这项研究招募了十名黑色素瘤，一名患有乳腺癌和皮肤鳞状细胞癌的患者，并使用样品来建立TIL和匹配的癌细胞系（同类菌群A；补充表1）。参与者在Yamanashi大学医院，Chiba University Hospital，Shinshu University Hospitals或Saitama医科大学国际医学中心进行了手术切除。如前所述，对肿瘤组织进行处理。60。简而言之，在室温下，将手术切除的样品用0.1％胶原酶，0.01％透明质酸酶和30 U ML – 1脱氧核糖核酸酶（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Thermo Fisher Scientific）在室温下消化。使用前，对消化的肿瘤细胞进行过滤和密度梯度分离。通过捐赠的血液和ficoll-泌尿密度梯度离心获得外周血单核细胞。所有参与者均提供了书面知情同意。

　　除上述肿瘤样品外，还从其他三组参与者那里获得了FFPE组织样品进行mtDNA突变分析。队列B包括95例用抗PD-1单克隆抗体和/或抗CTLA-4单克隆抗体作为一线治疗的黑色素瘤患者。2014年至2020年间，从2014年至2020年，在2014年至2020年之间，在2014年至2020年之间获得了FFPE组织样本。C1队列C1包括86例用抗PD-1单克隆抗体单药治疗作为一线治疗的NSCLC患者。2017年至2021年之间，从千叶大学医院，冈山大学医院和Kindai大学医院获得了FFPE组织样本（扩展数据表1）。队列C2组成56例NSCLC患者，用铂二刺细胞毒性化学疗法治疗，没有任何ICI作为一线治疗。FFPE组织样本是在2011年至2012年之间从千叶大学医院，冈山大学医院和Kindai大学医院获得的（补充表3）。有关参与者的临床信息是从他们的病历中获得的。患者在我们机构的网站上选择了知情同意。

　　这项研究的协议得到了Yamanashi大学医院，Chiba大学医院，Shinshu大学医院，冈山大学医院，Kindai大学医院和Saitama医学大学国际医学中心的适当机构审查委员会和伦理委员会的批准。这项研究是根据赫尔辛基宣言的原则进行的。

　　进行了与匹配的LCL细胞，外周血和/或同类A的癌细胞的TIL的总mtDNA测序。使用Qiamp DNA迷你试剂盒（Qiagen）从这些细胞中分离mtDNA。我们还收集了来自95例黑色素瘤患者（B）患者和142例NSCLC患者（C1和C2队列）的FFPE肿瘤样品，并匹配了45例MTDNA测序的45例患者的正常组织样本。在FFPE样品中标记了肿瘤含量高的区域，并使用Generead DNA FFPE试剂盒（Qiagen）分离了来自这些区域的mtDNA。精确ID MTDNA全基因组面板（Thermo Fisher Scientific）使用81个引物对扩增整个mtDNA序列，然后在离子洪流质子测序仪（Thermo Fisher Scientific）上进行库构造和测序。在使用基核（带有参数设置 - 三体式 - Qual-Cutoff 15 - barcode-filter-minreads 10-强调剩余过滤器= 2.0-强调 - 最大级别2 - 单填充1000-轻纸滤波器1000）的序列序列的combride combride combride combride combride combride combride combride combride combride combride combride combride combride complive complife complife complife complife complife compecece，（v.5.12.3; -i bam -v -y -u -u -prefix -exclude 5 – o 2 stage1 map4）生成二进制对准图以进行后续分析。对于每个样本，在线粒体模式下使用基因组分析工具包（v.4.1.8）中使用Mutect2调用变体，并以读取过滤器标记为重复的禁用。使用grch38.p14作为SNPEFF（v.5.1d）61的参考，对检测到的变体进行注释，并受到Eagle（V.1.1.1）62的其他候选验证。由Eagle计算的等位基因频率（-hetbias = 0和–Omega = 1E-6）用作后续变体分析的基础。

　　在所有样品中汇总Eagle结果后，我们使用了从每个位置的变体等位基因频率（VAF）确定的Z分数作为度量，以评估潜在变体。选择了Z分数> 3，VAF> 0.2和读取深度超过100的变化，以最大程度地减少从测序误差中的假阳性。在B，C1和C2的队列中，最初认为具有VAF> 0.85的变体被认为是多态性的，并在最终报告中排除在最终报告中，假设躯体变异体在收集的标本中没有大量的非癌细胞中的大量非癌细胞表现出很高的VAF。Haplogrep（V.2.4.0;具有17_FU1门将的Kulcyznski分类模式，10个顶命中，扩展的最终输出和设置为0.85）63的异质级别用于表征单个病例的潜在单倍型，并从我们的基于频率的选择标准中识别出可能的不保证的SNP。标记为“热点”和“本地私人变体”的变体被视为多态性变体。对过滤的变体进行视觉检查，以排除PCR扩增子末端或均聚物序列中的可能的测序误差。为了进行性能评估，我们通过对匹配的肿瘤和正常组织样品的配对分析（n = 45）的配对分析，比较了真实变体的存在，与仅从肿瘤样品中称为变体。使用这些标准，将真实变体的假阳性速率为0％，假阴性率为12.2％。

　　在队列A中，如果样品具有LCL，PBL，TIL和/或癌细胞测序数据，则将结果与LCLS或PBL进行比较，作为躯体调用的对照。如果在匹配的LCL中存在TIL或癌细胞中的突变，则不会将其视为躯体。使用此标准，在TIL和癌细胞中证实了十个mtDNA突变（补充表1和2）。在B，C1和C2的队列中，我们从237个FFPE肿瘤样品中确定了158种变体，包括48个frameSHIFT和110个替代变体（补充表4）。对于每个样本，总体mTDNA变体状态被归类为截断，错义，无声，tRNA，rRNA，d-loop或基因间位点。对于生存分析，如果样品出现截短，错义，tRNA或rRNA变体（黑色素瘤，32.6％； NSCLC（C1），51.2％； NSCLC（C2），35.7％），35.7％），35.7％）和mtdna-Mutations-no no d-none no d-none或dymen no no no no no no none或d-noien no no no no none或d-noien或d-none noien或dimen，则将样品分为mtDNA-阳性阳性。

　　为了建立癌细胞系，将1×107消化的肿瘤细胞培养在含有10％FBS（Cytiva），1％青霉素 - 链霉霉素（PS）和1％两性霉素B（Thermo Fisher Scientific）的RPMI1640培养基中。肿瘤细胞在大约80–90％的汇合处传递，并在没有成纤维细胞并在第十段以外增殖时使用。为了建立和扩展培养的TIL，将肿瘤消化物在补充的RPMI1640培养基中孵育，其中补充了10％的人类AB血清，1％PS和重组的人白介素2（RHIL-2：6,000 IU ML – 1，peprotech），在一个混合的37°C浓度与5％CO2中孵育。将一半的培养基从井中吸出，并每2-3天用新鲜的完整培养基和RHIL-2取代。

　　MC-38细胞系（小鼠结肠腺癌）购自B16F10（小鼠黑色素瘤），MCF7（人类乳腺癌），MDA-MB-231（人类乳腺癌）和Jurkat（人类T细胞性白血病），从美国类型培养物收藏（ATCC）购买。如前所述17,64,65，从小鼠刘易斯肺癌中建立了LLC/P29和LLC/A11（小鼠肺癌）细胞系。MCF7，MDA-MB-231，MC-38，LLC/P29和LLC/A11细胞在Dulbecco修改后的Eagle的培养基（DMEM； Thermo Fisher Scientific）中保持在RPMI1640培养基中，其中含有10％FBS和1％PS中的RPMI1640培养基中，在hunified 37 croun中培养了rpmi1640培养基。MTDNA缺乏的Jurkat（Jurkat/Rho0）细胞是通过在存在200 ng ML – 1溴化乙锭的情况下培养Jurkat细胞6周产生的，然后在含有10％FBS的RPMI1640培养基中保持10％FBS，1％PS，1％PS，1％PS，100μgml-1 ps ps，100μgml-1 pyml-1 pyml – 1 sodium pyruvate和pyruvate sodium pyruvate和50μgml-1°1 nour-1 nourine。

　　在确认它们不含分枝杆菌后，使用了所有细胞系，根据制造商的说明，使用PCR支原体检测试剂盒（Takara）对其进行了评估。

　　对于固定前，将细胞样品浸入0.1 M PBS，pH 7.4中，含有2％的戊二醛和2％多聚甲醛，持续16-18小时。固定后用2％四氧化剂进行1.5 h。用PBS洗涤后，样品在分级乙醇级数中脱水，并嵌入低粘液性树脂中（垃圾树脂，polysciences）。随后，使用超小感组（EM-UC7； Leica）制备80 nm厚的切片，并用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用透射电子显微镜（H-7650，Hitachi）观察样品。我们计算并量化了每个线粒体的Cristae数量。

　　PCDNA3-TFR-OVA（Addgene，64600）66，PBABE-PURO（1764）67和PVL-MITODSRED（44386）68购自Addgene。根据制造商的说明，使用融合式快照组件（Takara Bio）将TFR-OVA cDNA克隆到Pbabe-puro矢量中。使用Lipofectamine 3000试剂（Thermo Fisher Scientific）将所得的PBABE-PURO-TFR-ova载体转染到包装细胞中。用包装质粒（PMDLG/PRRE，ADDGENE，12251（参考文献69）； PRSV-REV，Addgene，12253（参考文献69）；和PMD2.G，Addgene，12259）将PVL-Mitodsred载体转染（PMDLG/PRRE，ADDGENE，12251； PRSV-REV，ADDGENE，12253（参考文献69）；48小时后，将上清液浓缩并转导至细胞系MEL02，MEL04，MELC03，MCF7，MDA-MB-231，B16F10，LLC/P29和LLC/A11。转染的细胞系被命名为MEL02-MITODSRED，MEL04-MITODSRED，MELC03-MITODSRED，MCF7-MITODSRED，MDA-MB-231-MITODSRED，B16F10-MITODSRED，B16F10-OVA，LLC/P29-MITODSRED，LLC/A11-MITODSRED，LLC/A11-MITODSRED。还生成了LLC/P29-OVA-MITODSRED和LLC/A11-OVA-MITODSRED细胞系。

　　毛细血管测序和几种引物用于检查细胞系和TIL中mtDNA的状态（补充表5）。为了进行单细胞测序，在96孔板中制备了Primest GXL DNA聚合酶（Takara）和底漆，以在细胞分类前进行测序。使用细胞分选仪（FACSMELODY； BD BIOSCIENCES）将CD3+ CD45+ T细胞从单细胞水平的TIL分为96孔板。通过PCR扩增寡核苷酸并测序（Eurofins基因组学）。

　　TIL04＃9和MEL04细胞分别用Mitotracker Green（Thermo Fisher Scientific）和Mitodsred标记。24小时后，将2×105 mel04-mitodsred细胞与标记为1×106 TIL04＃9细胞在35毫米玻璃底培养碟中进行了2天，并在没有固定固定的Leica TSC SP8共聚焦激光显微镜（Leica Microsystems）下观察到。TIL04＃9细胞用BV421偶联的单克隆抗体（克隆HI100，Biolegend）标记。

　　为了进行延时成像，将2×105 MEL04-MITODSRED细胞接种到共培养前24小时前24小时的35毫米玻璃底培养皿中，并允许粘附。第二天，启动了带有Mitotracker绿色标记的1×106 TIL04＃9细胞的共培养物。二十四小时后，我们开始使用数字全息显微镜（3D Cell Explorer CX-A，纳米液）捕获每30分钟捕获图像。使用斐济软件（https://imagej.net/software/fiji）分析图像。

　　为了量化线粒体从癌细胞转移到tils，将MEL04-Mitodsred细胞与TIL04＃9细胞共培养为1、2、3或14天，使用或没有10 mm NAC（Cayman Chemical），20 nm USP30抑制剂（CMPD-39; MedchemExpress）或Sirnas for USP30 transfection（siuspress）或Sirnas Transfection（sius sirnas insp39; medchemexpress）（siuspress）抑制剂（siuspress）usp30 transfection sius transfection（siut sirnas）caaaaggucaucagguaaggcta;使用siRNA时，我们每5天准备每5天siRNA转染的癌细胞，并与TIL共培养，以取代旧的，转染的癌细胞。根据制造商的方案，使用脂三感胺Rnaimax试剂（Thermo Fisher Scientific）进行癌细胞的siRNA转染。为了量化线粒体转移，将MEL02-MITODSRED或MEL04-MITODSRED细胞与TIL（TIL02，TIL04＃9或TILC04）共培养2天。科学），350 nm TNT抑制剂（细胞裂质B; Wako），1μm小EV释放抑制剂（GW4869； Cayman Chemical）和/或5μmmicroev释放抑制剂（Y-27632; Medchemexpress）30，带有或不带有细胞培养物培养物培养物，以避免使用或不带有细胞培养物插入30次或0.4°4°4°4°4°4°4°4°;在多孔板中，Thermo Fisher Scientific）。随后，通过流式细胞仪分析了TIL。

　　为了量化线粒体从T细胞到癌细胞的转移，我们使用了表达线粒体特异性荧光（mito-dendra2）的ot-1和伪造的小鼠，这些小鼠是从杰克逊实验室获得的（补充图2）。通过或不含CD8+ T细胞的OVA过表达的LLC/A11细胞来自Phamexccisted OT-1小鼠的CD8+ T细胞3天。之后，将浮动T细胞丢弃，并用PBS反复洗涤LLC/A11细胞。随后通过流式细胞仪为CD45细胞分析这些细胞。

　　为了量化T细胞中的原位线粒体，将TIL04＃9细胞用Mitotracker绿色标记24小时，然后与带有或没有10 mM NAC的MEL04细胞共培养3天。为了抑制线粒体，每12小时加入100 nm线粒体抑制剂（Bafilomycin a1; adipogen Life Sciences）3天。随后，通过流式细胞仪分析了TIL。

　　过表达OVA的LLC/A11细胞或MEL04细胞用Mitotracker绿色标记。24小时后，分别将来自OT-1小鼠或TIL04＃9细胞的CD8+ T细胞共培养为3天。然后丢弃浮动T细胞，并用PBS反复洗涤过过表达OVA的LLC/A11细胞或MEL04细胞。然后，通过流式细胞仪分析这些细胞为CD45-细胞。

　　将TIL04＃9细胞与Mel04-Mitodsred细胞共培养14天，然后对DSRED-细胞和DSRED+ CD3+ T细胞进行排序。然后使用RNeasy Plus迷你试剂盒（QIAGEN）提取总RNA，并使用Prime-script RT Master Mix（Takara）将100 ng总RNA反向转录到cDNA中。根据制造商的说明，使用Powerup Sybr Green Master Mix进行实时PCR。对于每个样品，将BNIP3，ATF4，IL6，CXCL8和IL1B与ACTB（用作内部对照）的ΔCT计算为ΔCT= CT（BNIP3，ATF4，IL6，IL6，CXCL8或IL1B） - CT（ACTB）。DSRED - 细胞和DSRED+TIL04＃9细胞与TIL04＃9细胞的ΔΔCT被计算为ΔΔCT=ΔCT（DSRED-或DSRED+TIL04＃9细胞） - ΔCT（TIL04＃9细胞）。引物在补充表5中列出。

　　TIL04＃9细胞用Mitotracker绿色标记。二十四小时后，将TIL04＃9细胞与Mel04-Mitodsred细胞共培养3天，使用或不含10 mM NAC。随后，将细胞用LC3B特异性多克隆抗体（ProteIntech，Rosemont，18725-1-AP）进行染色，然后用APC偶联的二级抗体（山羊抗兔IgG，ABCAM，ABCAM，AB130805）进行染色，并在共同体监视器或分析下观察。我们使用了10μM羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯基氢氮酮（FCCP）（Selleck Biotech）作为阳性对照。

　　我们从USCS Xena数据库（https://xenabrowser.net）的基因组数据共享数据门户中获得了来自癌症基因组图集（TCGA）的RNA测序表达数据。使用了肿瘤组织中的USP30，USP33和USP35表达数据。

　　TIL04＃9细胞用Mitotracker绿色标记，并与Mel04-Mitodsred细胞共培养3天。随后，使用AF546偶联的抗ISP30单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，SC-515235，B-6）或抗USP30多克隆抗体（ProteIntech，15402-1-AP）使用APC-Conoccy-Conoccy seconcodected Modoccode染色（SC-Cruz Biotechnology，SC-515235，B-6）对TIL04＃9细胞进行染色。激光显微镜或通过流式细胞仪分析。

　　根据制造商的说明，使用总外泌体分离试剂（Thermo Fisher Scientific）分离细胞培养基中的电动汽车。简而言之，将1×106个细胞培养在含有10％EV缺乏FBS（系统生物科学）的RPMI1640培养基中3天。将条件培养基以400克离心5分钟以去除细胞，将上清液以2,000g离心30分钟以去除细胞碎片。上清液通过注射器过滤器（0.45μm孔；北美GVS），然后与0.5体积的总外泌体分离试剂混合，并在4°C下孵育过夜。然后将混合物通过注射器过滤器（0.22μm孔），并在4°C下以10,000g的超速离心60分钟。根据制造商的说明，将颗粒重悬于PBS中，并使用微型EV尺寸排斥色谱柱（HBM-MPEV-10，Hansabiomed Life Sciences）进行纯化。最终的EV（大小小于200 nm）用于蛋白质印迹实验。简而言之，我们将CD9和TSG101用作EV Markers70。为了评估含FBS的中源性电动汽车的纯度，我们检查了BSA71。我们还评估了细胞色素C作为线粒体蛋白。

　　我们使用DCFDA/H2DCFDA细胞ROS分析套件（ABCAM）来检测ROS。简而言之，将PBL04细胞和MEL04细胞与20μMDCFDA溶液在37°C的5％CO2中孵育30分钟。接下来，我们从细胞中提取和纯化的电动汽车，并通过PS捕获外泌体流式细胞仪试剂盒（WAKO）通过流式细胞仪进行分析，以创建EV偶联的珠。

　　来自MEL02，MEL04，MCF7和MDA-MB-231细胞的细胞裂解物，MEL02和MEL04细胞的EV裂解物，以及用于MEL02和MEL04细胞培养的培养基通过SDS-PAGE分离，并将其印迹到多氯乙烯氟化物膜（Merck Millipore）上。将膜封闭，然后与原代抗体一起孵育。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育。最后，使用Clarity Western ECL底物（Bio-Rad）或Immunostar LD（WAKO）检测到这些条带，并使用LAS4000系统（Cytiva）确认。根据制造商的仪器，使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）评估了每个样品中的蛋白质浓度并相互调整。

　　线粒体活性测定试剂盒（复合物I，II和III和IV）购自Cayman Chemical。根据制造商的说明，使用线粒体分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对线粒体分离的线粒体蛋白分离。我们根据制造商的说明，将活性缓冲液与分离的线粒体蛋白代替了提供的线粒体，如前所述72。使用FlexStation 3微板读取器（分子设备）在25°C下进行反应，每30 s读数15分钟在冈山大学医学院中央研究实验室进行。

　　我们将野生型MtDNA TIL04＃9或TILC03＃5细胞与黑色素瘤（Mel02-Mitodsred，野生型； Mel04-Mitodsred，突变； Melc03-Mitodsred，突变）或乳腺癌（MCF7-Mitodsred，McF7-Mitodsred，MDA-MITODSRED； MDA-MITYS RESTED; MDA-MITSED pERSED; mDa-MITODSRED; mDA-MITODSRED; mDA-231 MITODSRED，突变，突变）根据DSRED表达。The sorted TILs were named as follows: DsRed−TIL04#9/02 (wild type), DsRed+TIL04#9/02 (wild type), DsRed−TIL04#9/04 (wild type), DsRed+TIL04#9/04 (mutated), DsRed−TIL04#9/MCF7 (wild type), DsRed+TIL04#9/MCF7 (wild类型），DSRED -TIL04＃9/MDA（野生型），DSRED+TIL04＃9/MDA（突变），dsred -tilc03＃5/02（野生型），DSRED+TILC03＃5/02（野生型），dsred -tilc03＃5/C03（野生型）和DIL+TIL+TIL+TILC03＃）然后分析这些til。

　　从健康供体的PBL中进行分选的CCR7HighCD45RAHIGHCD8+ NAIVE T细胞与MEL02-Mitodsred细胞或MEL04-MITODSRED细胞共培养7天，而在RHIL-15（50 ng ML-1）的存在下，将抗CD3单克隆单克隆抗体（50 ng ml – 1）刺激。（10 ng ML – 1，peprotech）和RHIL-2（300 IU ML – 1）。通过流式细胞仪分析了中央记忆分数和KLRG1表达水平。每个CD8+ T细胞分数（幼稚，CCR7-HIGHCD45RAHIGH；中央记忆，CCR7-HIGHCD45ROROW；效应器记忆，CCR7LOWCD45ROROW；终末区分效应子记忆，CCR7LOWCD45RAHIGH）从健康的供体中排序了健康的供体的PBL，也与4天的细胞供应4天或Mel02 sods for Mel02 MISRED或MER02 MITOD，单独存在IL-2（300 IU ML – 1），并通过流式细胞仪分析凋亡。

　　从1×106 MEL02（野生型），MEL04（突变），MCF7（野生型）和MDA-MB-231（突变的）细胞中分离线粒体，该细胞使用线粒体隔离试剂盒（根据制造商的指导），使用线粒体隔离试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行线粒体隔离试剂盒。将分离的线粒体添加到Jurkat/Rho0细胞中，随后在离心后24小时孵育（2,000g持续15分钟）。该过程每周重复四次。使用上述方案分离的电动汽车使用EV-CONTRY系统（系统生物科学）添加到Jurkat/Rho0细胞中，该系统在4°C下立即在1,500G下以1,500G离心15分钟，并孵育过夜。将这些EV转移的Jurkat/Rho0细胞培养6周，每5-7天重复一次此过程。

　　在通过PCR和MTDNA测序确认线粒体转移后，将转移的Jurkat/Rho0细胞培养为RPMI1640培养基中的Rho+细胞，其中含有10％FBS和1％PS，而没有丙酮酸钠和尿素。我们还使用人线粒体DNA（mtDNA）监测引物套件（Takara）和Powerup Sybr绿色主混合物（Thermo Fisher Scientific）进行了实时PCR来量化mtDNA，并根据制造商的仪器进行了调整，并将量调整为彼此。简而言之，该底漆集计算2ΔCT值为从ΔCT（mtDNA：ND1 - 核DNA：SLCO2B1）和ΔCT（mtDNA：ND5：ND5 - 核DNA：SERPINA1）的相对mtDNA拷贝数。然后，我们计算了MTDNA拷贝数相对于父母Jurkat细胞的倍数变化。The Rho+ cells containing mitochondria derived from MEL02, MEL04, MCF7 and MDA-MB-231 cells or EVs derived from MEL02 and MEL04 cells were named Rho+MEL02-Mito (wild type), Rho+MEL04-Mito (mutated), Rho+MCF7-Mito (wild type), Rho+MDAMB231-Mito (mutated),RHO+MEL02-EV（野生型）和Rho+Mel04-EV（突变）细胞。该程序在补充图4中进行了简要总结。

　　用200 NM Mitotracker深红色和绿色染色，在37°C下在5％CO2中孵育15分钟，然后通过流式细胞仪进行分析。根据每个MFI4的比率评估膜电位。此外，将每个Jurkat细胞用250 nm TMRE（Thermo Fisher Scientific）染色，在37°C的5％CO2中孵育20分钟，然后通过流式细胞仪进行分析。

　　根据制造商的说明，使用通量分析仪（Seahorse XF HS Mini，Agilent Technologies）进行代谢分析。简而言之，将0.8×105个细胞接种在补充的海马XF RPMI培养基中，其中含有1 mM丙酮酸，2 mM谷氨酰胺和10 mM葡萄糖（pH 7.4），在聚赖斯氨基涂层的XFP微型中，然后在室温下在200G时以200g偏心。然后将板在37°C下在没有CO2的孵化器中平衡40分钟。用顺序注射寡霉素（1μM），FCCP（0.75μM）和Rotenone-抗霉素A（0.5μM）评估氧的消耗率。通过顺序注射葡萄糖（10 mM），寡霉素（1μM）和2-脱氧 - 葡萄糖（50 mM）评估细胞外酸化率。用顺序注射寡霉素（1.5μM）和触甲酮 - 抗霉素A（0.5μM）评估了ATP的产量。所有化学品均购自安捷伦技术。所有数据均标准化为单元格数。

　　为了评估ROS的产生，我们使用了DCFDA/H2DCFDA细胞ROS分析试剂盒（ABCAM），如上所述。

　　根据制造商的说明，使用细胞衰老检测试剂盒（Dojindo）评估细胞衰老。简而言之，将细胞与Bafilomycin A1在37°C的5％CO2中孵育1小时，然后与蜘蛛-β-GAL孵育30分钟，并通过流式细胞仪进行分析。

　　通过将膜联蛋白V（Thermo Fisher Scientific）和Ebioscience固定的可活力染料Efluor（Thermo Fisher Scientific）结合起来来评估凋亡。根据制造商的说明，每个细胞在室温下与膜联蛋白V和Efluor一起孵育15分钟，然后通过流式细胞仪进行分析。根据使用CFSE细胞增殖试剂盒（Thermo Fisher Scientific）和流式细胞仪来评估用羧基氟烷基酯（CFSE）标记的细胞稀释细胞的细胞增殖。将细胞与10μMCFSE在37°C的5％CO2中孵育20分钟，用RPMI培养基洗涤3次，并孵育3天，然后进行其他活/死细胞染色和流式细胞仪分析。

　　细胞（103）在96孔板上传递后24小时，每6小时使用Incucyte Zoom系统（Essen Bioscience）评估体外细胞增殖，持续48小时。

　　雌性C57BL/6J小鼠（6-8周大）购自日本SLC。C57BL/6J- PRKDCRiken BRC通过日本教育，文化，体育，科学，科学和技术/医学研究与开发机构的国家生物库项目提供/RIKEN BRC提供/RBRC小鼠（B6 SCID）。从杰克逊实验室购买了OT-1，CD4CRE和TFAMFLOX的小鼠（TFAM；线粒体转录因子A）。大鼠抗小鼠PD-1单克隆抗体（RMP1-14）和抗小鼠CD8β单克隆抗体（Lyt 3.2）是从Bio X细胞中获得的。对照大鼠IgG2a单克隆抗体（RTK2758）获自Biolegend。

　　LLC/P29-Mitodsred细胞（5×104）或LLC/A11-Mitodsred细胞（1×105）下层次接种到C57BL/6J或B6 SCID小鼠中。为了确认转移，在接种肿瘤后21或42天收集肿瘤以收集tils进行评估。为了治疗，使用长直径和短直径的平均值来产生肿瘤生长曲线。当肿瘤体积在第14天达到约100 mm3时，抗PD-1单克隆抗体（每只小鼠200μg）或对照单克隆抗体每3天进行3次。对于CD8+ T细胞的耗竭，腹膜内腹膜内1天腹膜内给予抗CD8β单克隆抗体（每只小鼠100μg），然后每7天注射一次。每2天，将EV释放抑制剂GW4869（每只小鼠60 µg）注射一次。肿瘤接种后42天收集肿瘤以通过流式细胞仪评估tils。此外，将收集的tils用于DSRED+细胞并培养7天，然后通过流式细胞仪或mtDNA测序进行评估。

　　同样，我们使用B6 SCID小鼠创建了产物T细胞传输模型。简而言之，从C57BL/6J或OT-1小鼠的脾细胞中排序的CD8+ T细胞（1×107）在肿瘤接种后7天转移到SCID小鼠中（LLC/P29-OVA-MITODSRED，1×105； 1×105; LLC/A11-OVA-OVA-MITODSRED，3×105）。肿瘤接种后28天收集肿瘤以通过流式细胞仪评估TIL。

　　将MC-38（1×106）或B16F10-OVA（3×105）细胞皮下接种到TFAMFL/FL小鼠或TFAMFL/FLCD4CRE小鼠中，并每3天监测肿瘤体积。长直径和短直径的平均值用于产生肿瘤生长曲线。抗PD-1单克隆抗体（每只小鼠200μg）或对照单克隆抗体每3天进行3次腹膜内施用。肿瘤接种后14天收集肿瘤以通过流式细胞仪评估TIL。此外，我们进行了补偿小鼠实验。简而言之，在第32天，抗PD-1单克隆抗体治疗后已经完全消除了最初肿瘤的小鼠是由亲本肿瘤细胞挑战的。

　　所有小鼠均在生物物理学研究所（Chiba Cancer Center Research Institute and Ockama University）的动物设施中保持在没有特定病原体的条件下。所有小鼠实验均经千叶癌中心动物实验委员会和冈山大学的动物委员会批准，并符合美国公共卫生服务政策有关人道护理和实验动物使用的政策。当最大肿瘤直径超过20毫米时，小鼠被杀死是人道的终点。实验示意图总结在补充图3中。

　　LLC/P29-Mitodsred细胞（1×105）或LLC/A11-Mitodsred细胞（2×105）地下接种到OT-1小鼠中。肿瘤接种后四十二天，从tils中对DSRED+ CD8+ T细胞（效应细胞）进行分类，然后与钙软糖AM（Thermo Fisher Scientific）llc/p29-ova或llc/llc/llc/a11-a11-ova细胞（目标细胞）共培养。LLC/P29或LLC/A11细胞用作对照。温育3小时后，使用ARVO X3多标签读取器（Perkinelmer）上的490/535 nm的激发/发射滤波器组确定荧光。

　　如前所述73进行流式细胞仪。简而言之，用含有2％FB的PBS洗涤细胞，并用表面抗体染色。根据制造商的说明，使用FOXP3/转录因子染色缓冲液集（Thermo Fisher Scientific）使用特定抗体进行细胞内染色。对于小鼠模型中细胞内颗粒酶B的染色，用PMA（0.1 mg ML – 1）和离子霉素（2μgml– 1）刺激细胞5小时（Sigma aldrich）。在培养的最后4小时内，添加了Golgiplug试剂（1.3μlML -1； BD生物科学）。使用FACSVERSE，FACSLYRIC或FACSFORTESSA流式细胞仪（BD Biosciences）和FlowJo软件（BD Biosciences）评估样品。根据制造商的说明将流式细胞仪分析中的染色抗体稀释，并在补充表6中总结。

　　使用Fisher的精确测试比较两组之间的患者特征。分别使用t检验和单向方差分析比较组之间和组之间的连续变量之间的关系。使用双向方差分析比较肿瘤体积曲线。对于多次测试，使用了Bonferroni校正。无进展生存率和总生存率定义为抗PD-1单克隆抗体疗法的开始时间间隔，直到第一次观察到任何原因的疾病进展或死亡，直到任何原因导致死亡。使用Kaplan-Meier方法分析了生存曲线，并使用对数秩检验进行了比较。所有测试均两尾，具有预定义的显着性水平为p <0.05。使用GraphPad Prism 9（GraphPad软件）进行统计分析。显示了平均值（误差线）的均值和标准误差。

　　所有体外实验均在生物学上独立重复三到四次，并产生一致的结果。所有体内小鼠实验均用每组四到六只小鼠进行，并至少重复两次，这也产生了一致的结果。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。