周期，环境温度和湿度状况。所有实验程序均由NYU Langone Health的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

　　在本研究中，使用了两种方法进行有效载荷DNA组装。对于合成Syntrp53及其随后的40 kb，75 kb和115 kb的有效载荷，使用Q5聚合酶（NEB，M0491L），从鼠标BAC RP23-51O13（MAC BAC RP23-51O13）放大了从3 kb到5 kb的DNA片段，范围为3 kb至5 kb，具有40-100 bp末端的同源性。将每个PCR片段的大约相等数量（100 ng）与50 ng的每个接头片段混合，用于桥接矢量和插入物，并将20 ng线性化的PLM1050载体共转化为酵母，以组装。对于ACE2和TMPRSS2有效载荷，通过使用核对XTRA BAC试剂盒（Takara，740436.25）提取CH17-203N23，CH17-449P15和CH17-449P15和CH17-339H2 BAC。用30 nm的SGRNA（IDT）和30 nm重组Cas9核酸酶（NEB，M0386S）在37°C下消化约1μg的BAC DNA，持续2 h。在室温下将1μl的20 mg ML -1蛋白酶K添加到消化反应中10分钟。消化的BAC和Sali-linearized受体载体（图3B和扩展数据图11b）被共转化为酵母以进行组装。将酵母细胞在30°C的SC – LEU板上培养3天。通过筛选每个两个片段之间的所有新型连接，可以确定包含正确有效载荷的酵母菌菌落。为了组装180 KB-HACE2有效载荷，将URA3基因插入了116 KB-ACE2有效载荷的MC2前。感兴趣的64-KB ACE2区域通过体外CAS9 – GRNA消化从CH17-449P15 BAC释放。将质粒表达靶向酵母中URA3的cas9和GRNA与64 kb ACE2片段共转化为包含116 kb-ace2有效载荷的BY4741菌株。用5-氟酸酸选择酵母细胞，以成功插入64 kb ACE2片段。通过使用酵母质粒微型套件（Zymo Research，d2001）从酵母中分离有效载荷DNA，在30μlTE中洗脱。使用两个微量的酵母小型DNA用于电穿孔到Epi300大肠杆菌菌株中（Lucigen，EC300150）。将含有有效载荷DNA的大肠杆菌菌落在补充50μgml -1 kanamycin的5 mL lb培养基中生长过夜，并以1：100的比例稀释为250 ml lb，补充了卡纳米霉素（50μgml -1）（50μgml -1）和1×拷贝数诱导溶液（lucigigen，ccisis125）。通过使用核对大肠杆菌（Takara，740436.25）将有效载荷DNA从大肠杆菌中分离出来，以递送到小鼠ES细胞中。用于有效载荷组装的引物在补充文件3中列出。

　　通过使用Qubit DSDNA HS试剂盒（Thermo Fisher，Q32854）来量化BAC和组装有效载荷DNA的浓度，使用Nebnext Ulta Ultra II FS DNA DNA库预备套件（E7805），将大约100 ng的DNA用于库构造。Ampure XP珠（Beckman Coulter，A63881）用于磁性座上的DNA纯化。将DNA文库加载在ZAG DNA分析仪（Agilent）上以进行质量控制。DNA库是在Illumina NextSeq 500上测序的。

　　使用BCL2FASTQ v2.20对测序读数进行了反复，并随后使用Trimmomatic V0.39进行修剪。修剪的读取与使用BWA V0.7.17的参考对齐。使用Samblaster V0.1.24标记重复项。使用Bedops v2.4.35生成覆盖深度轨道和定量。使用UCSC基因组浏览器可视化测序数据。测序处理管道可在https://github.com/mauranolab/mapping上找到。

　　使用单切割限制酶对有效载荷DNA进行线性性，然后按照制造商的建议进行热灭活。将两百纳图的消化产物加载到1％的低熔点琼脂糖凝胶中。Lambda-PFG梯子（NEB，N0341S）或Lambda DNA-MONO切割混合物（NEB，N3019S）用作梯子。Chef Mapper XA系统（Bio-Rad），自动算法用于电泳。琼脂糖凝胶首先用0.5μgml-1溴化乙锭在去离子水中染色30分钟，然后用去离子水去除30分钟，然后在Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）上进行成像。

　　在含明胶涂层的板上生长的小鼠ES细胞克隆用PBS洗涤一次，然后在室温下将4％（w/v）甲醛固定15分钟，然后用PBS进行2轮洗涤。0.1％（用10％乙醇稀释）晶体紫（Sigma-Aldrich，v5265）染料在室温下染色小鼠ES细胞菌落染色20分钟，然后用水3轮洗涤。在计算菌落数之前，将板在室温下进行气干。

　　Syntrp53和野生型TRP53小鼠ES细胞在馈线独立的条件下培养。将细胞在含有250 nm阿霉素（Tocris，2252）的培养基中生长。阿霉素治疗后，将小鼠ES细胞用胰蛋白酶细胞（Invitrogen，h3570）染色30分钟，在室温下进行基于DNA含量的细胞周期分析，或用Annexin v Conjugin用680氟载体染色为680荧光机（Invitrogen，A35109，A35109），以进行15分钟，以进行15分钟，以进行室温分析。使用Sony SH800仪器分析染色的细胞。使用Sony SA3800，SH800和FlowJo软件分析数据。

　　根据培养条件，将10厘米的组织培养培养皿与0.1％明胶（EMD Millipore，ES-006-B）或丝裂霉素处理的MEF进料细胞预先涂覆。用0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200056）在37°C下用0.25％的胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶细胞进行6分钟。通过血细胞计确定细胞数。用DPB（Gibco，14190144）洗涤约300万小鼠ES细胞，并在室温下以300g离心5分钟以固定。总共使用有效载荷DNA和CAS9 – GRNA质粒（S）（补充表3）的10μgDNA混合物进行核反射。核反理溶液和比色绿色来自小鼠ES细胞核对象试剂盒（Lonza，VPH-1001）。核对器（LonZA 2B）A-023程序用于将DNA混合物输送到小鼠ES细胞中。将核定小鼠ES细胞铺在预先涂层的10厘米培养皿上，并在37°C，5％CO2加湿的培养箱中培养。

　　在殖民地拾取前1天，在MEF培养基中的96孔组织培养板（Corning，3595）中预先将有线灭活的MEF预先播种。第二天，使用前2小时，将MEF培养基换成ES培养基的100μL。将含有小鼠ES细胞菌落的10厘米板用DPB洗涤一次，并用10 mL DPB进行补充。使用P20移液管将小鼠ES细胞菌落用10μL的DPB吸入，并转移到空的圆形底部低退位96孔板上。将每孔ACCUTASE（GIBCO，A1110501）的35微颗粒添加到小鼠ES细胞菌落中，以在37°C下解离9分钟。每孔ES培养基的每孔100微晶用于中和胰蛋白酶化反应。小鼠ES细胞通过至少20次轻柔的移液呈奇异。将一百微米的细胞悬浮液转移到用100μlES培养基预填充的明胶涂层的96孔板上。将其余的细胞悬浮液（〜40μL）转移到用100μLES培养基预填充的96孔MEF板上。每天将ES细胞培养基刷新，直到喂食器独立的板变成> 50％汇合。将来自馈球的小鼠ES细胞胰蛋白酶胰蛋白酶化，并将10％的细胞转移到新的明胶涂层板上以进行增殖，将90％的细胞转移到PCR板上。PCR板中的小鼠ES细胞在300g下向下旋转5分钟，并丢弃上清液。用30μl的裂解缓冲液（TE中的0.3 mg ml -1蛋白酶K）重悬于细胞颗粒。使用37°C 1 H，98°C 10分钟，16°C保持程序将小鼠ES细胞裂解。在10μlPCR反应中，将一种小鼠ES细胞裂解物用作模板。

　　使用QIAAMP DNA迷你试剂盒提取小鼠ES细胞的基因组DNA（Qiagen，51306）。将大约500 ng的小鼠ES细胞GDNA和有效载荷DNA在骨架上用ECORI（NEB，R3101S）在37°C下消化2小时。五十纳米图消化的小鼠ES细胞GDNA和1 pg消化的有效载荷DNA用于qPCR分析。对于Syntrp53小鼠ES细胞，将野生型小鼠ES细胞GDNA样品用作归一化对照。SYBR Green Master Mix（Roche，04887352001）用于LightCycler 480仪器上的QPCR反应。将拷贝数标准化为包含有效载荷（对于ACE2和TMPRSS2克隆）或野生型小鼠ES细胞（对于Syntrp53克隆）的ACTB。

　　使用QIAAMP DNA迷你试剂盒（Qiagen，51306）收集了总共1-30万馈源的小鼠ES细胞进行基因组DNA提取。通过使用纳米体分光光度计测定基因组DNA浓度。大约1μg基因组DNA用于具有较大片段大小方案（NEBNEXT ULTRA II FS）的DNA文库结构。通过使用Qubit DSDNA HS分析试剂盒（Invitrogen，Q32851）测量最终DNA文库浓度。对于Syntrp53小鼠ES细胞，捕获诱饵包括RP23-51O13，MC1，MC2和PX330 DNA。对于ACE2人源化的小鼠ES细胞，捕获诱饵包括CH17-203N23，CH17-449P15，RP23-75P20，MC1，MC1，MC2和PX330 DNA。使用尼克翻译试剂盒（Sigma-Aldrich，10976776001）将诱饵DNA混合物用Biotin-16-DUTP（Roche，11431692103）标记。如前所述15进行捕获。简而言之，将生物素化的诱饵DNA混合物预杂交，并在65°C下与DNA文库样品混合16至22小时。使用链霉亲和素C1珠（Invitrogen，65002）纯化捕获的DNA，并使用KAPA HI-FI HOTSTART PCR KIT（Roche，KK2602）进行扩增。在清除DNA的最后一步之后，使用75个循环套件在Illumina NextSeq 500上对捕获的库进行了测序。

　　PCR用于扩增六个TRP53重新编码的密码子区域，并同时用末端UMIS标记每个模板分子。总目标区域分为三个扩增子，长度为108 bp，76 bp和132 bp，以确保准确的测序（补充表4）。两条尾引物的第一部分均针对启动位点，其次是反向引物上的UMI，由10个随机核苷酸组成，总共导致总计超过106个独特的UMI标签。引物末端组成Illumina测序适配器序列。进行了一个PCR反应周期，将UMI引入500 ng原始基因组DNA分子的每个拷贝。该扩展由Kapa-Hifi Hotstart聚合酶和200 nm反向引物携带。热循环参数如下：在95°C下进行预孵育5分钟，然后进行60°C退火1分钟和72°C的伸长率10分钟。进行了另外两轮PCR，以依次扩大感兴趣区域并添加测序索引和Illumina测序适配器。对于扩增子PCR，将所有UMI标签的模板分子添加到含有Kapa-Hifi Hotstart和200 nm的每个引物的50μl反应中。热循环参数如下：在95°C下进行预孵育5分钟，然后在95°C下在95°C，在65°C下15 s的23–26扩增循环（周期数的最大荧光强度的一半）为15 s，在72°C下为30 s。使用Spri珠（0.8×）清理纯化PCR产品。对于条形码PCR，将扩增子PCR样品的1:20添加到包含Kapa-Hifi Hotstart的反应中，每个引物的200 nm。热循环参数如下：在95°C下进行预孵育5分钟，然后在95°C下在95°C，在71°C时在71°C下为15 s的8-12个扩增循环（循环数的最大荧光强度的一半），在72°C下为30 s。使用Spri珠（0.8×）纯化PCR产品 使用量子HS DNA试剂盒进行清理和定量。使用配对末端150 bp方法在Novaseq仪器上对扩增子库进行测序。除去了超过75％的G碱基的Amplicon读取对，并使用FastP48和选项“ -a -g -q 30 -u 15”对质量较差的读数进行过滤。使用UMI-Tools v1.0.1（参考49）提取UMI序列，其中包括选项“ - 质量过滤器 - 阈值= 30”，读取没有针对引物序列的不匹配。使用基于UMI-Tools的定向邻接方法对UMIS进行了重复，并计算了支持每个基本替代模板的UMIS总数。

　　用粒子杵解剖小鼠组织并匀浆（Fisher Scientific，12141364）。使用QIASHREDDER（Qiagen，79654）裂解小鼠ES细胞，按照供应商的说明，使用RNeasy试剂盒提取总RNA（Qiagen，74136）。大约1μg的总RNA用于逆转录（Invitrogen，18091050）。在LightCycler 480仪器（Roche）上，将1毫克的1:10稀释的cDNA用于10μlSybr绿（Roche，04887352001）的QPCR反应。补充表5列出了用于RT – QPCR的引物。

　　从约36周龄的雄性小鼠中解剖睾丸。用DPB的6厘米盘洗涤后，将睾丸切成小块以暴露于生精的小管。将精神小管转移到15 mL管中，该管子含有5 mL解离缓冲液（DMEM，具有10％FBS，1％青霉素 - 链霉素，0.25 mg ML-1胶原酶 - dispase（Roche，Roche，10269638001））在337°C下30 min coubation 30 min divumation。试管一次一次倒置一次。在室温下以300克离心5分钟，收集生精的小管碎片并用PBS洗涤5分钟。通过70μm细胞过滤器将生精的小管片段通过，然后用DPBS两次洗涤。使用自动伯爵夫人计数器评估睾丸细胞密度和活力。通过按照供应商的说明（Epicypher，14-1048），将五十万个睾丸细胞用于每个切割和运行反应。简而言之，细胞在室温下以激活的cona珠约束10分钟。将H3K4ME3，H3K27AC和阴性对照（IgG）抗体与细胞在4°C上的细胞中孵育过夜。第二天，将试管放在磁铁上，并丢弃上清液。用含0.01％digitonin的缓冲液透化细胞。然后将蛋白质A和G与微局局核酸酶（PAG-MNASE）融合到管中，并在4°C下被2 mM CaCl2激活2 h。PAG-MNASE消化后将大肠杆菌DNA升入，并使用DNA清理柱纯化DNA。使用NEBNEXT ULTRA II DNA文库预备套件（E7645L）制备测序文库。使用Illumina NextSeq 500上的75个周期套件对库进行测序。

　　从约25周大的小鼠中收集小肠。用DPB洗涤后，将肠子打开，并在中间的纸上散布。在使用DPB进行2次洗涤后，用刀片将肠切成小块，并转移至10 mL解离缓冲液（DMEM，含5％FBS，1％青霉素 - 链霉素，0.25 mg ML-1胶原酶 - dispase-dispase（Roche，102696638001），0.25 uml-1 dnase）8毫米EDTA，0.5毫米DTT）在4°C下温和摇动30分钟。在室温下沉降后，通过去除上清液来收集组织碎片。将10毫升洗涤缓冲液（DMEM含5％FBS，1％青霉素 - 链霉素）添加到组织片段颗粒中，然后将其牢固地上下摇动8次。在结构的组织碎片沉降后，将含有隐窝的上清液转移到新的15毫升管中，以300克在4°C下以300g的速度离心。将隐窝重悬于1 ml ACK裂解缓冲液（Gibco，A1049201）中，在室温下孵育3分钟。添加了四毫升洗涤缓冲液以停止裂解，在4°C下以300克离心5分钟收集隐窝。用1 ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200056）在37°C下消化地下室5分钟，并通过添加4 ml洗涤缓冲液来停止消化。隐窝通过70μm的细胞过滤器，并在冷PBS中洗涤肠细胞两次。使用自动细胞计数器评估肠细胞数和生存能力。收集约50,000个肠细胞，并用冷PBS在500g的冷PBS上洗涤一次，持续5分钟，4°C。将细胞沉淀重悬于50μL冷裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl，pH 7.4、10 mM NaCl，3 mM MGCL2、0.1％Igepal Ca-630），并在500G下立即旋转10分钟，4°C。TN5转座酶在37°C下用于标记反应（Illumina，20034197）30分钟。使用清理柱（Zymo Research，d4013）纯化碎片的DNA 并在10μl水中洗脱。在50μl反应中，使用KAPA-HIFI聚合酶，将所有洗脱的DNA用作10个循环PCR的模板。使用1.8×Spri珠纯化库DNA，并使用Illumina NextSeq 500上的75个周期套件进行测序。

　　C57BL/6 J，K18-HACE2和ACE2小鼠通过腹膜内注射150μl氯胺酮（10 mg ML-1）/甲基嗪（1 mg ML-1）溶液进行麻醉。将仓鼠注射200μL氯胺酮（75 mg ML -1）/甲基嗪（PBS中5 mg ml -1）溶液。总共将103或105 pfu的SARS-COV-2用于鼻内施用，每只小鼠的总体积为50μlPBS，每仓仓线100μlPBS，同样递送至两个鼻孔。所有感染实验均在NYU BSL3设施中进行。

　　在从安乐死的小鼠或仓鼠中解剖后，将一个肺叶浸入1 ml Trizol溶液（Invitrogen，15596018）中。按照制造商的说明（MP生物医学，FastPREP-24 5 g），肺部均匀化。解剖气管并将1 mL PBS浸入2-mL微输出管中（Fisherbrand，14-666-315），其中含有1个不锈钢珠（Qiagen，69989）。均质化后，将PBS匀浆以5,000克离心2分钟。将五百微晶的匀浆转移并与500μlTrizol溶液混合以进行RNA提取。通过以下步骤加工肺和气管样品：加入每1 ml Trizol试剂的200μl氯仿，并彻底涡旋。将管子在4°C下以12,000克离心10分钟。将水相转移到新的无RNase 1.5 ml管中。通过每1 ml Trizol溶液添加500μL异丙醇，并通过在4°C下以12,000g离心10分钟来沉淀总RNA。将RNA颗粒用500μl的75％乙醇洗涤一次，在室温下气干10分钟，并用100μL无RNase无RNase水溶解。使用一步primescript RT – PCR试剂盒（Takara，rr064b）对SARS-COV-2感染的肺或气管的总RNA进行一步实时逆转录PCR。进行多重PCR以检测SARS-COV-2核素基因和小鼠ACTB基因。靶向SARS-COV-2的探针用FAM荧光团标记，靶向ACTB基因的探针用CY5荧光团标记（补充表5）。在LightCycler 480仪器上进行RT – PCR。将SARS-COV-2 RNA水平归一化为ACTB。

　　使用生物分析仪（Agilent 2100，RNA 6000 Nano套件）检查了肺总RNA质量和数量。使用Truseq绞合的总RNA库准备金套件来构建测序库（Illumina，20020599）。使用SP100试剂试剂盒（V1.5，100 Cycles）在Illumina Novaseq 6000上对库进行测序。通过使用SNS RNA-Star管道分析RNA序列数据。简而言之，使用Trimmomatic（V0.36）修剪适配器和低质量碱基。测序读数使用Star Aligner（v2.7.3）映射到小鼠参考基因组（MM10）。对齐是由基因转移格式（GTF）文件指导的。使用PICARD工具（v.2.18.20）计算平均读取插入尺寸及其标准偏差。基因 - 样本计数矩阵是使用fartialecounts（v1.6.3）生成的，该基因根据其库使用DESEQ2的库尺寸因子进行了归一化，并进行了差异表达分析。使用DeepTools（v.3.1.0）生成了读取的百万（RPM）均标准化大wig文件。使用GraphPad Prism 9或Rstudio可视化数据。

　　将肺或气管的第二叶浸入1 ml PBS中，将1 ml微型离心管（Fisherbrand，14-666-315）浸入含有1个不锈钢珠（5 mM，Qiagen，1026563）中，立即解剖了SARS-COV-2感染的小鼠或Hamster。按照制造商的说明（Tastuelyser II，Qiagen，85300），将肺或气管均匀。然后将匀浆在5,000克离心2分钟，然后立即冷冻直至进行斑块测定。用在24孔板中铺路的VEOE6细胞（ATCC，CRL-1586）进行牙菌斑测定。在最小的必需培养基（Gibco，11095072）中对样品进行对数稀释，其中每孔接种200μL并在37°C下孵育1小时。然后将接种的细胞与补充有4％FBS，1％青霉素 - 链霉素 - 抑制霉素和0.2％琼脂糖的DMEM覆盖（Lonza，50100）。将覆盖的细胞在37°C下孵育48小时，然后用10％中性缓冲福尔马林固定24小时。将剩余的Veroe6细胞用20％乙醇中的0.2％晶体紫染色10分钟。

　　将附件的肺叶浸入5 mL的福尔马林溶液（Sigma-Aldrich，HT501128）中24小时，并在室温下浸入24小时，并在Leica Peloris自动处理器中通过分级乙醇，二甲苯和石蜡进行加工。根据制造商的指示，在Leica ST5020自动化的组织化学染色器上，用降血石（Leica，3801575）和eosin（Leica，3801619）染色了五微米石蜡的切片。简而言之，使用Leica Biosystems ER2溶液（pH 9.0，AR9640），在100°C下进行免疫染色的切片在100°C下进行了表位检索。Sections were incubated with one of the two ACE2 antibodies (Thermo, MA5-32307, clone SN0754 or Abcam, ab108209, clone EPR4436) diluted 1:100 for 30 min at room temperature and detected with the anti-rabbit HRP-conjugated polymer and DAB in the Leica BOND Polymer Refine Detection System (DS9800).Alternatively, sections were blocked with Rodent Block (Biocare, RBM961 L) prior to a 60-min incubation with SARS-CoV-2 nucleocapsid protein antibody (Thermo, MA1-7404, clone B46F) diluted 1:100 and then a 10-min incubation with a mouse-on-mouse HRP-conjugated polymer (Biocare MM620 H) and DAB（3,3'-二氨基苯胺）。将切片用血久毒素染色，并在Leica AT2或Hamamatsu Nanozoomer HT全滑扫描仪上进行扫描。

　　通过心脏穿刺收集小鼠血液，并使用小鼠抗SARS-COV-2抗体IgG滴定滴滴滴定血清学测定试剂盒（Acrobiosystems，RAS-T023）的稀释缓冲液稀释分离的血清。将稀释的样品与预涂层的SARS-COV-2尖峰蛋白（2μgml-1）一起添加到微板酸盐中，并在37°C下孵育1小时。3次洗涤后，将100μl的HRP-goat抗小鼠IgG（80 ng ml-1）添加到微板上，并在37°C下孵育1小时。再洗3洗后，加入100μl的底物溶液，并将37°C孵育20分钟。通过添加50μl停止溶液来停止反应，使用成像读取器（Biotek，Cytation 5仪器，GEN5软件）在450 nm和630 nm处测量吸光度。通过从A450 nm减去A630 nm来计算血清样品的吸光度值。使用一系列稀释的抗SARS-COV-2小鼠IgG对照样品生成标准曲线。使用标准曲线对小鼠血清中的抗SARS-COV-2小鼠IgG滴定进行定量。

　　RT – QPCR数据显示为平均值±S.D。三个技术重复。感染小鼠中的SARS-COV-2水平显示为平均值±S.E.M.GraphPad Prism 9用于统计数据分析。框图包含数据的25％至第75个百分位数，每个框中的水平线表示中位数，晶须代表最小值（低）和最大值（高）。在本研究中描述的每个基因组基因座中，至少重复两次MSWAP-IN工程。

　　本研究期间和/或分析期间生成的生物材料应合理的要求可从通讯作者获得。

　　所有实验程序均由NYU Langone Health的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。