使用以下鼠标线（6-8周大，男性和女性）进行实验：C57BL/6 J小鼠（Jackson Laboratory，000664），NTS-CRE（Jackson Laboratory，017525，应变代码：NTSTM1（CRE）（CRE）（CRE）MGMJ），MGMJ），MGMJ MGMJ，GAD2-CRE（Jackson Laboratory，jackson Laboratory，01080802，Cre），ZH 2（CRE），ZH 2（CRAD2），CRAD2（CRAD22）AI14（Jackson Laboratory，007914，应变代码：B6.CG-GT（ROSA）26SORTM14（CAG-TDTOMATO）HZE/J），NTSFLOX（Jackson Laboratory，036262，应变代码：B6; b6; fvb-ntsem1em1evdr/j）。在12小时：12小时的光周期（07:00的灯打开）和室温为22–25°C和55％的湿度为55％。所有程序都符合美国国立卫生研究院提出的动物护理标准，并获得了加利福尼亚大学伯克利分校的实验室动物护理行政小组的批准。

　　接受常规饮食（REG）的小鼠在其家笼中随意进入标准食物（5053 Picolab啮齿动物饮食20，实验室饮食）。接受高脂饮食（HFD）小鼠的小鼠在实验前至少4周，至少4周，可以随意使用标准盘和60％的脂肪盘（研究饮食D12492）。每周至少评估所有小鼠的体重。

　　使用立体定位仪器（KOPF Instruments，Model 1900），在一般氯胺酮 - 二甲米代胺麻醉下进行手术。For retrograde tracing, mice were injected unilaterally with fluorescent retrobeads (100 nl; LumaFluor) or cholera toxin b subunit (400 nl; Fisher Scientific) into the nucleus accumbens (NAc) lateral shell (NAcLat; bregma: 1.0 mm, lateral: 1.9 mm, ventral: −4.3 mm) or ventral tegmental area（VTA; Bregma：-3.3毫米，侧面：0.4毫米，腹侧：-4.5毫米）使用1μl汉密尔顿注射器（汉密尔顿）。

　　这项研究中使用的AAVS来自Wilson实验室（Penn.aav.hsyn.cre.wpre.hgh; 〜10K 〜10K 〜10Themavenseration，由Addgene准备），Deisseroth实验室（AAV5-EF1α-Dio-dio-dio-Hchr2（h134r）-Eyfp; aav5-ev5-ev5-fpp; aav5-ef1α-dio-dio-dio-ev5-ev5-ef1α-dio-dio-mcherry;AAV5-HSYN-HCHR2（H134R）-EYFP；〜1012每毫升传染单元），来自天的实验室；NTSLIGHT1.1：将NTS传感器基因克隆到HSYN启动子中，并含有SV40 poly（a）信号序列的WPRE增强子。将载体包装到与腺相关的病毒血清型9（AAV9-NTSLIGHT1.1.1-WPRE-SV40P（A），物理滴度6.45×1014 VG ML-1，由加利福尼亚大学戴维斯大学病毒核心产生的病毒核心产生）；NTSLIGHT2.0：将NTS传感器基因克隆到HSYN启动子中，并含有含Sv40 poly（a）信号序列的WPRE增强子。将矢量包装到AAV血清型9（AAV9-NTSLIGHT2.0-WPRE-SV40P（A），物理滴度2.19×1016 VG ML-1，由加利福尼亚戴维斯大学的病毒核心产生； davis的病毒核心； Virus; Virus; Virus在注入盐水之前被5 x稀释，从盐水中稀释），从fouldy实验室（AAV-NT）（AAV-NT）（AAV-NT）。简短的CAG启动子和WPRE增强子含有SV40载体，在基因的每一侧都有两个LOX序列，以使NTS表达CRE依赖性）。将矢量包装到AAV血清型9（SSAAV-9/2-ShortCag-Dox-Mnts（Rev）-Dlox-wpre-Sv40p（a），〜1013个每毫升感染单位；由Zurich大学病毒矢量设施产生的每毫升; Zurich University of Zurich）和Lim Laboration（Limagia san Dieago san Diego-cre）。

　　对于AAV注射，使用注射泵（哈佛仪器）在150 nl min -1中注入300-500 NL浓缩AAV溶液（与上述相同的坐标）或VTA（与上述相同的坐标）或VTA（相同的坐标）。注射针结束后5分钟被撤回。立体注射后，进行了6-24周（对于AAV），7天（对于反磁珠）或2天（对于CTB – ​​Alexa Fluor 647）。

　　对于体内电生理学，将动物单方面植入Naclat（Bregma：1.0毫米，侧面：1.9毫米：1.9毫米，腹侧：-3.5 mm），具有定制的可驱动光电极（OPTRODE），由八个tetrode totrode（OPTRODE）组成，由八个tetrode to totrode to to to to to to to to to to to to to to to to to to使用环氧树脂200μm光纤。四极从光纤尖端伸出的四极〜0.5 mm。将电线尖端切平并镀金，以将阻抗降低至1 kHz时约200kΩ。固定在头骨上的小螺丝用作接地电极。数据收集开始了 <1 week after the optrode implantations.

　　For in vivo optogenetics, animals received unilateral (for ChR2) implantations of a chronically implanted optical fibre (200 μm, NA = 0.37; Newdoon) dorsal to the VTA (bregma: −3.3 mm, lateral: 0.4 mm, ventral: −3.9 mm) or dorsal to the NAcLat (bregma: 1.0 mm, lateral: 1.9 mm, ventral: −3.6 mm). For ArchT experiments, optical fibres were implanted bilaterally and were angled (10°) above the VTA (bregma: −3.3 mm, lateral: ±1.2 mm, ventral: −4.4 mm). One layer of adhesive cement (C&B metabond; Parkell) was followed by acrylic cement (Dental cement) to secure the optical fibre to the skull. The incision was closed with a suture and tissue adhesive (Vetbond; 3 M). The animals were kept on a heating pad until they recovered from anaesthesia. Atipamezole was injected intraperitoneally to reverse the sedative effects of dexmedetomidine.

　　For in vivo opto-pharmacology, animals were chronically implanted with a cannula (PlasticsOne, 33 G 4.6 mm) above the VTA (bregma: −3.3 mm, lateral: 0.4 mm, ventral: −3.9 mm). Opto-infusion experiments were done >套管植入后1周。在所有动物中，通过制备冠状切片（50或100 µM）注射和植入部位来确认注射部位和光纤位置。尽管从小鼠到小鼠的光纤位置略有不同，但所有小鼠的行为数据都包括在研究中。

　　For in vivo fibre photometry experiments using ntsLight2.0, mice were chronically implanted with an optical fibre (400 μm, NA = 0.37; Newdoon) in the VTA (bregma: −3.3 mm, lateral: 0.4 mm, ventral: −4.5 mm) and above the NAcLat (bregma: 1.0 mm, lateral: 1.9 mm, ventral:-3.6毫米）。

　　NAC是腹侧纹状体的关键组成部分，传统上分为壳和核心子区域，它们在解剖学和功能上均不同61。在这项研究和先前的研究中26,62,63,64中，我们描述了一个额外的腹侧纹状体子区域，称为NAC侧壳，该壳位于NAC核心。我们意识到术语“ NAC侧向壳”可能会产生误导性，因为它可能表明NAC外壳是NAC壳的一部分，即使这些区域在解剖学和功能上是不同的。但是，我们使用“ NAC侧壳”（NACLAT），因为它指的是在立体定位坐标中定义的解剖区域65（Bregma：1.34 mm至0.74 mm）。

　　我们对NACLAT→VTA途径的光遗传学刺激的发现专门增加了享乐食品的消耗，而不会影响标准的Chow摄入量，这表明NAC内侧壳对VTA在享乐饲料行为中对VTA的作用作用。但是，VTA中NAC内侧壳末端的光遗传学刺激主要抑制多巴胺神经元并诱导行为抑制的一般状态，这不是奖励或厌恶相关的行为特定的。这种复杂性将使解释光遗传学对NAC内侧壳通路内进食行为的影响更具挑战性。

　　我们将侧面VTA定义为中性和侧旁骨色素的核，以及与黑质尼格拉相邻的内侧lemniscus区域。请注意，内侧和外侧VTA的定义主要基于投影定义的VTA多巴胺神经元的解剖位置。它不仅基于中侧轴，而且还结合了dorso-腹侧轴63。

　　用戊巴比妥（200 mg kg -1，腹膜内注射; vortech）深度麻醉小鼠。在心脏内灌注后用冰冷的ACSF（以毫米为单位）50蔗糖，125 NACL，25 NaHCO3，2.5 KCl，2.5 kCl，1.25 NaH2Po4，1.25 naH2po4，1.25 naH2po4，0.1 cacl2，6.174 mgcl2，2.174 mgcl2，2.96 kynicanic（25 kcl），制备了含有NACLAT或VTA（200μM）的冠状脑切片（200μM）。葡萄糖（用95％O2/5％CO2氧合）。After 60–90 min of recovery, slices were transferred to a recording chamber and perfused continuously at 2–4 ml min−1 with oxygenated ACSF, containing (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 2.5 glucose, 22.5 sucrose, 2.058 MgCl2 and 2 CaCl2 at ~30 °C.在直立的荧光显微镜（BX51WI; Olympus）上使用40倍的水免疫物镜可视化细胞，该物体配备了红外分化的干扰对比度显微镜和表落荧光（Olympus）。For whole-cell current clamp recordings, patch pipettes (3.8–4.4 MΩ) were pulled from borosilicate glass (G150TF-4; Warner Instruments) and filled with internal solution, which consisted of (in mM) 135 potassium gluconate, 5 KCl, 10 HEPES, 0.1 EGTA, 2 MgCl2, 2 MgATP, 0.2 NaGTP, pH 7.35（290–300 MOSM）。对于穿孔的斑点记录，如上所述，首先将贴片移液器填充，然后填充含有100 µg ml-1 gramicidin的内部溶液。使用Multiclamp700B放大器在32°C下进行电生理记录，并使用Digidata 1440 A Digitizer获取，以10 kHz采样，并以2 kHz进行过滤。所有数据采集均使用PCLAMP软件（Molecular Devices，版本10.5）进行。通过使用计算机控制下由LED驱动器（Prizmatix）供电的超高动力发射二极管（LED），通过显微镜的光路闪烁473 nm的光线来刺激ChannelRhodopsin-2。双灯箱适配器（Olympus） 用于在荧光灯和LED灯光源之间切换。在实验过程中，LED的光强度没有改变，整个切片被照亮（5 mW mm -2）。在线监控串联电阻（15-25MΩ）和输入电阻。使用ClampFit（Molecular Devices，版本10.5）离线分析数据。为了记录自发作用电势射击，将细胞保持在当前的夹具模式下，并且没有进行电流注射。在光刺激后至少记录了至少3 s和5 s（20 Hz，3毫秒的光脉冲，5 mW mm -2）。对于药理学实验，我们记录了基线反应，并将药物浸泡5-10分钟（1 µM SR142948A（Tocris），1 µM神经素（Sigma Aldrich））。为了确定后脱落标记的神经元的神经化学认同（即免疫阳性或th-th-n-nyonegative），神经元在内部溶液中包含0.1％神经蛋白（载体），在斑块夹记录中，然后在4％的paranefore（para）中固定在pation-clamp记录中，然后将其固定为24 H hyersty（pfa）。多巴胺能表型在图4J – M所示的实验中得到了证实。神经生物素未包括在图3a – f和扩展数据中所示的实验中。图9a – f。关于VTA中逆行标记神经元的神经化学身份的更详细描述可以在Lammel等人的64中找到。

　　带有Optrode植入物的小鼠通过FC/PC适配器连接到连接到473 nm DPSS激光二极管（Laserglow）的纤维电缆上。使用Master-8脉冲刺激器（A.M.P.I.）控制激光输出。使用数字功率计（Thorlabs）测试了功率输出，并在每种实验动物之前和之后检查。从纤维尖端200μm处的靶向组织，光刺激期间的输出估计为3–5 mW mm -2。使用具有HS-18毫米的媒体前放大器（NeuralyNX）的数字LYNX 4SX系统记录神经信号。记录的信号在0.6至6 kHz之间过滤，并以32 kHz采样。使用Spikesort3d 2.5.4（Neuralynx）软件将尖峰离线排序。为了识别光子标记的细胞，每天进行了optrode 〜40 µm，并进行了简短的光筛选（30光脉冲，1 Hz时宽5 ms宽）以检测光反应性细胞。如果检测到活动，则小鼠进行了行为评估。如果没有发现活性，则将Optrode推进另一个〜40 µm，并且第二天对小鼠进行了重新测试以进行光诱导的细胞活性。行为评估后，移动Optrode 〜80 µm，以最大程度地减少随后几天记录相同细胞的可能性，并筛选了新的Opto标记的细胞。记录神经信号时的食物消耗实验包括3项行为试验（习惯性，果冻，周一，每个15分钟，食物的平衡序列，总计45分钟）和在行为会议结束时进行光tagging试验，其中光刺激在2 Hz时给出2 Hz的光刺激。在光tagging阶段的末尾，腹侧移动的Optrode以〜40μm的速度移动，直到检测到活跃单元为止。在电解病变（12μA，30 s）后，使用组织学验证了最终记录位置。通过输送473 nm（0.8 mW mm-2，1-5 ms脉冲）来鉴定ChR2标记的神经元 2 Hz频率的光2-3分钟。在激光脉冲周围的间隔（0，+100毫秒）中，具有最高数量的尖峰数的2毫秒bin被鉴定出来。为了测试确定的对光的最强响应是否高于机会，我们将所有尖峰时间在相同的（0，+100 ms）间隔间隔10,000次，并计算每种迭代中2 ms bin中最高数量的尖峰。如果实际数据中2 ms bin中的尖峰数量超过了最有效的2-ms bin中峰值分布的第99.9个百分位数，则我们将单元格分类为光反应。响应延迟定义为最活跃的2 ms bin中的平均响应时间，仅具有响应延迟的单元 <8 ms were classified as opto-tagged. Examples of the opto-tagging procedure in REG and HFD mice are shown in Extended Data Fig. 1i–r.

　　For detection of feeding events, a piezo-based sensor was placed under the food cup. Cells were included in the analysis only if piezo sensor activity was detected. To obtain time-locked events, activation of the sensor was transmitted as a TTL signal to the Neuralynx recording system via an Arduino Uno board. Time spent feeding included the sum of events in which the sensor was activated at least twice and lasted until there was an interval larger than 6 s between the sensor activations. Piezo-detected events were confirmed by randomly inspecting 5 frames where the behaviour was determined as feeding in the analysis.

　　A video-based offline tracking was performed via DeepLabCut66. Specifically, DeepLabCut.py (version 2.0.7) was used to track all points of interest. The network was trained using 20 frames from 6 randomly selected videos (containing mice of different diets and food types) for >1,000,000迭代。为每个框架提取鼻子，头部，身体中心和尾部底座的水平XY坐标。在分析中，仅使用85％精度和更高的DLC坐标。使用定制的MATLAB代码从DLC获得的行为图案扣除。视频启动时间使用压电传感器的LED读数与NeuralyNX记录系统保持一致，并通过Arduino Uno板直接记录到NeuralyNX数据采集系统的匹配TTL信号。扣除行为主题：喂食/空图案被定义为具有杯子的头部位置的高接近度（<5 cm). Rearing was defined by close proximity of the body and head positions (<2 cm). Body and head orientation were determined as vectors from tail to body, and from body to head, respectively. Turning behaviour was defined as turning the head more than 15° from the body centre, which was then counted across a session67. The rest of the frames were classified according to velocity. Velocity was calculated by the distance of body position between frames, normalized to the size of the open-field chamber (in cm) and the frame rate (15 frames s−1). Velocity-based behavioural motifs were defined for in vivo electrophysiology as <1 stopping, 1–5 walking, 5–10 trotting, and >10跑步（CM S -1的单位）。如果小鼠离食物板太近，则不包括速度图案（<7 cm from either plate) to avoid confusion with the food/empty plate motifs. Except for turning events, each motif occurrence was included only if it persisted for <7 frames (0.5 s). The behavioural readout and motif selection were visually verified for each experiment by randomly inspecting five frames of each motif to confirm the correct motif selection (Extended Data Fig. 1g,h).

　　Response types during different behavioural motifs or piezo-based feeding events were classified into non-responsive, increased response (IR), and decreased responses (DR) using the following criteria: For each unit, average time series responses were collected around event onset from each motif type. Pre-event unit firing rates (−3 to 0 s before event onset) and event rates (0 to 3 s from event onset) were analysed using the Wilcoxon signed-rank test to determine statistical significance and the direction of change. IR: pre-event rates 事件率和p <0.05;否则，一个单位将被归类为无响应性。在REG和HFD小鼠中分析了分类单元的比例（对于光电标记和非标记单元），并与卡方检验进行了比较；使用Bonferroni校正校正P值以进行多个比较。

　　neuralynxmatlabimportexport_v6.0.0 matlab软件包（可在https://neuralynx.fh-co.com/research-software/上找到），自定义MATLAB代码和GraphPad Prism（版本9.5.1和10.3.1）用于分析In Vivo电子生理学数据。

　　所有行为测试均在温度（20–23.5°C）和湿度（40–60％）的受控房间中（除非另有说明）进行，该房间由8×32 W荧光灯照亮，每个荧光灯都会产生2,925个流明。在单个动物之间用70％乙醇清洁行为设备。

　　将小鼠放在腔室（25厘米长×25 cm宽×25厘米高）中，并将2个小的空食物杯固定在对面的拐角处的地板上。在经过15分钟的习惯之后，将一个空杯子代替了一个杯子，其中含有预先测量的特定食物类型（即标准食物，高脂食物，巧克力，花生，花生酱，草莓果冻，黄油，水或奎宁；请注意，用quinine制备了Quinine：30 g Butter：30 G in 30 g 30 s microwaved in 30 s s so n s ol so n of sol to s ol y. 1 quin n Melt of。然后将蒸馏水彻底混合到黄油中。每次15分钟的试验后，再次称重食物杯，并从初始体重中减去以确定所消耗的食物量。小鼠在行为测试前三天的三天不同，在其家居笼子里收到了每种食物的样本，并习惯于行为室。进行此程序是为了避免压力，以及对新食物的新恐惧症，这是小鼠的特征行为。68。

　　对于体内光遗传激活，具有光纤植入物的小鼠连接到连接到473 nm DPSS激光二极管的纤维电缆上。光遗传实验包括5个按以下顺序进行的试验：习惯，启动喂养，关闭，打开，关闭（每个15分钟；总计75分钟）。在居住试验期间，小鼠可以自由探索房间，但没有食物。在每个随后的试验开始时，我们放置了一个新的预测食品杯，其中包含特定的食物类型。启动进食试验使我们能够评估饮食对喂养行为的影响。此外，由于在随后的试验中降低了喂养行为，因此在喂养行为较低时，它使我们能够测试光遗传刺激的影响。在试验期间，20 Hz（或1 Hz，10 Hz用于扩展数据中的实验图3D），通过纤维电缆传递5 ms蓝光。习惯期间没有光遗传学刺激，启动喂养和试验。在扩展数据图中显示的实验中。在实验开始前24小时，3e，f和4c，d，d，d，d，d，d，d，d; d; fd;也就是说，所有家庭笼食物被去除）。将在FD条件下进行启动喂养试验期间的食物消耗与在同一但没有FD的启动喂养的基线水平进行比较（即，在FD启动前一天进行了基线测量，并由习惯和喂养试验组成（每个15分钟））。

　　对于体内光药理学（图4F – I），将小鼠放置在开放场室内，并将定制的光纤插入插管中以进行光刺激。与上述相同的实验设计除外，试验1和试验2之间（即激光off和试验时），将小鼠放入一个单独的盒子中，其中将它们注入盐水或6 mm SR142948A（以300 nl min -1的速率通过输注泵500 NL（500 NL））。在输注后再等待10分钟，然后将动物放回腔室进行剩余试验。

　　对于体内光遗传学抑制（扩展数据图3O – T），具有双侧光纤植入物的小鼠附着在连接到593 NM DPSS激光二极管的纤维电缆上。实验连续三天进行。每天，将小鼠放在行为室中以进行习惯（15分钟，不存在食物）和果冻喂养（15分钟）。在第2天，当果冻存在时，通过纤维电缆传递恒定的激光（10 MW）。每天测量果冻消耗。

　　家庭笼喂食实验中的小鼠接受了预先测量的标准盘和60％的脂肪盘，每周对每个笼子进行测量。将食物消耗标准化为每个笼子中小鼠的数量。

　　将小鼠放置在定制的开放场室（50厘米长×50 cm宽×50厘米高）中，并记录其运动并使用视频跟踪分析10分钟。mouseactivity5.m（https://github.com/hanlab-osu/mouseactivity/blob/master/moster/mouseactivity5.m）用于分析开放式行为。为了评估与焦虑相关的行为，我们确定了动物在腔室中心（33 cm长×33 cm宽度）的时间69。为了分析使用DeepLabcut（版本2.0.7）的行为基序，我们使用了类似的方法，如“基于视频的行为主题分析”中所述，以识别饲养，转弯和不同的速度模态。通过随机检查每个基序的五个帧（扩展数据图10H），对每个实验进行了视觉验证的行为读数和基序选择。

　　具有光遗传学植入物的小鼠连接到纤维电缆，并将其放置在定制的三室室内。为了进行光遗传学刺激，将电缆连接到473 NM DPSS激光二极管（Laserglow）通过FC/PC衔接子连接，并使用Master-8脉冲刺激器（A.M.M.P.I.）控制激光输出。使用数字功率计（Thorlabs）测试了功率输出，并在每种实验动物之前和之后检查。从纤维尖端200μm处的靶向组织，光刺激期间的输出估计为3–5 mW mm -2。腔室的一侧被指定为初始刺激侧（第1阶段），10分钟后，刺激侧被切换到腔室的另一个先前未刺激的侧（第2阶段）。腔室的中间是一个从未与刺激配对的中性区域。在每个会话开始时，将小鼠放置在腔室的中间，每次小鼠越过刺激侧时，都会递送恒定的激光刺激（473 nm，20 Hz，5 ms脉冲），直到小鼠离开刺激区域。第1阶段和第2阶段之间没有中断。第一个刺激侧是在小鼠之间平衡的。通过视频跟踪系统（BioBserve，版本3.0.1.442）记录了小鼠的运动，并计算了在每个区域（刺激，未刺激，中性）花费的小鼠的时间。

　　为了测量体温，将小鼠手动限制以最大程度地减少测量时的应力，并将直肠温度计插入直肠至约1 cm的深度。

　　果冻（Smucker的草莓果冻；卡路里：2.5 kcal，总脂肪：0 g，饱和脂肪：0 g，反式脂肪：0 g，胆固醇：0 g，钠，钠：0 g，总碳水化合物：0.65 g，饮食纤维，饮食纤维：0 g，总糖，总糖：0.6 g，蛋白质：0 g），蛋白质：0 g），蛋白质：0 g trade of joe joe joe joe's fite; 1. 1.17; 1.17;0.79 g, saturated fat: 0.5 g, trans fat: 0 g, cholesterol: 0 g, sodium: 0 g, total carbohydrate: 0 g, dietary fibre: 0 g, total sugars: 0 g, protein: 0 g), peanut butter (Skippy; calories: 6.39 kcal, total fat: 0.5 g, saturated fat: 0.11 g, trans fat: 0 g, cholesterol: 0 g, sodium:0 g, total carbohydrate: 0.25 g, dietary fibre: 0.06 g, total sugars: 0.11 g, protein: 0.22 g), chocolate (Hershey Kisses; calories: 4.88 kcal, total fat: 0.29 g, saturated fat: 0.9 g, trans fat: 0 g, cholesterol: 0 g, sodium: 0 g, total carbohydrate: 0.61 g, dietary fibre:0.02 g, total sugars: 0.56 g, protein: 0.07 g), regular chow (PicoLab Rodent Diet 20; calories: 3.02 kcal, total fat: 0.05 g, saturated fat: 0.01 g, trans fat: 0 g, cholesterol: 0.14 g, sodium: 0 g, total carbohydrate: 0.54 g, dietary fibre: 0.04 g, total sugars: 0.03 g,protein: 0.21 g), high-fat chow (Research Diets D12492; calories: 5.24 kcal, total fat: 0.35 g, saturated fat: 0.18 g, trans fat: 0 g, cholesterol: 0 g, sodium: 0 g, total carbohydrate: 0.26 g, dietary fibre: 0.06 g, total sugars: 0.25 g, protein: 0.26 g).

　　所有构造均使用圆形聚合酶扩展克隆和限制克隆设计。通过PCR引入了BAMHI和Hindiii位点，以最终亚克隆到PAAV-HSYNAPSIN1 Vector（Addgene）。为了增强构象变化和发色团荧光之间的耦合，我们使用了GCAMP6S中的CPGFP模块将其插入到人NTS1R中。对于筛选接头变体，我们通过首先在接头（LSS-XI-CPGFP-XH-DQL）上使用22 C饱和诱变的引物生成了连接器库。要从NTSlight1.0筛选NTSlight2.0，基于A类GPCRS71的常见激活途径，我们在区域5.61和6.33上生成了库进行筛选。克隆的构建体被放大并用QIAGEN PCR纯化试剂盒进行纯化，然后NEB5α有效的大肠杆菌转化。将主管的细胞铺在含卡纳霉素的琼脂板上。在37°C下生长24小时后，将单个菌落捡入96孔板并在一夜之间生长。使用opentrons ot-2液体处理程序使用向导镁质质粒纯化系统（Promega，A1630）纯化质粒。顶级变体由Genewiz测序。在接头筛选（LSS-XI-CPGFP-XH-DQL）之后发现了NTSlight1.1，并导致WI-EH。NTSLIGHT2.0筛选导致I259M和G301T。为了制作AAV质粒，用PAAV质粒转化了NEB稳定的竞争细胞。在30°C的含有氨苄青霉素的琼脂板上过夜生长后，选择并测序一个单个菌落。然后在100 mL的生长培养基（2×YT）中在30°C下扩展具有正确测序结果的菌落，并用QIAGEN无质量质粒最大值纯化，并发送至加州大学戴维斯病毒生产的UC davis病毒核心。

　　玻璃底96孔板（P96-1.5H-N，Cellvis）用0.1 mg ml-1的聚赖氨酸（Sigma，p6407-5mg）覆盖，过夜。用水和E18大鼠海马神经元洗涤板（https：//tissue.transnetyx.com/e18-rat-hippocampus_4;未验证未经认证；未对霉菌污染进行测试；在Neurobasal培养基中使用Neurobasal培养基中的Neurobasal培养基5.-592-002-GIBCO-032-GIBCO，A3525252952952952952952952952。B27 Plus补充剂（Gibco，A3582801），谷马克斯（Gibco，35050-061）和庆大霉素试剂（Gibco，15710-064）。神经元在DIV5神经元上被AAV9-HSYN-NTSLIGHT1.1（见上文）感染，并改为DIV7上的新媒体。在DIV12成像之前，每两天进行一次媒体更改。

　　神经元细胞滴定在96孔板中进行。在对DIV12神经元进行滴定实验之前，将H2O中10 mM神经素（凤凰药物）的储备溶液稀释至333 µM（在HBSS和0.1 mg ML-1 BSA中），并在96孔板的所有第一个井中分布。以下井在HBSS中有连续稀释的神经元滴定。为了与拮抗剂成像，将H2O中1 mM SR142948A（Millipore Sigma）的库存溶液稀释至200 nm，在成像介质中分布在一个空的96孔板（配体板）中，一式三份。成像介质由包含HEPES缓冲液的1×HBSS（Fisher，14175103）组成。将在单独的96孔板（成像板）中生长的神经元用成像介质轻轻洗涤3倍，并且井中充满了适当的成像介质，以进行相应的实验。对于滴定实验，将50 µL成像介质添加到测定板的每个孔中。然后，使用ImageXpress微焦点高含量成像系统在40×（Na 0.6）中对井进行成像，并使用metaxPress软件（版本v6.6.3.55）的ROI（曝光= 300毫秒）的4个孔区域（ROI）（ROI）。接下来，将来自配体板的50 µL转移到包含三倍的最终浓度的成像板中。孵育5分钟后，使用相同的设置重新成像相同的位点。最终浓度范围从150 µm到下午1点进行滴定，每次连续稀释。

　　按照与上述相同的方案，将神经元铺板并在4腔玻璃底（35 mm，Cellvis）中培养。使用60×油物镜在狮子星共焦点上对神经元进行成像。将神经元成像在成像缓冲液中成像，并将10 µL的配体直接应用于每个腔室：NTS（10 µm，Phoenix Pharmaceuticals），GABA（100 µm，Tocris），多巴胺（100 µm，Sigma，Sigma），乙酰胆碱（乙酰胆碱，100 µm），100 µmmmy，5-MM）（10 µm，凤凰药物），生长抑素（10 µM，凤凰药物），神经肽Y（10 µM，凤凰药物），胆囊基蛋白蛋白蛋白蛋白（10 µM（10 µm，凤凰药物）。我们观察到在存在NTS受体拮抗剂（SR142948A）的NTS存在下，荧光浓度依赖性增加（扩展数据图6A）。

　　成像完成后，将使用自定义的MATLAB脚本导出并分析图像（可在以下位置提供：https：//github.com/lintianlab）。简而言之，对单个图像进行了分割，并产生了一个掩盖神经元膜的掩模。从面膜高的区域获得像素强度，并导出到Excel中。计算每个孔的ΔF/F值。

　　制备了急性冠状中脑切片（与体内电生理学中所述相同的程序），转移到记录室，并在2-4 ml min -1中连续灌注ACSF。在定制的开源宏观镜（https://github.com/llamero/diy_epifluorescence_macroscope）下可视化切片。定制抽奖区域以20 Hz的速度成像，暴露于474 nm LED刺激（5.2 mW mm -2），总计20 s。在记录的中间，将1秒钟的635 nm刺激（17 mW mm -2）组成，该刺激由20 Hz时的5 ms脉冲组成，将每个相机暴露之间的切片传递到切片中，因此没有记录一个Chrimson刺激光。绿光刺激实验与红光刺激相似，其中1 s为554 nm刺激（8 mW mm-2），由20 Hz的5 ms脉冲组成。对于脉冲宽度调制实验，在20 Hz的脉冲宽度下以20 Hz的速度传递了红灯刺激。为了确定横向VTA中的DF/F，将从传感器和表达Chrimson表达Chrimson的ROI的荧光与外侧VTA中的荧光分开。由于在组织的不同区域之间，光漂白曲线并不相同，因此进行了额外的基线减法。删除了Chrimson刺激时间周围的DF/F信号窗口，将其余的DF/F数据平滑，并通过平滑的数据和删除的刺激时间窗口绘制了估计的多项式拟合趋势线。从完整的DF/F信号中减去了此趋势线。在刺激时间内，AUC计算为近似梯形积分。

　　为了检查NACLAT→VTA特异性NTS释放，将小鼠注入NTSLIGHT1.1中，将NTSLIGHT1.1注入VTA，Aav-Hsyn-Chrimsonr-Tdtomato（Chrimson）中注入NACLAT；仅将一组小鼠注入NTSLIGHT1.1中（仅传感器）。六周后，我们在光刺激期间记录了VTA脑切片的NTSLIGHT1.1荧光。红光刺激增加了Chrimson小鼠VTA切片中的NTSLIGHT1.1荧光，但在“仅传感器”小鼠中不增加（扩展数据图6b – d）。其他光学控制实验表明，NTSLIGHT1.1荧光的增加在10 ms的红光脉冲宽度时达到最大值，表明NTSLIGHT荧光反映了NTS释放的动力学，而不是传递到组织的总光。隔离呈蓝光或红光刺激不足以增加NTSLIGHT1.1荧光（扩展数据图6E，F）。

　　根据制造商的协议，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，2980874）将HEK 293 T细胞（ATCC，CRL-3126；未经身份验证；未对支原体污染进行测试）并与PCMV-NTSLIGHT2.0（2980874）一起转染。转染后24小时，使用Tryple Express（Thermo Fisher，12604021）提起细胞，沉淀（200 g持续2分钟），并重悬于含有DMEM的1 ml培养基中（Gibco，11995-065），胎牛血清（Gibco，Gibco，26140079）和Pen-STREP（Gibco）（Gibco）（Gibco）（Gibco）（Gibco）（Gibco）（151）。然后将细胞铺在4腔玻璃底菜上，并在第二天成像。

　　为了确定NTSlight2.0的最佳激发波长，我们使用Leica Stellaris 8共焦显微镜进行激发和发射光谱测量。用HBSS（Sigma Aldrich，H8264-500ML），90 µL具有1×HBSS的成像介质（Fisher，14175103）和10 mM Hepes缓冲液洗涤每个板，将90 µL成像介质添加到每个象限的中心。为了进行发射光谱测量，我们通过470 nm的刺激使用λ-扫描模式（XYλ），并以从480-610 nm的一系列发射波长成像，具有10 nm的步长和10帧的累积。为了进行激发光谱测量，我们通过使用白光激光器在一系列波长的范围从440–540 nm的范围内使用激发lambda扫描模式（XYλ），在10 nm处的步长。检测器的检测范围是在Lambda扫描发射波长期间的激发波长之前。对于使用神经素的发射和激发光谱，在成像之前添加了10 µL 20 µM NTS。使用自定义代码进行分析，以计算（apo）和（+nts）添加之前（apo）和之后的荧光变化（ΔF/f）。然后将荧光变化标准化为每组的最大荧光（扩展数据图7b）。

　　玻璃底96孔板（Cellvis）用0.1 mg ml-1的聚赖氨酸（Sigma，p6407-5mg）覆盖。用超蒸馏水（Invitrogen，10977015）洗涤板并干燥。E18 rat primary hippocampal neurons (BrainBits, https://tissue.transnetyx.com/E18-Rat-Hippocampus_4; not authenticated; not tested for mycoplasma contamination) were dissociated and plated with 38 thousand cells per well in FBS-based neuronal medium containing Neurobasal Plus Medium (Gibco, A35829-01),FBS，Glutamax（Gibco，35050-061）和B27 Plus（Gibco，A3582801）。第二天，将培养基删除并用无FBS的神经元培养基取代。在DIV4上，一半的神经元培养基通过含有病毒AAV9-HSYN-NTSLIGHT2的新媒体进行了更改，并在三天后删除。在Div12上成像神经元文化。在成像实验之前，立即在96孔治疗板中制备了储存肽溶液，并在每行中制备了连续稀释液（HBSS中的300 µm到下午3点）。然后将SR 142948 A（Sigma，SML0015）的1 nm和100 nm终浓度添加到处理板中。在添加药物处理之前，将96孔测定板用HBSS洗涤3次，将50 µL成像培养基（车辆）添加到每个孔中。使用metaxPress软件（版本v6.6.3.55）使用ImageXpress微共聚焦高核成像系统进行基线成像，并使用20倍物镜，并捕获每个井的四个感兴趣区域。接下来，将50 µl从处理板的每孔配体的配体转移到测定板上。孵育10分钟后，使用相同的设置重新成像相同的位点。对于没有拮抗剂的滴定控制，仅使用溶于HBSS中的300 µm至3 pm的神经素素。在各种情况下都存在带有车辆的空白控件。使用自定义MATLAB脚本（可在https://github.com/lintianlab上使用）来导出图像并分析图像，以确定荧光变化（ΔF/f）。对单个图像进行了分割，并生成了HEK293T细胞膜的掩模。从面膜高的区域获得像素强度，并计算并导出每个孔的ΔF/F值（扩展数据图7C）。

　　使用定制的纤维光度法（FIP）System63测量NTSLIGHT2.0瞬变。简而言之，通过刺激用470 nm LED表达NTSLIGHT2.0的细胞（纤维尖端60μW）获得荧光信号。470 nm LED灯信号以20 Hz释放，并使用SCMOS摄像机记录了光发射，该摄像头获得了包含纤维的视频帧（长度为5 mm，Na 0.48 0.48，400μm核心，多立克镜头）。Arduino Uno板生成的TTL信号用于同步摄像机和FIP信号。在线分析视频帧，并使用自定义采集代码（可在https://github.com/handejong/fipster上获得荧光信号），然后在GraphPad Prism（版本10.3.1）中进行分析。

　　NTSlight2.0在Naclat细胞的光遗传刺激期间记录了VTA中的信号。具体而言，将小鼠放在头部固定的设备中，并连接到纤维贴片绳索。由Arduino Uno控制了640 nm准直的二极管激光器，并在带有TTL信号的FIP采集系统中记录激光刺激时间。每个课程都有30次试验，持续时间为60 s，由短激光脉冲组成，然后是延迟期。为了进行分析，我们在激光刺激开始周围生成了Z尺寸数据的周围图，并在所有试验中分析了激光刺激开始周围-10至+30 s的时间范围。然后，我们在特定时间点进行了量化AUC：基线（-3至-1 s），激光刺激（0至2 s）和激光后刺激（3至5 s）。

　　NACLAT激光刺激在VTA中产生了双向NTSLIGHT2.0瞬态，由激光刺激期间发生的快速负峰（0至2 s）组成，然后是较慢的正峰（3至5 s）。我们进行了多个实验，以测试信号的哪个组成部分反映了NTS释放的变化：首先，我们比较了表达Chrimson和NTSlight 2.0（传感器）的小鼠中观察到的反应与缺少这些成分之一的小鼠（即仅传感器，仅Chrimson）。仅当传感器和Chrimson表达同时，在激光后刺激期间观察到的正峰会增加（扩展数据图7d – H）。其次，我们测试了信号对不同刺激模式的敏感性。当测试不同的刺激持续时间（1、3或5 s，10 mW强度，20 Hz）时，我们观察到激光后刺激信号在3-S刺激持续时间内的增加最大，并且随着1或5 s的持续时间的中等变化（扩展数据图7i – L）。增加刺激强度（3 s，20 Hz的0.5、5或10 MW强度）会产生传感器信号比例增加（扩展数据图7M – P）。第三，我们在腹膜内注射NTSR1拮抗剂（SR48692，Sigma Aldrich，5 mg kg -1）或同样量的DMSO的DMSO（在记录10分钟之前注入10分钟之前，在记录10分钟之前，我们分析了激光刺激（3 s，10 mW，20 Hz）的传感器信号，SR48692，SIGMA ALDRICH，5 mg kg -1）。我们发现，较慢的正（而不是快速负峰）被NTSR1拮抗剂阻断（扩展数据图7d – U），这表明激光刺激会产生短暂的人伪影，随后NTS释放增加。虽然目前尚不清楚人工制品的性质，但在其他神经肽传感器的录音中也观察到了它，例如最近开发的阿片类药物传感器72和腺苷传感器（grabado）73.需要未来的实验来测试刺激过程中其他神经化学信号传导过程是否可能抑制NTS释放。最后，为了测试传感器对NTS的敏感性，我们将传感器连续记录20分钟，然后将小鼠注入NTSR1激动剂（PD149163，Sigma Aldrich，0.3 mg kg -kg -1，interpaineaneareaneanearection）。通过按下Arduino Uno板上的按钮将TTL信号传递到FIP采集系统，并将信号录制了50分钟。该信号与注入时间点对齐，使用自定义MATLAB代码平均降低和z得分。在基线周期（注射前-500至0 s）和注射后（1500至2000 s）分析了AUC。我们观察到响应PD149163中的传感器信号显着增加，但没有盐水注入（扩展数据图7V – X）。

　　该过程以前描述了74。为了最大程度地减少对随后的分子实验的干扰，在电生理记录期间，仅在玻璃移液管中使用了少量的细胞内溶液（1μL；未使用RNase抑制剂处理）。在记录之前和期间，所有表面区域（包括操纵器，显微镜旋钮和计算机键盘）都用RNASEZAP溶液（Sigma）清洁实验者所需的实验者。全细胞贴片钳记录后，通过记录过程中使用的玻璃移液器吸出了细胞的细胞质。尽管抽吸的细胞质可能包含基因组DNA，但我们对cDNA制剂的选择涉及基于聚-A的mRNA选择，实际上消除了在RNA序列数据中基因组污染的可能性。将细胞收集微管存储在冰上，直到使用。为了收集样品，我们迅速从放大器的截形中删除了移液架，并使用正压将样品排入含有1 µL细胞收集缓冲液的微管（1×裂解缓冲液和RNase抑制剂从Takara的Smart-Seq套件中），同时轻轻破坏玻璃移液器。短暂旋转样品，在干冰上快速冷冻，并在-80°C下储存直至进一步加工。

　　如前所述74。根据制造商的协议，使用Takara的Smart-Seq V4和Smart-Seq单细胞套件来处理单细胞mRNA。简而言之，将样品反转录为cDNA并随后扩增。用Ampure XP珠（Beckman Coulter）纯化样品，并在片段分析仪（高级分析）上分析质量和数量。如协议中所述，使用Nextera XT XT DNA样品制备试剂盒（Illumina）进行了库制备。简而言之，使用索引适配器对cDNA样品进行碎片并扩增。然后使用Ampure XP珠纯化样品，并使用片段分析仪（高级分析）评估质量和数量。在库制备后，使用Illumina Novaseq 6000和150 bp配对的读数进行汇总和测序。

　　测序后，使用Illumina BC12FASTQ（2.20版）将原始读数脱落，并与Ensembl GRCM38.95参考转录组进行伪一致，并使用Kallisto（版本0.45.1）进行归一化。所有数据分析均使用Python（版本3.6.7）和R（版本3.5.1）进行。为了进行质量控制，我们计算了每个细胞的读数和基因计数的中值绝对偏差。排除了读数或基因计数较少的细胞，是中位数中位偏差的三倍。使用EDGER（版本3.24.3）进行差异基因表达分析。仅在CPM值高于15的至少5个细胞中表达的基因，而平均CPM值必须高于4，以进行差异基因表达分析。

　　用于识别特定基因家族的基因本体（GO）术语是从QuickGo平台（https://www.ebi.ac.uk/quickgo/）获得的。

　　突触分子基因家族：GO：0005179激素活性，GO：0032098食欲调节，GO：0007218神经肽信号通路，GO：0007269神经递质分泌和GO：0007268化学突触传播。

　　喂养基因家族：GO：0007631喂养行为的调节和GO：0007631喂养行为。

　　突触基因家族：GO：0043083突触裂缝，GO：0097060突触膜和GO：0099536突触信号传导。

　　离子通道基因家族：GO：0006816钙离子传输，GO：0006817磷酸离子传输，GO：0006814钠离子传输，GO：0006811单位离子离子运输和GO：0006813钾离子运输。

　　内质网基因家族：GO：0005783内质网。

　　囊泡融合家族：GO：0031338囊泡融合的调节，GO：0006906囊泡融合和GO：0098992神经元密集的核心囊泡。

　　Transcription gene family: GO:0010468 regulation of gene expression, GO:0031564 transcription, GO:0090293 antitermination nitrogen catabolite regulation of transcription, GO:0045990 carbon catabolite regulation of transcription, GO:0000409 regulation of transcription by galactose and GO:0046015 regulation of transcription by glucose.

　　如先前所述26,64。简而言之，在PBS中用4％PFA（pH 7.4）灌注后，将大脑固定过夜，并制备冠状脑切片（50或100μM）。将切片在主要抗体溶液中染色：兔抗Th（Millipore），鸡肉抗GFP（ABCAM），兔抗DS红色（Living Living Colors），均以1：1,000的稀释度进行染色。二十四小时后，将切片染色2小时，在二级抗体溶液（山羊抗兔荧光546，（所有Thermo Fisher Scientific），山羊抗chicken Alexa Fluor 488（ABCAM），全部1：750）。将染色的切片安装在显微镜载玻片上的含DAPI的安装介质。使用20×或40×目标使用Zeiss LSM710激光扫描共聚焦显微镜进行图像采集，或使用5×，10×和20×目标的Zeiss Axioimager M2立式宽场荧光/微分干扰对比度与电荷耦合式摄像头与电荷耦合式摄像头。ZEN软件2.3（Zeiss）用于获取脑切片的共聚焦和落叶图像。使用ImageJ（NIH，64位Java 1.8.0_172）分析图像。使用地标和神经解剖学命名法在小鼠大脑中所述的立体定位坐标中所述，将部分相对于董事标记。65。所有带有多种颜色的图像代表了具有不同激发波长的图像的复合图。

　　使用市售的Rnascope多重荧光试剂盒V2（ACD Bio）进行荧光原位杂交实验。通过将它们浸入冷冻的异戊烷（-70至-50°C）中，从而提取大脑并捕捉冻干。它们被存放在-80°C冰箱中的密封容器中。使用低温恒温器制备16μm冠状Naclat脑切片，放置在超冻衣加上显微镜载玻片（Fisher Scientific）上，并保存在-80°C的冰箱中。第二天，在PBS（30分钟）中，将脑切片固定在4％PFA中，然后进行乙醇脱水程序（20分钟）。然后将切片浸入过氧化氢（10分钟）中，然后在rnascope试剂盒（15分钟）中进行蛋白酶IV。接下来，将探针混合使用NTS（MM-NTS-C2），NTSR1（MM-NTSR1-C2）或Th（mm-th）。设计的定制探针（MM-NTS-O1-C2）仅针对NM_024435.2（NTS）的Axon 4靶向NTSFLOX小鼠NTS的有条件敲除之后的NTS表达（图4A-E）。将探针混合物应用于脑切片以进行杂交（40°C时2小时）。在使用绿色Opal 520（美国Akoya Biosciences，USA，USA）开发了信号（使用AMP1，AMP2和AMP3）的信号（使用AMP1，AMP2和AMP3）和C2通道C2之后，使用Orange Opal 570（Akoya Biosciences）开发了通道。最后，使用DAPI（来自rnascope套件）染色核，并用延长的金抗固定式木制（Thermo Fisher Scientific）和玻璃盖玻片密封脑切片。使用共聚焦显微镜（LSM710，Carl Zeiss）在5个不同的Z深度（跨度为4.4μm）拍摄图像，并通过在Z方向上取出最大投影来扁平图像。使用基于DAPI通道75的基于机器学习的分割算法核核酶识别ROI。跨DAPI识别区域的可见mRNA量被用作细胞中总mRNA的代理。所有已确定的感兴趣区域均由一名对病毒表达，饮食，饮食，饮食的研究者手动分类 和探针混合。如果他们被删除：（1）显示与其他感兴趣的地区重叠；或（2）通过算法对不足进行分割。基于DAPI阳性像素的百分比分析其余细胞，这些像素的百分比也对靶向mRNA呈阳性或基于DAPI阳性细胞中靶向mRNA的平均荧光。为了调整染色和/或图像质量的潜在差异，我们将所有感兴趣区域的像素与每个图像中的背景荧光水平进行了比较。为此，我们首先建立了一个“无效分布”，该分布量化了针对靶向mRNA的细胞的像素强度值的分布。将每个细胞的像素强度的分布与靶向mRNA的空分布进行了比较，并计算了相关系数R。如果细胞的分布与无效分布相比小于0.85，则将细胞标记为靶向mRNA阳性。对于扩展数据的实验图5i-M，暴露于常规饮食（REG），4周HFD或小鼠从4周HFD转换为3周常规饮食的小鼠被注入VTA中。10天后，提取大脑，并在用retrobeads标记的DAPI阳性Naclat细胞中评估NTS mRNA。

　　学生的t检验（配对和未配对），单向或双向ANOVA测试以及混合效应模型分析（用于正态分布的数据）和Friedman，Kruskal – Wallis或Mann-Whitney测试（用于非正态分布数据）的学生，用于确定使用GraphPad Prism 9（版本9.5.5.5.1.10（版本）。使用Python（版本3.6.7），R（版本3.5.1）和EDGER（版本3.24.3）进行差异基因表达分析。Wilcoxon的签名秩检验（α设置为5％）和MATLAB（R2024A版本）用于分析体内电生理学数据。

　　当报告主要效果或互动时，应用了HOLM-šídák（用于正态分布的数据）或DUNN（对于非正态分布数据）事后分析。Spearman相关系数和线性回归用于测量两个变量之间线性关系的强度和方向。统计显着性用 *p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001表示。数据表示为平均值±S.E.M.用于参数测试，作为非参数测试的中位数，第25个百分位数和第75个百分点。

　　在至少两只小鼠的至少两个技术重复中复制了几个实验，并获得了相似的结果。例如，建立HFD小鼠模型（图1A – D），光遗传学（图2和4i）和NTS-OE（图5F-L和扩展数据图10E – K）。对于解剖实验，在显示代表性的示例的任何地方（图4G，K和扩展数据图1A – D，3A，B，N，N，Q – T，4A，B，6H，6H，7AA，7AA，8E，8E，F，I，I，J和9A，D），至少在每个小鼠的至少两种技术复制物中获得了相似的结果。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。