根据先前的实验模型和测定经验选择了小鼠实验中的样本量。没有样本或动物被排除在分析之外。将小鼠随机分配给每个实验组。在LV管理时，研究人员对新生儿ADA-SCID或OC小鼠蒙蔽了双眼。在所有其他实验环境中，研究人员均未蒙蔽。

　　质粒PCCLSIN.CPPT.PGK.GFP，PCCLSIN.CPPT.PGK.ADA，PCCLSIN.CPPT.PGK.TCIRG1和PCCLSIN.CPPT.PGK.PGK.FANCA先前先前被描述为14,19,29,29,30。质粒PCCLSIN.CPPT.ET.ADA.142T是通过标准克隆技术构建的，通过将人类固定cDNA7与人Ada cdna（SPEI – SPEI）交换到先前描述的PCCLSIN.CPPT.ET.COFIX.COFIX-R338L.142T（NHEI – SALI）之后。质粒PCCLSIN.CPPT.PGK.ADA.122T是通过标准克隆技术构建的，通过将miRNA-122靶序列插入pcclsin.cppt.pgk.ada质粒（sali – Scai）中。

　　通过磷酸钙瞬时转染到293T细胞中产生第三代自动化LV。如前所述7，用含有所选LV基因组转移质粒，包装质粒PMDLG-PRRE和PCMV.REV，PMD2.G和PADVATARY（PROMEGA）的溶液转染293T细胞。简而言之，转染后14-16小时更改培养基，并在培养基变化后30小时收集上清液。通过0.22μm过滤器（Millipore）对含LV的上清液进行灭菌，并根据制造指令进行了200次浓缩的四次，用Vivaflow 200切向上流量过滤盒100 kDa（Sartorius），根据制造说明，转移到无菌多合物管（Beckman）和Centrifuged的20，000分钟200分（bec）中，为120分钟（贝克曼）中的无菌性多合物管（Beckman），均为200分钟。超速离心）。将LV沉淀溶解在适当的PBS体积中，以允许500–1,000×浓度。

　　对于LV滴定，在聚甲烯存在的情况下，用串行LV稀释液转导1×105 293T细胞（8μgml -1）。对于PGK.GFP-LV，使用FACSCANTO分析仪（BD Biosciences）通过流式细胞仪分析了细胞，配备了Diva软件，转导后5-7天，传染性滴定和传染性滴定（以转换单位（TU）ML-1表示，使用公式tu ml-tu ml-1 =（tu ml-1 =（tu）ml-1 =（tu）ml-1 =（tu ml-1）。对于所有其他LV，根据制造商的说明，使用Maxwell 48细胞DNA纯化试剂盒（Promega）提取基因组DNA（GDNA）。通过DDPCR确定VCN，使用引物（HIV FW：5'TACTGACGCTCTCGCACC-3''; HIV REV：5'-TCTCGACGCAGGCAGACTCG-3'）从5-20 ng的模板GDNA开始确定。The amount of endogenous DNA was quantified by a primers–probe set designed against the human telomerase gene (Telo FW: 5′-GGCACACGTGGCTTTTCG-3′; Telo REV: 5′-GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA-3′; Telo probe: VIC 5′-TCAGGACGTCGAGTGGACACGGTG-3′tamra）或人类GAPDH基因（应用生物系统HS00483111_CM）。按照制造商的说明（Bio-Rad），使用每个引物（900 nm）（900 nm）和探针（250 nm; 500 nm）进行PCR反应，并使用QX200读取器读取并使用Quantasoft Software（Bio-Rad）进行分析。使用公式tu ml-1 =（VCN×100,000×（1/稀释因子）计算出感染性滴定。通过HIV-1 GAG P24抗原免疫刺激分析（Perkin Elmer）进行了lv prysterions的指示，通过HIV-1 GAG P24抗原免疫分析（Perkin Elmer）来测量LV物理颗粒。

　　对于小鼠实验，使用麦克斯韦48组织DNA纯化试剂盒（Promega）从整个肝脏中提取DNA，并使用Maxwell 48细胞DNA纯化试剂盒（Promega）或使用Maxwell 48全血DNA Purification kit（Promega）使用Maxwell 48细胞DNA纯化试剂盒（Promega）从胸腺，脾或BM中获得的细胞悬浮液提取DNA。根据细胞编号，使用Maxwell 48细胞DNA纯化试剂盒（Promega）从谱系阴性（LIN-）培养细胞中提取DNA，并根据细胞编号，使用快速提取物DNA（BioSearch Technologies）从单个挑选的菌落中提取。通过DDPCR确定小鼠DNA中的VCN，使用针对LVS的引物结合区域设计的引物 - 探针从5–20 ng的模板GDNA开始（请参阅“ LV滴定”部分）。在某些情况下，使用Ad Hoc DDPCR（QX200 Evagreen Digital PCR Supermix，Bio-Rad）确定VCN，该VCN有选择地放大了反向转录的矢量基因组（既集成和非整合），从而将其与可能的质粒污染物污染29（rt-lv; rt-lv;δu3fw;δ3FW：5'-TCACTCCCAACGAAGACAAGAGATC-3'，GAG REV：5'-GAGTCCTGCGTCGTCGAGAGAGAG-3'）。通过针对鼠标SEMA3A基因设计的引物 - 探针量定量内源性小鼠DNA的量（Sema3a FW：5'-AccgattCcagatGattGatggc-3'; Sema3a Rev：5'-TCCATATTAATTAATAATAATGCAGTGCTGCTTGCTGC-3'; sema3a; sema3a; sema3a; sema3a;BHQ1）。按照制造商的说明（Bio-Rad），使用每个引物（900 nm；对于RT-LV引物为150 nm）和探针（250 nm）进行PCR反应，并使用QX200读取器读取并用Quantasoft Software（Bio-Rad）进行分析。

　　根据制造商的说明，使用Maxwell 48 SimplyRNA血液提取试剂盒（Promega，AS1380）进行RNA提取，并使用Superscript IV IV Vilo Kit（11766050; Thermofisher Scientific）进行反转录。通过DDPCR评估LV基因表达，使用针对木质肝炎病毒设计的引物 - 探针从10-25 ng的模板cDNA开始，该疾病是在转录后调节元件（WPRE）LV基因组序列（WPRE）序列（WPRE FW：5'-GGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGTGGTGGCCACTGACACTGACACTGACACACAAT-3;5'-ACGTCCCGCGCGCAGAATC-3'；HPRT用作小鼠样品的参考基因（DMMUCPE5095493，Bio-Rad）。按照制造商的说明（Bio-Rad）对每个引物（900 nm）和探针（250 nm）进行PCR反应，并使用QX200读取器读取并使用Quantasoft软件（Bio-Rad）进行分析。

　　293T细胞系列在ISCOVE修改的Dulbecco培养基中（IMDM，Sigma），并补充了10％胎牛血清（FBS；胎儿Clclclone II，Hyclone，Euroclone），4 mM谷氨酰胺（LONZA），100个国际单位（IU）ML -1 Penicicillin和staltza（lonepsycin）（lonza）（LONZA）。Primary mouse Lin− cells were FACS-sorted from cell suspensions obtained from the BM or the liver of LV-treated mice and cultured in StemSpan supplemented with 10% FBS, 4 mM glu​​tamine, 100 IU ml−1 penicillin and streptomycin, 100 ng ml−1 mouse stem-cell factor (mSCF, Peprotech), 50 ng ml−1 mouse thrombopoietin（MTPO，peprotech），100 ng ml-1小鼠FMS类样酪氨酸激酶3配体（MFLT3L，Peprotech）和20 ng ML-1小鼠介绍物三（MIL-3，Peprotech）24小时。然后将培养基与补充10％FBS，100 IU ML -1青霉素和链霉素，100 ng ML -1 MSCF（PEPROTECH）和MFLT3L 100 ng ml -1（peprotech）交换48小时。最后，使用配备Diva软件的FACSCANTO分析仪（BD Biosciences）确定GFP表达。将一些排序的LIN-细胞（每盘800个细胞）中的经典甲糖岩（Steamcell Technologies）铺，并补充了100 ng ML-1 MSCF（Peprotech），50 ng ml-1 mtpo（peprotech），100 ng ml-1 mltpo（peprotech），100 ng ml-1 ml-1 ml-1 ml-1 mflt3l（peprotech）和20 ng ml-3（pep）和20 ng ml-3（Pep）（Pep）（Pep）。所有细胞在37°C的5％二氧化碳加湿气氛中保持。通常对细胞系进行支原体污染测试。

　　创始人FVB，129-Adatm1MW TG（PLADA）4118RKMB/J小鼠（称为ADA-SCID小鼠），从Jackson Laboratory31（库存003265）获得。创始人B6C3FE A/A-TCIRG1OC/J小鼠（称为OC小鼠）是从Jackson Laboratory16（库存00230）获得的，并在C57BL/6背景上完全反向交叉。H. J. van de Vrugt（自由大学医学中心）提供了在FANCA GENE32中具有靶向破坏的创始人小鼠，并用FVB小鼠进行了反向，以获得FANCA - / - FVB菌株（称为Fanca - / - 小鼠）。C57BL/6和NSG小鼠购自查尔斯河实验室。所有小鼠均维持在没有特定的病因条件下。根据杰克逊实验室网站上可用的协议，在2-3周龄进行了ADA-SCID和OC小鼠的基因分型。通过尾静脉注射（每只鼠标30 µL）在成年雌性C57BL/6或NSG（7-10周龄）小鼠中进行载体（7-10周龄）小鼠，新生儿（每只鼠标30 µL）和2周大的小鼠在2周大的小鼠中通过retro-Orbital注入（100-150 µL）。使用毛细管从恢复的轨道丛中浸出小鼠，并在0.38％柠檬酸钠缓冲液，pH 7.4或EDTA涂层的管中收集血液（微螺栓20.1341）。For transplantation experiments, 7-week-old female C57BL/6 recipient mice were conditioned with a lethal regimen of busulfan (6 mg ml−1), consisting of four daily intraperitoneal (i.p.) administrations of 27 µg g−1 of busulfan (prediluted 1:2 in 0.9% NaCl injectable solution).移植是由i.v.进行的注入总BM细胞或总CD45+细胞FACS分类（BD Facsaria Fusion Cell Sorter，BD Biosciences或Moflo Astrios EQ Cell Sorter，Beckman Coulter） 在最后一剂量的Busulfan剂量后的第二天，从肝脏或供体小鼠的BM出发。将细胞重悬于200 µL PBS中。移植细胞的类型和数量在实验方案中指示。每天在Busulfan给药期间，每天监测受体小鼠的体重，在移植后每周进行1个月。如果在NSG小鼠中进行了移植实验，则通过对受体小鼠（200 RAD）和辐照后3-4小时的受体小鼠（200 RAD）和移植进行调理。对于在Fanca - / - 小鼠中的移植实验，通过对受体小鼠的致命照射，使用两剂4.5 Gy 24小时进行调理。调节后总共3-4小时，通过静脉注射，来自LV处理或未处理的Fanca - / - 小鼠的4–5×106 BM细胞被静脉注射。在受体小鼠的尾静脉中注射。通过给予五个腹膜内，在2周大的或成年小鼠中进行HSPC动员。每只鼠标的剂量为250 ng g-1 g-csf，相距12小时。然后，在最后剂量的G-CSF剂量后8小时，每只小鼠给予2 µg g-1 plerixafor。动员小鼠。静脉注射LV。plerixafor后2小时，同时，从BM，PB或脾脏收集造血细胞进行FACS分析。遵循2周大或成年小鼠使用的相同方案的新生小鼠在新生小鼠中进行了HSPC动员，除了降低的G-CSF方案由三种而不是五剂组成。抗IFNα受体阻滞抗体（MAR-1，Invivomab，MAR1-5A3）或IgG对照（Invivomab，小鼠IgG1同种型对照，MOPC-21）施用。在50 mg kg -1剂量给药前3小时给新生小鼠。i.p.在粉刺 - / - 小鼠中诱导BM衰竭。在LV注入后6周后，给予两剂两剂量的丝裂霉素C（Milliporesigma）的0.3 mg -kg -1，间隔7天。在预定时间通过二氧化碳吸入对小鼠进行安乐死。根据欧洲和西班牙法规进行了范卡 - / - 小鼠的实验程序 （欧洲公约ETS 123，关于用于实验和其他科学用途中使用的脊椎动物哺乳动物的使用和保护，2010/63/UE指令，西班牙法律6/2013和Real Decreto（R.D.）53/2013关于在科学研究中保护和使用动物）。所有动物程序均根据机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

　　在随后的步骤下，将小鼠肝脏通过下腔静脉灌注（15 mL min -1），以下12.5 mL以下溶液：（1）PBS EDTA（0.5 mM）；（2）HBSS（GIBCO）和HEPES（10毫米）；（3）含有0.03％胶原酶IV（Sigma）的HBSS和HEPE。收集消化的小鼠肝组织，通过100μm细胞过滤器（BD生物科学），并加工成单细胞悬浮液。随后将这种悬浮液在室温下离心3次（30克，25G和20克，持续3分钟），以去除含有肝细胞的颗粒。将含有非核细胞的上清液离心（在室温下为650g，7分钟），并随后将回收的细胞与“流式细胞仪”部分中指示的单克隆抗体一起孵育。为了获得脾或胸腺的单细胞悬浮液，使用PBS – 2％FBS（胎儿Clone II，Hyclone，Euroclone）在40 µm滤清器上粉碎器官，红细胞（RBC）用0.5或1 ml的ACK裂解液（GIBCO）裂解5或10分钟。通过添加10毫升PBS -2％FBS来停止裂解。然后通过40 µM过滤器过滤细胞悬浮液，并计数细胞进行GDNA提取或流动性分析（请参阅“流式细胞仪”部分）。根据需要将BM细胞从胫骨和股骨中冲洗，或者在新生儿或OC小鼠的情况下被骨头碎裂提取，然后按照从脾脏分离的细胞进行处理。

　　使用配备有Diva软件的FACSCANTO Analyzer（BD Biosciences）进行了使用BM，脾，胸腺，PB或肝脏获得的细胞悬浮液的流动性分析。Between 500,000 and 1,000,000 cells were processed, washed with PBS–2% FBS (FetalClone II, HyClone, Euroclone) or MACS buffer (PBS pH 7.2, 0.5% bovine serum albumin (BSA), 2 mM EDTA), treated with fragment crystallizable (Fc) Receptor-Block (Miltenyi Biotec) when antibody-stained and then resuspended in the buffer used洗涤。在Macs缓冲液中进行染色，并在黑暗中在4°C下与抗体（补充表15中指示的比例）一起孵育20分钟。在分析之前，将3 µL的7-AAD（Biolegend 420404）添加到每个管中以排除死细胞。彩虹珠（BD生物科学）用于校准仪器探测器。补充图2中提供了门控策略。1–4。配备DIVA软件（BD Biosciences）或配备台峰软件（Beckman Coulter）的BD FACSARIA FUSION融合细胞分选仪（BD Biosciences）或配备了Diva软件（BD Biosciences）或Moflo Altrios EQ细胞分系器（Beckman Coulter）的BD Facsaria Fusion融合池（BD Biosciences）。

　　对于从图1B – I和扩展数据所示的不同年龄和小鼠样品的健康参与者收集的PB样品，图1A – D进行了样品，使用两个标准化的多参数流仪测定法分析了样品21,33（通过全血解剖）。简而言之，在用ACK裂解缓冲液（干细胞技术）裂解后，将样品标记为补充表16中报道的荧光抗体。进行了滴定分析以评估最佳抗体浓度。将小鼠的样品与大鼠抗小鼠FCR阻塞试剂（BD，稀释1：100）预孵育。表面标记后，将细胞与碘化丙啶（PI; Biolegend）孵育以染色死细胞。通过在染色程序之前向PB样品添加精度计数珠（Biolegend）来进行绝对细胞定量。用彩虹珠（Spherotech）校准后，通过BD交响曲A5（BD Bioscience）细胞荧光计获得所有染色样品的图像，并使用Diva软件（BD Biosciences）收集原始数据。随后使用FlowJo软件v.10.5.3（BD Biosciences）分析数据。补充表16报道了用于小鼠或人类全血滴板的抗体列表。

　　使用IRCCS Ospedale San Raffaele的伦理委员会批准的方案（儿科和成人参与者的Protoction_tiget09）批准，收集了小儿和成人健康捐助者的PB样本并在提供书面知情同意后进行分析。儿科参与者的书面同意书由父母提供。

　　用含有0.5 mM EDTA的PBS灌注小鼠，以去除血液，然后收集器官并将其固定在锌 - 纤维素中至少24小时。在圣拉菲尔医院（意大利）的Centro di成像设施中进行了嵌入，切片，幻灯片准备，染色和图像采集。在组织学或免疫组织化学染色之前，将福尔马林固定的，石蜡包裹的连续切片（4 µM）脱水并通过分级的酒精系列进行脱水。使用自动Leica Bond RX系统（Leica Microsystems）进行免疫染色。首先将组织脱蜡，并使用表位检索溶液1（ER1柠檬酸盐缓冲液）进行表位检索。将载玻片与抗GFP抗体（Invitrogen，A11122，1：1,000）或抗KI-67原代抗体（D3B5，细胞信号技术，1：200）一起孵育30分钟，然后在室温下进行30分钟，然后使用债券聚合物改进的Kit（Leica，DS9800）检测。使用Aperio AT2数字扫描仪以20倍放大倍率（Leica Biosystems）获取染色载玻片的图像，并使用ImageScope软件（Leica Biosystems）进行分析。

　　如前所述34，通过超声连接器介导（SLIM）-PCR检索积分位点，并进行了较小的修改。简而言之，对于每个样品，使用Covaris E220超声量使用DNA剪切处理了高达300 ng的GDNA，生成平均大小为1,000 bp的片段。将碎片的DNA进行末端修复和3'腺苷酸化，然后与包含用于样品识别的八核苷酸序列条形码和读取2个配对末端测序所需的所有序列的接头盒接触。连接产物分为三个技术重复，并使用针对LV LTR和linker Cassette的引物进行了35个循环的指数PCR。随后使用特定于接头盒和LTR的引物进行了另外十个PCR周期的扩增。这些引物包含用于样品识别的8-核苷酸条形码（与接头盒上的条形码结合）和读取1个测序所需的序列，再加上一个随机的12-核苷酸序列，从而在下一代测序系统上可以在第一个测序周期中在第一个测序周期中易于群集群识别。因此，生成的Slim-PCR产品与独特的条形码相关，并组装到库中并进行Illumina下一代测序。

　　使用自定义的生物信息学管道35（Vispa2）处理测序读数，该管道分离了载体LTR的基因组序列并将其映射到小鼠基因组（MM9）。由于在不同细胞中相同基因组位置中的矢量积分是非常低的概率事件，因此在技术过程中可能发生的独立样品中相同的集成位点被认为是污染或扩增的伪像。对每个主要鼠标的潜在污染和假阳性以及从无关的二次小鼠得出的积分位点的污染和误报进行了修剪。通过在至少两个细长的技术重复和序列计数中识别插入位点，通过识别插入位点来重新分配属于不同实验组的小鼠之间共享的相同的集成位点。使用Isanalytics36进行了对矢量整合位点的下游分析，例如相对丰度，共享和CIS分析。克隆丰度估计为基因组数的相对百分比，由R套件Soniclength37确定。使用Grubbs测试对异常值进行计算常见的插入位点38。

　　在实验设计方案中指示的时间点，使用Procyte DX分析仪（IDEXX）对PB进行了he症计算分析。将大约30 µL的Pb收集到EDTA包被的管（微阀20.1341）中并进行分析。测得的参数为：血红蛋白，总RBC计数，差异计数（淋巴细胞，单核细胞和中性粒细胞（绝对计数和百分比）），血小板计数和总白细胞计数（白血细胞）。

　　如前所述，在血浆或PB的细胞分数中测量了ADA活性。简而言之，将20μl包装的RBC裂解在20μl裂解缓冲液中（0.25 mol L -1 HEPES，0.025 mol L -1 CHAPS和0.025 mol L -1二硫代醇）。将细胞裂解物以12,000克离心5分钟。通过添加10μl裂解的RBC上清液或20μL血浆，在含有50 mmol L -1 Tris（pH 7.2）和0.4 mmol L -1腺苷的混合物中评估了酶活性。通过添加PCA（最终浓度为0.21 mmol L -1）并用KOH（最终浓度为0.22 mmol L -1）来停止反应。使用等分试样在两个时间点使用等分试样，在肌苷加上肌苷加上低黄嘌呤形成后，细胞分数为0和10分钟，在等离子体的0和30分钟时，在0和10分钟内使用Bread Biotocus 3000仪器（Bio-Rad）分析了反应进程。将酶活性测量为MOL H -1每1（ML填充的RBC或ML等离子体）。

　　如前所述40，将破骨细胞与BM细胞区分开，并在牙本质载玻片上进行吸收功能（AE8050）。如前所述40，将牙本质盘用甲苯胺蓝色染色。根据制造商的方案，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA； Crosslaps，AC-07F1，AC-07F1，AC-07F1，AC-07F1）来测量释放的CTX的浓度。遵循制造商的方案，通过ELISA（Microvue小鼠甲状旁腺激素1-84 EIA）测量了LV处理的OC或WT小鼠血清中甲状旁腺激素的浓度。

　　对于微型计算的断层扫描分析，解剖了OC小鼠及其WT同窝仔的椎骨柱，从结缔组织清洗，并固定在4％的多聚甲醛中。使用0.25毫米铝制过滤器，使用Skyscan 1276（Bruker）在55 kV和72 µA下以7 µm的名义图像分辨率扫描骨骼。用2×2的摄像头套筒旋转到360°，每0.4°捕获图像每0.4°捕获。使用InstareCon重建引擎，RING ARTEFACT降低和光束硬化校正使用Skyscan NRECON 2.0.0.5软件进行重建。使用CT Analyzer软件（CTAN 1.18.8.0+）进行L5椎骨的图像分析。使用内部开发的半自动方法来分割冠状平面中椎体的小梁区域。通过针对含有0.25和0.75 g cm-3 caha（Skyscan）的2毫米幻影杆对选定区域的平均衰减系数进行校准，计算小梁区域的骨矿物质密度。小梁区域通过自适应阈值算法对小梁区域进行了三维形态分析。评估了骨体积与总体积（％）与小梁分离（MM）之间的比率。

　　统计分析是在与生物医学科学统计中心（CUSSB）咨询专业统计学家咨询后进行的。当未达到正态性假设时，进行非参数统计检验。进行了两尾的Mann-Whitney U检验，以比较两个独立组，对于两个以上的独立组，使用了Kruskal-Wallis测试，然后进行了事后分析（Dunn对参考对照组进行多次比较以及Bonferroni的校正）。对于配对的观测值，进行了Wilcoxon匹配的测试。使用GraphPad（V.10）分析数据。为了模拟生物过程的动力学，正确考虑了由重复测量设计引起的依赖项的正确考虑，估算了LME模型，为实验单元或会话指定了随机效应项。为了实现基本模型假设，考虑了结果变量的各种转换，包括对数，平方/立方根和有序的分位数归一化。估计LME模型后，进行了事后分析，从而使治疗组的成对比较在固定时间点。为了解决多重性问题，使用Bonferroni的方法调整了P值。使用R软件（v.4.3.1）估算LME。在所有分析中，显着性阈值设置为0.05。推论技术用于适当的样本量（n≥5），否则仅报告了描述性统计。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。