S. Tokodaii Str。7，分别由T. Oshima（Kyowa Kako Co.，Ltd），T。Yokogawa（Gifu University）（Gifu University）和H. Hori（Ehime University）（Ehime University）友善地提供了7，T。Oshima（Kyowa Kako Co.，Ltd）T。Oshima（Kyowa Kako Co.，Ltd）友善地提供了7，甲烷核酸菌。Sulfolobus acidocaldarius (JCM no. 8929), Saccharolobus solfataricus (JCM no. 8930), Aeropyrum pernix (JCM no. 9820), Pyrobaculum oguniense (JCM no. 10595) and N. viennensis (JCM no. 19564) were obtained from Japan Collection of Microorganisms,Riken BRC参加了日本Mext的国家Bioresource项目。

　　S. tokodaii和S. acidocaldarius在80°C的JCM培养基中培养。165由1 g L – 1酵母提取物，1 g L – 1 casaminoin- 1.3 g L – 1（NH4）2SO4，0.28 G L – 1 Kh2po4，0.25 G L – 1 mgSO4·7H2O，0.07 G L – 1 Cacl2·2H2O，2.0 MG L – 1g l -1 g l – 1 fecl3，1.8MNCL2·4H2O，4.5 mg L – 1 Na2b4o7·10H2O，0.22 mg L – 1 ZnSO4·7H2O，0.05 mg L – 1 Cucl2·2H2O，0.03 mg L – 1 Na2mo42mo4·2h2O，0.03 mg l – 1 h2o，0.03 mg l – 1 vos and 0.03 mg l – 1 voso4 and 1 vosO4 and 1 voso4 and 1 voso4·g 2 m.4·g2 m.4·g2 mor4·g2 mor4·g 2 m.4•COSO4·7H2O（使用H2SO4调整为pH 2.5）。在JCM培养基中，在80°C培养溶液。171由1 G L – 1酵母提取物，2.5 G L – 1（NH4）2SO4，3.1 G L – 1 KH2PO4，0.2 G L – 1 MGSO4·7H2O，0.25 G L – 1 Cacl2·2H2·2H2O，1.8 mg L – 1 Mncl2 l – 1 mncl2 l – 1 mncl2·4H2O，4.5 mn.5 mn.5mg l – 1 h.5 h2 2b4·g4·na·g4·n n.5 h2 2b4·g4·n.5 h22b4·g4·n.5 h2 2b4·n.5 m12 H. 5h.0.22 mg L – 1 ZnSO4·7H2O，0.05 mg l – 1 Cucl2·2H2O，0.03 mg L – 1 Na2moo4·2H2O，0.03 mg L – 1 VOSO4·H2O和0.01 mg L – 1 coso4·coso4·7H2O（调整pH 4.0）。A.在JCM培养基中，在90°C培养Pernix。224 consisting of 1 g l–1 yeast extract, 1 g l–1 peptone, 1 g l–1 Na2S2O3·5H2O, 24.0 g l–1 NaCl, 7.0 g l–1 MgSO4·7H2O, 5.3 g l–1 MgCl2·6H2O, 0.7 g l–1 KCl and 0.1 g l–1 CaCl2·2H2O (adjusted to pH 7.0与naoh）。oguniense在JCM培养基中的90°C培养。165添加1.0 g L – 1 Na2s2O3·5H2O（使用NaOH调整为pH 7.25）。在JCM培养基中，在42°C培养了Viennensis。1004由1 g l – 1 NaCl，0.5 g l – 1 kcl，0.4 g l – 1 mgcl2·6H2O，0.2 g l – 1 kh2po4，0.1 g l – 1 cacl2·2H2O，1.0 ml l – 1 ml l – 1修饰的痕量元件（30 mg l – 1 H3bo3，100 mg l – 1 h3 bo3，100 mnccl l – 1 h3 bbo l – 1 h3，100 mn cl – 1 h3，100 mh2，190 mg L – 1 COCL2·6H2O，24 mg L – 1 NICL2·6H2O，2 mg L – 1 Cucl2·2H2O，144 mg L – 1 ZnSO4·7H2O，36 mg L – 1 Na2moo4 na2moo4 na2mOO4·2H2O和0.3％Hcl – 0.3％HCl – 1.0 min n l -l – 1.0 min l -l -l – lim limin，1.0 min nim Inin，1.0 min，20 mg l – 1叶酸，100 mg l – 1吡ido醇·HCl，50 mg L – 1硫胺素·HCl，50 mg L – 1核黄素，50 mg L – 1尼古丁酸，50 mg L – 1 DL – 1 dl-1 dl-1 dl-钙含量胆碱氯化物（用KOH调整为pH 7.0），1.0 mL L – 1 7.5 mM EDTA·Na·Fe（III）溶液（pH 7.0）， 2.0 ml L – 1 1 M NAHCO3溶液，10 ml L – 1 HEPES溶液（238.4 G L – 1 HEPES（游离酸）和24 G L – 1 NaOH），1.0 mL L – 1 1 M NH4CL溶液和1.0 mL L – 1 ML L – 1 1 1 M丙酮酸钠溶液（调节pH 7.6用NaOH调节）。

　　在严格的厌氧条件下，在83°C，87°C或91°C下培养了t. kodakarensis或在富含营养的培养基（ASW-YT-S0或MA-YT-PYR）或合成培养基中，在富含营养的培养基（ASW-YT-S0或MA-YT-PYR）或合成培养基中培养谷链球菌。ASW-YT-S0培养基包含0.8倍人造海水（ASW）50，10 g L – 1酵母提取物，5.0 g L – 1 tryptone，2.0 g L – L – 1元素硫硫和0.1％（WT/vol）resazurin。MA-YT-PYR培养基包含30.5 G L – 1海洋Art SF-1（大阪Yakken），10 G L – 1酵母提取物，5.0 G L – 1胰蛋白酶，5.0 G L – L – 1丙酮酸钠和0.1％（WT/vol）resazurin。ASW-AA-S0 medium contains 0.8× ASW, 0.5× amino acid solution50, modified Wolfe’s trace minerals (0.5 g l–1 MnSO4·2H2O, 0.1 g l–1 CoCl2, 0.1 g l–1 ZnSO4, 0.01 g l–1 CuSO4·5H2O, 0.01 g l–1 AlK(SO4)2, 0.01 g l–1H3BO3和0.01 G L – 1 Namoo4·2H2O），5.0 mL L – 1维生素混合物51、2.0 G L – L – 1元素硫和0.1％（WT/VOL）硫硫蛋白。为了培养板块，添加2.0 mL L – 1多硫化物溶液（67％Na2s·9H2O溶液中的20％元素硫）代替元素硫，并用1.0％的胶质（Fujifilm Wako Wako Wako Wako Pure Chemical Corporation）固化培养基。当选择PYRF阴性转化体时00，加入75％5-氟化酸（5-FOA）。我们将ASW-YT-S0培养基用于标准培养，MA-YT-PYR培养基进行生长比较，而ASW-AA-S0培养基用于构建基因敲除菌株。

　　为了进行小尺度的制剂（〜100-mL培养），将古细胞重悬于3 ml溶液D（4 m鸟苷硫氰酸盐酸盐，25 mM柠檬酸盐 - naOH（pH 7.0），0.5％（wt/vol）N-lauroylsarcosine sarcosine sodium和1 mm 2-mm coercaptoeto and卷和1/10卷）中乙酸钠（pH 5.3）。混合物在冰上摇动1小时，并与1/5量的氯仿混合，然后在4°C下以8,000克离心10分钟。收集上清液并与相等的氯仿混合，然后在4°C下以8,000g离心10分钟。通过异丙醇沉淀从所得的上清液中获得总RNA。以这种方式制备的总RNA通过10％的贬低页分离，然后用SYBR Gold或Toluidine Blue染色。可视化的tRNA分数包括I类和II类TRNA，并从凝胶切片中用洗脱缓冲液（0.3 m乙酸钠（pH 5.3）和0.1％（wt/vol）SDS）从凝胶切片中洗脱，然后进行过滤，以去除凝胶碎片和乙醇沉淀物，以分析TRNA级别的RNA-MS分析。

　　为了大规模制备Tokodaii的tRNA级分，将细胞颗粒（53 g）重悬于530 mL溶液D中，然后与53 mL乙酸钠（pH 5.3）和425 mL中和中和苯酚混合。在冰上摇动混合物1小时，加入106 mL氯仿/异糖（49：1），然后在4°C下以4,500g离心20分钟。收集上清液并与106 mL氯仿/异糖醇（49：1）混合，然后在4°C下以4,500g离心15分钟。收集水相，然后进行异丙醇沉淀。将收集的RNA重悬于53毫升水中，并与80 mL Tripure隔离试剂（Roche）混合，然后在4°C下以10,000g离心20分钟。收集上清液，并与36 mL氯仿/异糖（49：1）混合，然后在4°C下以10,000g离心10分钟。收集水相并用异丙醇沉淀。将制备的总RNA（608 mg）溶解在250 mL的缓冲液中，由20 mM Hepes-KOH（pH 7.6），200 mM NaCl和1 mM DTT溶解，然后在DEAE SEPHAROSE快速流柱（320-mL珠）上加载，并用200至500毫米Nacl分离。通过异丙醇沉淀收集含有tRNA的馏分。

　　由于其高融化温度，因此从嗜热生物中分离单个TRNA非常困难，这是其高G+C含量和复杂修饰的结果。因此，我们通过RCC24或Chaplet柱色谱法（CCC）52优化了RNA隔离的原始方法。S. tokodaii tRNA馏分的260 nm（A260）单位的大约200个吸光度为RCC。进行隔离过程如下：66°C下在6×NHE缓冲液（30 mm HEPES-KOH（pH 7.5），15 mm EDTA（pH 8.0），1.2 m NaCl，1 mm DTT）中进行杂交，在50°C下用0.1×NHE Buffer（0.5 mm Mm Mm Mmmm Hepha（PH）洗涤，1 mm dtt（1 mm dtt），ph。（pH 8.0），20毫米NaCl，0.5 mm DTT）和72°C的洗脱，用0.1×NHE缓冲液洗脱。通过乙醇沉淀回收洗脱的TRNA。成熟和前体TRNA通过10％贬低页面分离，并用SYBR金染色。将可视化的成熟和前体TRNA的带切掉并用洗脱缓冲液从凝胶切片中洗脱，然后进行过滤，以去除凝胶片和用乙醇的沉淀。

　　为了使轴承UP47的天然tRNA结晶，我们使用CCC52进行了大规模隔离。S. tokodaii tRNA分数（2,000 A260单位）对CCC进行了ccc，带有串联亲和力trnaval3，trnaile2和trnaphe的CCC。进行隔离程序如下：在66°C下在6×NHE缓冲液中杂交，在50°C下用0.1×NHE缓冲液分别洗涤，并在72°C下用0.1×NHE缓冲液洗脱。通过异丙醇沉淀回收洗脱的TRNA。DNA探针的序列显示在补充表6中。通过阴离子交换色谱法进一步纯化了分离的TRNAVAL3，以完全去除TRNAVAL2，如下所述。

　　为了通过RNA-MS分析tRNA碎片，用RNase T1（Epicenter或Thermo Fisher Scientific）或RNase A（Ambion）消化了孤立的tRNA或150 ng（4.5 pmol）的30 ng（900 fmol）或150 ng（4.5 pmol）（4.5 pmol）（4.5 pmol），并用线性离子trap – Orbitigrap hybrap hybrap hybrap hybrid septio septio septio septio septio septio）（如前所述，配备了定制的纳米喷离子源和无分裂的纳米PLC系统（DINA，KYA Technologies），如前所述26,27。为了分析ψ位点，将tRNA用丙烯腈处理至氰基乙二醇ψ53，并经过RNA-MS。为了在0.01UμL-1细菌碱性磷酸酶（BAP C75，Takara Bio）的存在下进行RNase T1消化的含47片（扩展数据图4A，B）。为了精确地绘制tRNA修饰，RNA片段被仪器中的CID分解。LTQ Orbitrap XL的归一化碰撞能量设置为40％。Mongo Oligo质量计算器v2.08（https://mods.rna.albany.edu/masspec/mongo-oligo）用于在CID光谱中分配产品离子。

　　为了进行核苷分析，将800 ng（24 pmol）用20 mM乙酸铵（pH 5.2）在50°C的20 mM乙酸铵（pH 5.2）中用0.09 U核酸酶P1（Fujifilm Wako Wako Pure Corporation）消化1小时，并与1 M Trimethylamine-Hcl（thylamine u ph）（ph）（ph 5.2）（pH 5.2）（pH 5.2）。（沃辛顿生化公司），然后在37°C下孵育1小时。在此混合物中，加入0.08 U BAP，并将样品在50°C下孵育1小时。之后，添加了9卷乙腈，然后进行LC -MS/MS分析，如参考文献中所述。25,54，有一些修改如下。将样品用ZIC-氨基柱（3μm粒径，2.1×150 mm; Merck）进行色谱仪，并用5 mm乙酸铵（pH 5.3）（溶剂A）（溶剂A）和乙腈（溶剂A）和乙酰乙烯酸盐（溶剂A）和苯甲酸（溶剂B），以100μl-Min – 1的流量为100μl-1％solv for 30％溶液溶液溶液：90％-50％ - 90％ - 90％50％50％50％50％，10分钟，50–90％的溶剂B持续5分钟，然后用90％的溶剂B进行初始化。色谱洗脱液被直接引入Q精确杂交四极杆 - 轨道质量光谱仪的电喷雾电离源中。

　　为了进行核苷酸分析，将800 ng（24 pmol）的tRNA级分或单个tRNA用0.09 u核酸酶P1在20 mm乙酸铵（pH 5.2）中在50°C下于50°C中消化1 h，然后与9量的LC – MS混合9量的乙腈。用ZIC-智柱色谱法分析，并通过Q精确杂交四极杆 - 轨道质谱仪（Thermo Fisher Scientific）或LTQ Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）进行多步线性梯度（Thermo Fisher Scientific）：90-50％溶剂b的均为90-50％溶剂均为5分钟的溶剂均为5分钟，50％的溶解度为50％，50％的溶解度为50％，50％的溶剂均为90％，50％的溶剂均为50％，50％的溶剂均为90％，50％的溶剂均为90-50％的溶解度。与90％的溶剂B。

　　使用Xcalibur 4.1（Thermo Fisher Scientific）分析了获得的LC -MS数据，并用帆布X（Nihon poladigital K.K）可视化。

　　S. tokodaii tRNA级分的五个A260单位被核酸酶P1完全消化。将含有PN324M5C二核苷酸的消化物对在黑暗中的冰上进行10 mM Naio4的周期氧化1小时。通过添加1 m -rhamnose和孵育30分钟来停止反应。对于β-溶态，加入了2 M赖氨酸-HCl（pH 8.5），并将样品在45°C下孵育90分钟。然后，将包含PN324P的产物与Q Sepharose快速流柱（GE Healthcare）进行阴离子交换色谱法（GE Healthcare），用20 mM碳酸氢盐（TEAB）平衡（pH 8.2）。用真空吸收的蒸发收集了带有2 M茶具的洗脱体。将沉淀溶解在水中，并与等体积的氯仿混合，然后在4°C下以20,000g离心5分钟。上清液被恢复并再次干燥。这个过程重复了五次。将所得的消化物与9体积的乙腈混合，并使用配备电喷雾电离源和HP1100 LC System（敏捷技术）的LCQ-ADVANTANDINVENTION离子陷阱质谱仪（Thermo Scientific）进行LC-MS/MS。对于LC，用Zic-hilic色谱柱（3.5μm；孔径；100Å；内径为2.1×150 mm; Merck）色谱法，并用5 mm甲酸（pH 3.4）（溶剂A）（溶剂A）和乙腈（溶剂B）以100％MIN-MIN-MIN-MIN-MIN-MINISET-1逐渐升级为1毫米–1的流量。25分钟，70–10％溶剂B持续15分钟，10％溶剂B持续5分钟，然后用90％的溶剂B初始化。

　　来自T. codakaraensis的Arki的合成基因，甲虫狂热，p。 Oguniense，Aquifex Aeolicus，Nutilia繁荣和Loptolgbya sp。PCC7376的设计是针对大肠杆菌表达优化的密码子设计，并由Geniz或Thermo Fisher Scientific合成。将每个基因克隆到PE-SUMO-TEV载体中，切片方法5 N. ventensis arki用一组总理（补充表6）从基因组DNA中放大PCR（补充表6），并将其克隆到BAMHI中，而不是PE-SUMO-TEV。

　　大肠杆菌BL21（DE3）或Rosetta2（DE3）细胞用带有每个Arki基因的PE-SUMO-TEV载体转化为250 mL或1 L的1 L lb，含有50μgml-1 kanamycin和20μgMl-1氯基苯基苯基苯甲醇。当细胞达到OD610 = 0.4-0.6时，用0.1或1 mM IPTG或2％（wt/vol）乳糖的诱导在37°C下以37°C表达His6-苏姆菌的重组蛋白3-4小时。oguniense arki在18°C培养过夜的细胞中表达。将收集的细胞重悬于裂解缓冲液中（50 mM HEPES-KOH（pH 8.0），150 mM KCl，2 mM MMGCL2，20 mM Imidazole，12％（VOL/VOL）甘油，1 mm 2-MM cercaptoeto乙醇和1 mm PMSF和1 mm PMSF），并在15,000 criffifugifufifugifugifugifugifugifugifugiffififug上被打断。将上清液在60°C煮沸20分钟（对于来自T. kodakarensis，M。Fervens，P。oguniense和A. aeolicus的Arki同源物），在4°C下以15,000g离心15,000g。重组蛋白是在Ni-Sepharose 6快速流柱（GE Healthcare）上捕获的亲和力，然后用含有300 mM咪唑的裂解缓冲液洗脱，然后用PD-10柱（GE Healthcare）凝胶过滤（GE Healthcare）去除咪唑。使用Histrap柱（GE Healthcare）纯化了Viennensis Arki的重组蛋白，其线性梯度为0-500 mM咪唑，然后使用透析使用Slide-A-A-Lyzer透析透析盒（Thermo Fisher Scientific）去除咪唑。将纯化的蛋白质在4°C下进行ULP1消化过夜，以裂解His6 – Sumo标签，然后通过Ni-Sepharose 6快速流柱以删除标签。因为来自M. Fervens（Mfarki）和Leptolyngbya sp。的Arki同源物。PCC7376（LEARKI）在删除标签后汇总的PCC7376，将这些同源物的His6-Sumo Tag粘合蛋白用于磷酸化测定法。使用BSA作为标准，通过Bradford方法对纯化的蛋白质进行量化。

　　为了大规模制备kodakarensis arki的结晶，将带有pe-sumo-tkarki的大肠杆菌BL21（DE3）菌株培养在2 L的LB中，其中含有50μgml-1 Kanamycin和Tkarki和Tkarki在25°C的诱导下以0.1 mm iptg的诱导在25°C的诱导下表达了25°C的量表。在裂解缓冲液（50 mM HEPES-KOH（pH 8.0），150 mM KCl，2 mM MGCL2，20 mM咪唑，12％（VOL/vol）甘油，1 mm 2-MM 2-苯二醇和1 mm PMSF）中，收集并通过超声处理（50 mM HEPES-KOH（pH 8.0），150 mM KCl，2 mm MMGCL2，2 mm MMGCL2，2 mm MMGCL2，2 mm MMGCL2，2 mm MMGCL2，2 mM 2 mM MGCL2，2 mM 2 mM MGCL2，2 mM 2 mM MGCL2和1 mm PMSF）。使用线性梯度为20-520 mm咪唑的线性梯度纯化蛋白质。将含有Tkarki的分数合并，并在4°C下进行ULP1消化过夜以裂解标签，然后通过Ni-Sepharose 6快速流柱进行通过，以删除标签片段。通过0.45-μmPVDF膜过滤流动部分以去除树脂。该蛋白质通过使用150-150毫米KCl的线性梯度通过HITRAP肝素HP柱（GE Healthcare）进一步纯化蛋白质。使用SuperDex 75 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare），用含有20 mM Tris-HCl（pH 8.0），150 mM NaCl和10 mM 2- ercapto乙醇的缓冲液通过SuperDex 75 10/300 GL柱（GE Healthcare）进一步纯化Tkarki，然后浓缩至5.74 mg ML – 1，并存储在–80°C下。

　　T. kodakarensis kpta基因是从T. kodakarensis的基因组DNA中放大的，并在补充表6中列出了引物，并将其克隆到PE-SUMO-TEV中，以使PE-SUMO-TEV-TEV-TKKPTA。携带PE-SUMO-TEV-TKKPTA的大肠杆菌rosetta2（DE3）菌株在含有50μgml– 1 Kanamycin和20μgML– 1氯霉素的1 Lb中培养，TKKPTA和TKKPTA在37°C中以0.1 mM ipt诱导为37°C表示37°C时，均为37°C时。如上所述，将重组TKKPTA纯化。从4742酿酒酵母的基因组DNA中扩增了编码TPT1P的基因，并在补充表6中列出了一组引物，并将其克隆到NDEI和Xhoi站点之间的PET21B（Merck）中。如上所述纯化重组TPT1P。

　　如上所述，通过酵母TPT1P去除UP47的2'-磷酸盐。将单个TRNA或tRNA级分在30°C的反应混合物（25μL）中孵育3小时，该反应混合物由20 mM Tris-HCl（pH 7.4），0.5 mm EDTA（pH 8.0），1 mm NAD+，2.5 mm绝经剂，0.1 mm dtt，0.1 mm dtt，0.9μmTrna和0.1 mm trna和0.1 mm trna和0.1 gpt。通过苯酚/氯仿处理提取tRNA，并通过乙醇沉淀回收，然后用中心隔离柱（普林斯顿分离）脱盐。为了结晶TPT1P处理的tRNA，S。

　　S. tokodaii trnaval3（25 pmol）带有或不带UP47的脱气缓冲液溶解在由50 mm Tris-HCl（pH 7.4），100 mM NaCl和1 mM MGCL2组成的脱气缓冲液中，并在80°C下孵育5分钟，然后以0.1°C的速率冷却至25°C。将样品放在8型多微米UV石英池（路径长度为10 mm）上。在紫外可见的光分光光度计（V-630，JASCO）上监测tRNA的过色度。梯度如下：25°C 30 s，在5°C min – 1，40°C下25–40°C，在0.5°C min – 1时40°C和40-105°C。使用Spectra Manager V2（JASCO）计算TM。使用Microsoft Excel生成熔融曲线。

　　S. tokodaii trnaval3（25 pmol）带有或没有UP47的tokodaii trnaval3（25 pmol）在3'末端用[5'-32p] cytidine 3''，5'-双磷酸（Perkinelmer）连接32p。将标记的tRNA分离为7.5％（wt/vol）的聚丙烯酰胺凝胶，其中含有7 m尿素，1×TBE和10％（vol/vol/vol）甘油，并通过凝胶提取纯化。将标记的tRNA与S. tokodaii tRNA分数混合为每分钟A260单位每分钟100,000的载体，并用乙醇沉淀。将颗粒溶解在水中，浓度为0.1 A260单位。对于RNase降解测定，将标记的tRNA（0.1 A260单位，10,000 c.p.m.）在65°C下在包含10 mM HEPES-KOH（pH 7.6），0.5 mM MGCL2，100 mm NACL和100 mm NACL和0.1UμL-1μL-1 Rnase I（Prome I（Prome I（Prome I）的反应混合物中，在65°C下孵育。在开始反应后的1、3、5、10、15和30分钟的时间点，从混合物中取等分试样，并与冰冷的苯酚/氯仿/异氧氨基醇（25：24：1，pH 7.9）充分混合，以停止反应，然后在4°C下以15,000g的15,000g离心。收集上清液并用等体积的氯仿处理，然后在4°C下以15,000克离心5分钟。将上清液与2×载荷溶液（2×TBE，7 M尿素，13.33％（WT/Vol）蔗糖，0.05％（WT/Vol）二甲醇和0.05％（WT/VOR）溴芬太尼蓝色）混合在一起，并施加10％贬值页。将凝胶暴露于成像板中，并使用FLA-7000成像分析仪（Fujifilm）可视化放射性。使用Microsoft Excel生成图。

　　如上所述分离的S. tokodaii trnaval3（500μg）在退火缓冲液（50 mM HEPES-KOH（pH 7.6），5 mM MGCL2和1 mM DTT中进行了重折叠，在80°C下孵育5分钟，并冷却至25°C，速率为0.1°C S-S-1 – 1 – 1 – 1。通过使用Mono Q 5/50 GL柱（GE Healthcare），线性梯度为200-1,000 mM NaCl，通过阴离子交换色谱进一步纯化Trnaval3。收集主要峰，用异丙醇沉淀，溶解在水中，并用乙醇沉淀。用与上述相同的程序制备了TPT1P处理的TRNAVAL3。将纯化的tRNA溶于缓冲液中，该缓冲液由10 mM Tris-HCl（pH 7.1）和5 mM MGCL2组成，浓度为50μm。将一微升的tRNA溶液与1μlNatrix2 No混合。32（80毫米NaCl，12 mM的精子-4HCl，40 mM cacododylate·3H2O（pH 7.0）和30％（vol/vol）MPD）（汉普顿研究）（汉普顿研究）（汉普顿研究）对硅涂层的玻璃，并通过20°C下的悬挂液滴蒸气方法结晶。

　　结晶之前，将tkarki的浓度调整为5 mg mL – 1。将一个微量的蛋白质溶液与0.5μl储液溶液混合，其中含有25％（vol/vol）乙二醇。Tkarki通过20°C的悬挂液蒸气扩散法结晶。

　　该数据集是在日本Kek的Photon工厂的Beamline BL-17A上收集的。对于Trnaval3晶体的数据收集，用储层溶液的一部分将晶体冻结。对于天然tkarki晶体的数据收集，用含有25％（vol/vol）乙二醇，2 mM MGCL2和1 mM ATP的溶液冷冻保护晶体。对于碘化衍生物Tkarki晶体的数据收集，将晶体短暂浸泡并用含有300 mM碘化钾和22.5％（Vol/vol）乙烯乙二醇的溶液冷冻保护，并以1.5Å的波长收集衍射数据集。使用XDS56对数据集进行了索引，集成和缩放。Trnaval3的初始阶段是通过用phaser57的分子替换确定的。该模型使用了嗜热链球菌（PDB，1IVS）58的结构。Tkarki的初始阶段是使用碘化离子异常信号的SAD方法确定的。碘位点由SHELX59定位，初始阶段是由Phaser计算的。通过Resolve60进行了随后的密度修改和初始模型构建。该模型用COOT61进一步修改，并用phenix62进行了完善。使用Pymol，Cuemol或Coot可视化晶体结构及其电子密度图。用DSSR软件分析TRNA的扭转角63。

　　用hitrap肝素HP色谱柱（GE Healthcare）（100 pmol）与[15n]腺苷（10 pmol）和[15n]鸟嘌呤（10 pmol）作为示踪剂分子混合，用hitrap肝素HP柱（GE Healthcare）（100 pmol）纯化Tkarki，然后加入4体甲醇，含量等于3含氯）和3耐力。通过在4°C下以15,000克离心1分钟来除去变性蛋白。将上清液在真空中干燥，并溶于20μl水中。通过LC -MS分析了一半的提取物。通过[15n] ATP和[15n] GTP的去磷酸化制备示踪剂分子：1,000 pmol [15n] ATP（Silantes）和[15n] GTP（Silantes）和[15n] GTP（Silantes）用0.04 U碱性磷酸酶（Pap。在60°C下30分钟。去磷酸化后，将PAP在95°C下变性5分钟。

　　如先前所述，kodakarensis的敲除菌株是通过弹出/弹出/弹出重组构建的64。从基因组DNA上放大了kodakarensis arki和kpta的5'和3'侧翼区域（约1,000 bp），并用一组引物（补充表6）放大了PCR（补充表6），并插入PUD3矢量中，并置于Pyrf Marker65，以产生PUD3-ARKARKI和PUD3-KUD3-KPPTA。用pud3-arki或pud3-kpta转换t. kodakarensis ku216菌株（ΔpyRf），并在不带尿酸的ASW-AA-S0板上选择了由弹出式重新组合产生的尿嘧啶 - 核营养转化体。然后将选定的菌株培养在补充5-FOA的ASW-AA-S0板上，以获得由弹出的重组形成的尿嘧啶 - 硅营养性，耐5-FOA的转化剂。通过基因组PCR选择了带有一组底漆的基因组PCR中的ARKI或KPTA的敲除菌株（补充表6）。Arki和Quee（Δarki/Quee :: Tn）的双敲除应变是通过从随机诱变库中分离出的FFH05（QUEE :: TN）的ARKI构建的。补充表7列出了本研究中使用的t. kodakarensis菌株。

　　T. kodakarensis ku216（野生型），FFH05（quee :: tn），Δarki和Δarki/quee :: TN菌株在83°C的MA-YT-PYR培养基中预先培养在夜间的MA-YT-PYR培养基中，并在8 ml新鲜的MA-YT PYR介质中接种，并具有0.01的初始OD600。在83°C，87°C或91°C下培养细胞，并通过用S1200二极管阵列分光光度计测量OD600每2小时监测细胞生长。使用Microsoft Excel生成图。

　　为了在体外转录T. kodakarensis trnaval3及其G5 – C68变体通过T7 RNA聚合酶66，使用合成DNA通过PCR构建了模板DNA（补充表6）。将TRNA在37°C下转录过夜，以40 mM Tris-HCl（pH 7.5），24 mM MGCL2，5 mm DTT，2.5 mm的精子素，0.01％（VOL/VOL）TRITON X-100，0.8μgMl-1 T7 RNA Polymase，1 nm-nm percllys，perclasse，perclasse，0.01％（VOL/vol）perclase，0.01％（体积/体积2 mM ATP，2 mM CTP，2 mM UTP，2 mM GTP和10 mM GMP，然后用苯酚/氯仿处理提取，并用PD-10柱（GE Healthcare）脱盐。以这种方式制备的体外转录本通过10％贬低的页面分离，然后用甲苯胺蓝色染色。将染色的带切出并用洗脱缓冲液从凝胶切片中洗脱，然后进行过滤以去除凝胶片和乙醇沉淀。

　　在含有50 mm Hepes-KOH（pH 7.5），1 mM MGCL2，1 mM MMNCL2，1 mM DTT，1 mm DTT，10％（VOL/VOL）甘油，0.5 mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmi的反应混合物（30μl）中，在70°C的UP47形成了Tkarki的UP47形成20分钟应变）和1μmtkarki。反应后，通过在NAP-5柱（GE Healthcare）上脱盐的酸性苯酚/氯仿提取tRNA，并用异丙醇沉淀。对于RNA-MS，将制备的tRNA透析在硝酸纤维素膜（0.025-μmVSWP，MF-Millipore，Merck）上透析2 h（滴透析）。为了检查GTP作为磷酸盐供体，将0.5 mM ATP或GTP添加到反应混合物中，并用0.5μMTKARKI进行UP47形成5分钟，然后进行RNA-MS分析。Tkarki变体的活性通过γ-磷酸盐从[γ-32p] ATP转移到TRNA的活性，类似于Tkarki的动力学研究（见下文）。在8μl反应混合物中，在70°C下在70°C下进行15分钟。为了分析，将4μL的反应混合物与4μl的2x加载溶液混合，通过10％的底面页面解决，并暴露于成像板中，以使用FLA-9000成像分析仪（Fujifilm）可视化Radiolagelled RNA。使用多仪（Fujifilm）分析凝胶图像。用R（R基础）制备具有独立图的条形图。对于总RNA的磷酸化，在由50 mM HEPES-NAOH（pH 7.5），1 mM MGCL2，1 mM MM MNCL2，1 mM DTT，1 mm DTT，10％（Vol/vol）Glycerol，Glycerol，100μm[γ-32PP（3）p（32 c.-32pp）中，在70°C下进行30分钟进行反应30分钟30分钟。1.8μMTKARKI和50ngμl -1总RNA分数（来自T. kodakarensisΔarki菌株）。然后，加入0.5μl的50 mM EDTA（pH 8.0），并将4μl反应混合物与2倍载荷溶液混合，通过10％变性页解决，并如上所述可视化。

　　在含有50 mm pipes-naOH（pH 6.9），125 mm NaCl，1 mm mgcl2，1 mm MNCL2，1 mm MNCL2，1 mm dtt，1 mm dtt，10％BS glycerol，5AMMM MM，glycerol，5AMMM MM，在70°C（30μl）中，在70°C的其他Arki同源物形成30分钟的UP47形成30分钟（Takara），1μMTRNA转录本和0.5μMARKI蛋白。对于NVarki，反应温度设置为45°C。对于来自N. profundicola（Nparki）的Arki同源物，在50°C进行60分钟进行反应。反应后，如上所述制备tRNA。为了进行页面分析，在包含50 mM Pipes-NaOH（pH 6.9），125 mM NaCl，1 mM MGCL2、1 mM MMNCL2、1 mM MM DTT，1 mM DTT，10％（VOL/vol/vol/vol/vol）甘油，100μm[γ-32P] ATP（3γ-32P] ATP（3,000MC）的反应混合物（8μL）中进行UP47形成。0.1 mg ML – 1 BSA（Takara），0.75μM重组ARKI同源物（NPARKI，NVARKI或LEARKI）和50ngμl -1 E. e.coli总RNA。然后，将反应混合物与2倍加载溶液混合，通过10％贬低页面解决，并如上所述可视化。

　　Dephosphorylation of Up47 by TkKptA was carried out at 60 °C for 1 h in a reaction mixture (30 μl) containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.5 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM NAD+, 2.5 mM spermidine, 0.1 mM DTT, 0.9 μM T. kodakarensis tRNA fraction and0.1μgμl -1重组TKKPTA。反应后，通过在NAP-5柱（GE Healthcare）上脱盐的酸性苯酚/氯仿提取tRNA，并用异丙醇沉淀。对于RNA-MS，如上所述，制备的tRNA通过滴透析脱盐。

　　通过从[γ-32p] ATP转移到tRNA，对Tkarki介导的UP47形成进行了定量。For kinetic measurement of the tRNA substrate, tRNA phosphorylation was performed at 70 °C in a reaction mixture (25 μl) consisting of 50 mM PIPES-NaOH (pH 6.9), 125 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM DTT, 10% (vol/vol) glycerol, 100 μM [γ-32P]ATP（1,500 MCI MMOL – 1; Perkinelmer），0.05 mg ML – 1 BSA（Takara），0.05μmTkarki和0.1-5.0μm的体外转录T. kodakarensis trnaval3。对于ATP底物的动力学测量，将ATP浓度从15.6μm[γ-32p] ATP（750 MCI MMOL – 1; PerkinElmer）变化，而tRNA浓度增加到1.0μm。在每个时间点（2和5分钟），取8μl等分试样，并与相等体积的2x载荷溶液（7 m尿素，0.2％（WT/vol）溴苯酚蓝色，0.2％（WT/Vol）二甲醇和50 mm EDTA（pH 8.0））混合，以淬灭反应。每个样本均经过10％的贬低页面。将凝胶暴露在成像板上，使用FLA-9000成像分析仪测量放射性标记的TRNA。使用Prism 7（GraphPad）计算动力学参数。

　　通过测量tRNA的放射性降低来量化TKKPTA介导的UP47的去磷酸化。如上所述，在体外转录的T. kodakarensis trnaval3用[γ-32p] ATP磷酸化，然后通过凝胶提取和异丙醇沉淀纯化。另外，通过未标记的ATP将同一tRNA磷酸化。通过混合标记和未标记的TRNA，将标记的TRNA的特定活性调节至6,250 c.p.m.每个PMOL的缓冲液中，由50 mM HEPES-KOH（pH 7.6），5 mM MGCL2和1 mM DTT组成。将标记的tRNA在80°C孵育5分钟，然后在室温下冷却，然后在异丙醇沉淀下孵育。将标记的tRNA溶解在水中为8μm（每μl50,000c.p.mm）。Dephosphorylation of the labelled tRNA by TkKptA was performed at 70 °C in a reaction mixture (30 μl) consisting of 50 mM PIPES-NaOH (pH 6.9), 125 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM DTT, 10% (vol/vol) glycerol, 1 mM NAD+, 0.05 mg ml–1 BSA（takara），1 nm tkkpta和12.5–800 nm 32p标记的tRNA。在每个时间点（2和5分钟），在Whatman 3mm滤纸上发现了8μl等分试样，该滤纸立即浸入5％（wt/vol）三氯乙酸中。将滤纸用冰冷的5％（wt/vol）三氯乙酸洗涤3次，持续15分钟，用冰冷的乙醇冲洗5分钟，并在空气中干燥。通过液体闪烁计数（Tri-Carb 2910TR，Perkinelmer）测量滤纸上的放射性。动力学参数是使用Prism 7计算的。

　　N. viennensis arkI was PCR amplified and cloned into pMW118 (Invitrogen) under the control of the synthetic constitutive J23106 promoter67,68, followed by insertion of sequences encoding a His6 tag and a 3×Flag tag at the C terminus of the N. viennensis arkI gene, yielding pMW-J23106-nvarkI (Supplementary Table7）。将T. kodakarensis kpta，大肠杆菌KPTA和酿酒酵母TPT1放大并克隆到PQE-80L（Qiagen）中。氨苄青霉素耐药盒（AMPR）被氯霉素耐药性盒（CAMR）代替，分别产生PQE-80LC-TKKPTA，PQE-80LC-ECKPTA和PQE-80LC-SCTPT1（补充表7）。用PMW-J23106-NVARKI转化大肠杆菌ΔTRMBΔTAPT（KANR）菌株，并用PQE-80LC-TKKPTA，PQE-80LC-ECKPTA或PQE-80LC-SCTPT1进一步转化。将转化体接种在3 mL lb中，补充了20μgml– 1氯霉素，50μgml-1 – 1 kanamycin和100μgml-1氨基酸氨基酸氨基霉素，并在37°C培养直至中G相。当OD610达到0.6时，将IPTG添加到10或100μM的最终浓度中，以诱导KPTA/TPT1P同源物的表达，并将细胞培养3.5 h。采用1.5 ml等分试样，并通过shot弹枪RNA-MS提取并分析tRNA级分。使用的底漆，大肠杆菌菌株和所使用的质粒在补充表6、7中列出了具有独立图的条形图（r基础）。

　　使用化学结构绘图工具绘制化学结构，包括ACD/Chemsketch（ACD/Labs）或ChemDraws（Perkinelmer）。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。