每周一次有机牛肝喂养有机牛肉。随机选择用于实验的所有动物。对于RNAi，使用了S2F10菌株大约2周大的孵化条。通过将1 µg双链RNA与10 µL肝粘贴混合15 µg，制备RNAi食物。为了检查RNAi表型，当动物自由游泳时，用立体显微镜（Zeiss）拍摄照片。在双盲实验设计中，通过多个研究人员用ImageJ软件测量了蠕虫或Bursa运河的长度。Bursa运河与整个蠕虫的比率用于减轻蠕虫大小的潜在变化以及其软体柔软的宽松程度。

　　通过截肢和再生在实验室中维持的一条克隆线S2的多个动物中收集染色体。根据先前开发的方案在无核酸酶的膜载玻片（Zeiss）上制备染色体扩散，除了在最后一步中，将组织分离为单个核，并放在玻片上而不用盖覆盖物与Coverslip42挤压。在×40镜头下鉴定出单个染色体，并通过棕榈微光激光微解剖（Zeiss）收集到单个PCR管的盖中。用桌面离心机在4 µL PBS中旋转收集的染色体，并用Repli-G单细胞试剂盒（QIAGEN）放大颗粒中的DNA，以在Miseq或Hiseq 3000测序系统（Illumina）上进行测序。

　　使用酶DPNII从S2菌株的多个动物制备HI-C测序文库。将测序的读取与BWA MEM（版本0.7.17）43对齐DD_SMES_G4.FASTA26。用JuiceBox_scripts（阶段基因组学）从SALSA3输出final.FASTA中制备一个组装文件。.HIC文件是由三维de Novo Assembly的Run-emembly-Visualizer.sh制备的44。将两个文件加载到JuiceBox4中，以使用拆分，合并，顺序和东方命令以及染色体组装进行脚手架操纵。用JuiceBox_Assembly_converter.py将修改的汇编文件（染色体规模）转换为FastA（SMED_CHR_REF_V1）。

　　使用Perximos Animal Kit 3.0版生成HI-C库。将大约四个蠕虫切碎，然后在室温下交联20分钟，并在1 mL Proximo交联溶液中终端混合。在室温下，用淬火溶液终止交联反应15分钟，再次与终端混合在一起。用1x染色质冲洗缓冲液（CRB）将淬灭的组织冲洗一次，转移到液氮冷却的砂浆中，然后将其接地到细粉末。将粉末重悬于700 µL Proximo裂解缓冲液1中，并用玻璃珠在涡旋搅拌机上用玻璃珠裂解20分钟。低速自旋用于清除大碎片，并将含染色质的上清液转移到新管中。在更高速度的第二次旋转后，除去上清液，并用1×CrB洗涤含有裂解物的核分裂的沉淀物。去除1×CRB洗涤后，将沉淀重悬于100 µL Proximo裂解缓冲液2中，并在65°C下孵育15分钟。在室温下，染色质与恢复珠结合了10分钟。将珠子放在磁台上，并用200 µL的1×CRB洗涤。

　　将结合在珠子上的染色质重悬于150 µL的proximo碎片缓冲液中，并加入2.5 µl的proximo片段化酶。将反应在37°C下孵育1小时，冷却至12°C，然后与2.5 µL的固定酶孵育30分钟。添加6 µL的停止溶液后，将珠子用1×CRB洗涤，并将其重悬于100 µL的proximo连接缓冲液中，并补充了5 µL接近连接酶。将接近连接反应在室温下孵育4小时，终端混合。为此，加入了5 µL反向交联酶，并将反应在65°C下孵育1小时。

　　逆转交联后，用恢复珠纯化了自由DNA，并且HI-C连接与链霉亲和蛋白珠绑定并洗涤以去除未结合的DNA。洗涤后的珠子用于使用Proximo库制备试剂制备配对的深度测序库。

　　精子细胞从性成熟的S2菌株中释放到无钙和无镁的缓冲液（1％BSA）中。将细胞解离溶液放置在载玻片上，并在相对比显微镜下检查以鉴定单个精子细胞。卵母细胞从卵胶囊中释放出来。将单个精子细胞或卵母细胞转移到单个PCR管中，以使用Repli-G单细胞试剂盒（QIAGEN）扩增。在HISEQ 3000或NOVASEQ S2测序系统（Illumina）上制备RadSeq库和全基因组库。如链接图部分中所述分析了RadSeq测序数据。如重组部分所述，分析了全基因组测序数据。

　　对于候选基因，从Schmidtea标本获得了感兴趣的基因的蛋白质序列。使用蛋白质与核苷酸BLAST（TBLASTN）工具对该基因对齐与Mansoni Genomes39。为了系统地检查整个基因组的同步，我们使用了Sonicparanoid（1.3.8）45来识别S. Mediterranea和S. Mansoni之间的一对一蛋白质直系同源物。S. Mansoni基因组组装（V9）及其蛋白质注释可在https://zenodo.org/record/5149023#.ybk9jn3mk3i上获得。

　　J/J线D5越过J/V线S2F8B，以建造93只动物的F2人群。使用Easy-DNA GDNA纯化试剂盒（K180001，Thermofisher）从每只动物的碎片中提取基因组DNA。根据Adapterama III31的程序制备了RadSeq的测序文库，并进行了一些修改。使用堆栈（版本2.41）46,47鉴定遗传变异。用VCFTools（版本0.1.14）48过滤所有变体，以删除插入和删除，并选择双重SNV。由于它们可能与重复元素相对应，因此位于200 bp以内的标记簇被删除。不服从孟德尔隔离的标记也被删除。只使用了父母纯合的标记。链接图是使用R/QTL49构建的。

　　从S2及其卵母细胞和精子细胞的测序读数与BWA MEM（版本0.7.17）对齐与SMED_CHR_REF_V1对齐。通过使用基因组分析工具包（GATK，4.1.4.1版）与GenoMICSDB和GenotypeGVCFS50共同调用遗传变异。通过去除异常标记，包括配子中没有两个等位基因的那些，S2中的双质杂合标记进一步过滤，包括在配子中的两个等位基因，紧邻标记的标记簇（<200 bp apart) and markers of heterozygosity in sperm cells. The J and V haplotypes were manually phased for oocytes without recombination and were phased by MPR.genotyping51 for all gametes. The MPR.genotyping package was also used to impute or correct missing or erroneous genotypes. The final genotype bins were used to identify and visualize recombination with customized R code. Quantification of recombination was focused on crossovers between long tracks of haplotypes along a chromosome. Putative gene conversion events such as short tracks of haplotype switches encompassing <1% of the chromosome length were not included.

　　To examine the gene content on chromosome 1, transcriptome data were downloaded from the NCBI Sequence Read Archive (SRA). To examine genes related to sexual development, transcriptomes from sexual adults9,12,52, sexual juveniles9 and sexual adults with nhr-1 RNAi9 were used. To examine stem cell-enriched genes, transcriptomes from sorted X1 cells and CIW4 were used53,54.

　　All sequencing data were aligned to dd_Smed_v6 (ref. 27) with bwa mem (version 0.7.17). Differential gene expression was analysed with DESeq2 (version 1.26.0)55. expression was quantified at the transcript level with kallisto (version 0.44.0)56 and was imported and summarized to gene-level count matrices by tximport57.

　　To examine the haplotype-specific expression of critical regulators of the reproductive system, mRNA was extracted from six sexually mature animals of the S2 J/V line and was analysed as three biological replicates, with two animals pooled into each replicate. Nine penis papillae were dissected from nine sexual adult animals of the same line and were analysed as three biological replicates, with penis papillae from three animals pooled into each replicate. All mRNA samples were extracted on the same day and were processed at the same time for library preparation and sequencing to minimize technical variation. Libraries for RNA-seq were prepared with a Clontech SMARTer Stranded Total RNA-seq (Pico) Kit. The workflow consisted of converting total RNA to cDNA and then adding adaptors for Illumina sequencing through PCR. The PCR products were purified, and ribosomal DNA was depleted. The cDNA fragments were further amplified with primers universal to all libraries. Lastly, the PCR products were purified again to yield the final cDNA library. Different adaptors were used to multiplex samples in one lane. Sequencing was performed on an Illumina NovaSeq 6000 with a 150-bp paired-end-read run. Data quality checks were conducted using the Illumina Sequencing Analysis Viewer. Demultiplexing was performed using Illumina Bcl2fastq2 version 2.17.

　　All sequencing data were aligned to dd_Smed_v6 (ref. 27) with bwa mem (version 0.7.17). To ensure accuracy, haplotype-specific expression of the 14 genes of interest was manually examined using the Integrative Genomics Viewer. J or V allele counts were identified for each biallelic variant in the exons. For a particular gene, the allele counts were aggregated from all variants on all exons for the J and V haplotypes. The allele counts were then subjected to binomial testing and Bonferroni correction58 to determine whether the observed allele bias was statistically significant. P >Bonferroni校正后的1设置为1。

　　所有数据集均通过堆栈版本2.52中实现的从头管道运行（参考文献46,47）。首先，对配对末端的读取并使用Process_radtags进行了反复式读取并过滤质量，并将其截断至135 bp。丢弃了PHRED分数低于30或未获得的基础的个人读数（96.9％的读数通过了质量过滤器）。根据参考指南确定最佳参数。59通过运行从头管道的多次迭代，并在每个新迭代中在同一人群[SIC_MAR]的13个样本的子集中使用一个参数变化，遵循建议60。我们将最小堆栈深度（-m）在1到6（M1-M6）之间变化，堆栈（-m）之间允许的不匹配数量（-m）在1到10（M1-m10）之间，以及允许合并目录Catalog loci（-n）的不匹配数量，同时保持所有其他参数（M3，M2，M2，M2和N0）。然后，我们使用样本表示截止的样本表示为80％（R80），并在每种新迭代中比较了样本表示的临界值（R80）的样本表示临界值，并比较了样本表示的数量。一旦优化-m和-m，我们通过评估n = m - 1，n = m和n = m+1的多态性基因座数量的变化来评估-n，然后使用denovo_map.pl包装器组装RAD基因座，并设置了以下参数：M = 3，m = 3，m = 3，m = 2和n = 3。

　　在75％的所有个体中存在的组装基因座被饲养，将次要等位基因频率（MAF）0.04（-min-MAF）的滤波器（MAF）过滤器来滤除可以掩盖种群结构的单胎SNP和最大观察到的杂合性（-max-obs-het）0.99的滤波器，用于消除潜在的潜在的Paralogous locii locii locii locii locii locii ipii i。此外，为了构建系统发育树，我们在过滤后串联了所有radseq基因座（-phylip-var-all）。系统发育树是使用RAXML-NG版本0.9.0（参考文献62）建造的，从随机种子开始，并应用GTR+G替代模型和1,000个自举重复。来自Menorca（SME7-5_MEN）的样本用作植根于树的外组。

　　为了进行此分析，我们排除了群体序列，并运行了种群，以保留所有人群中存在的基因座（-p 10）和每个人群中存在的75％的人（-r 0.75）。根据通过我们的过滤标准的基因座，生成了1,000个基因座的随机白名单，并再次贯穿具有相同标准的种群，但在每个基因座（-write-single-single-snp）保留第一个SNP。输出以结构格式导出，结构版本2.3.4（参考文献63）被用来以10,000链为燃烧和100,000 MCMC链的种群结构，k = [1-11]，具有20次迭代。通过结构Harvester64运行所得的文件，并确定最佳K65。

　　对于卵母细胞染色体上的端粒鱼类，如前所述6,67。杂交是用染色体扩散42进行的，只是将卵巢悬挂在洗涤缓冲液或杂交缓冲液中。在杂交之前，在室温下，用消化缓冲液（0.1％SD和10 µg ml-1蛋白酶K（Qiagen）在0.3％Triton X-100中用消化缓冲液处理10分钟。该重复位于图2C中的中心粒附近具有以下序列：TCTGGACGGAAATTTTTTAATCTTTATAGGCTTGTATCTCTGTCAATTTTTATTTGTTTTCATAATCTTTGATATATTTCTCGATAACTTTTGATTCTCTACATGATAGCATTTTAAAAATTGCAAAAATCATAACGGGCTCGTCAAACACAAGTCAT.

　　为了检查基因GLP和SMEDWI-1的组织表达，我们使用了探针和缓冲液进行从分子仪器购买的第三代ISH链反应。用7.5％N-乙酰基 - 半胱氨酸（Sigma-Aldrich）对性成熟的平面人进行治疗10分钟，然后将其固定在4％多聚甲醛（电子显微镜科学； 16％溶液在PBS中稀释1：4），持续20分钟20分钟。将交配设备解剖为1.5 ml RNase的管。其余的过程遵循杂交链反应反应RNA FISH的分子仪器，用于全置小鼠胚胎。

　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。